Đề tài liệu pháp gen và ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh

TIỂU LUẬN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ DI TRUYỀN HỌC

ĐÈ TÀI: LIỆU PHÁP GEN VÀ ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP
GEN TRONG CHỬA BỆNH
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU NỘI DUNG
A. LIỆU PHÁP GEN
I. Khái niệm
1. Liệu pháp gen
2. Gen liệu pháp
II. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen
III. Phân loại liệu pháp gen
IV. Kỹ thuật cơ bản
1. Cơ sở của liệu pháp gen
2. Các buớc cơ bản trong liệu pháp gen
3. Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp
V.

Nguyên lý của liệu pháp gen
1. Tách dòng gen liệu pháp
2. Các loại vecto thuờng đuợc sử dụng trong liệu pháp gen B. ứng dụng liệu pháp gen trong

chữa bệnh
I. Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen
II. Một số xu huớng chữa bệnh bằng liệu pháp gen
III. ứng dụng liệu pháp gen trong việc chữa bệnh HIV/AIDS
IV. Vấn đề an toàn và triển vọng của liệu pháp gen
c. Kết luận Tài liệu tham khảo.


NỘI DUNG

A. LIỆU PHÁP GEN
I. Khái niêm
1. Liệu pháp gen
Liệu pháp gen (gene therapy) là kỹ thuật đua gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đua gen cần thiết
nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt đuợc mục tiêu của liệu pháp.
- Biện pháp thứ nhất, đua gen lành vào thay thế cho gen bệnh là cách giải quyết triệt để, vì gen lành sẽ đuợc
đua vào đúng vị hí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thuờng của các trình tự biếu hiện gen đó.
Viral

Nevv

ViNl

PHA

Gen<

PHA

u.s. National
# Mođitieđ DNAmjected into vectoí^^

1

Vector txnđa
cell membrane

to

đưa vào tế bào

bản sao của gene khỏe
mạnh

Vector IS packaged in
ve&tcie
Vestcle
Dreaks
down
releaeing
vector

Gene therapy using
an adenovirus vector


- Biện pháp thứ hai, đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen sai hỏng dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một
gen cần thiết vào bộ gen, người ta khơng làm chủ được vị hí gắn xen của đoạn mới đưa vào. Điều này dẫn
đến một số kết quả không lường hước được:
■ Gen mới đưa vào khơng nằm trong phức họp điều hồ nên có thế được biểu hịên một cách tuỳ tiện,
không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát
triển cá thế), hoặc thậm chí khơng được biếu hiện.
■ Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.
■ Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hố một gen tiền ung thư dẫn dến sự biểu hiện quá độ của
gen này gây ra ung thư.
2. Gen liệu pháp
■ Gen liệu pháp (Therapeutic gene) là các gen có chức năng sử dụng vào điều trị bệnh cho con người.
■ Mỗi loại gen liệu pháp có những đặc điếm và chức năng khác nhau. Gen liệu pháp có thể là:
■ Gen lành (các gen hoạt động bình thường) được đưa vào tế bào sống đế thay thế các gen hỏng,
gen mất chức năng

■ Những gen có khả năng mã hóa 1 protein đặc hiệu, khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các
loại protein đặc hiệu. Các protein đặc hiệu có thế ức chế hoạt động của 1 gen khác trong tế bào,
kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.
■ Gen ức chế các gen gây bệnh, gen kìm hãm hoặc các gen phục hồi Các đoạn oligonucleotide có
tác dụng kiềm hãm sự hoạt động các gen bị đột
biến trong tế bào.

II. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen
■ Theo dõi và hiểu biết cặn kẽ quá hình, cơ chế phát sinh bệnh, đặc tính di huyền của bệnh
■ Nắm vững cấu trúc và chức năng của gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến, ... và cấu trúc, chức năng của
gen liệu pháp.
■ Dự đoán hiệu quả của liệu pháp. Neu hiệu quả cao mới áp dụng
■ Thử nghiệm nhiều lần với động vật, khi đạt hiệu quả cao mới áp dụng cho con nguời.


III.

Phân loại liệu pháp gen

2 nhóm phuơng pháp cơ bản:
■ Liệu pháp gen soma (Somatic Gen Therapy - SGT): là phuơng pháp điều trị, thay thế hay sửa chữa các
gen hỏng, gen bệnh của các tế bào soma trong cơ thể. SGT liên quan đến sự biểu hiện gen bên trong
những tế bào sẽ đuợc uốn nắn ở bệnh nhân nhung không di truyền cho thế hệ sau. Te bào dùng chữa trị
có thể là tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt là dùng tế bào gốc. Đây là loại hình GT đang đuợc nghiên
cứu tại "Viện Liệu pháp Gen nguời" cũng nhu tại nhiều phịng thí nghiệm khác trên thế giới.
■ Liệu pháp gen tế bào mầm (Germline Gen Therapy - GGT): điều trị, sửa chữa, thay thế gen hỏng cho
các giao tử nhằm tạo ra thế hệ sau bình thuờng. GGT liên quan đến cải biến gen của những tế bào mầm
mà những tế bào này truyền đạt những sự thay đổi đó cho thế hệ sau. Hãy cịn ít cơng trình nghiên cứu
về sự can thiệp vào dịng mầm vì lý do kỹ thuật và đạo đức.

IV.

Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen

1. Cơ sở của liệu pháp gen
- Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau: ■ Chuyển trực tiếp gen vào
mô người bệnh.

Strategies for Delivering Therapeutic Transgenes into Patients

Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo).
En*»nc«r-oronx*«*
Reportcr geno

2 Transgene
.. _

a Transtction

f4

r ^ môectcr r

l

<
s"' *

RNA

*

*

i

ã

**

0\

>
>

Ervâ

Êã2

Reverse

Iraoscnptase

Packagiog

vtral RNA RNA-ONA
hytXKj Douoie

straned DNA

ce
T

Reporter proteôn
Target
c'

HIV based gene therapy vector

, Traơsie&on

4-------Cyiopíaam Nuceus

Integrator

6*
II

DNA


Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm” thông tin di truyền của chúng
vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng.
Tuy nhiên, có thể xố hay làm mất các phần có hại của virus, ngăn khơng cho chúng tái bản trong tế
bào chủ. Ngày nay các virus khơng có khả năng tái bản này đuợc sử dụng chung cho các nghiên cứu
liệu pháp gen trên nguời và động vật.
■ Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài nguời bệnh, sau đó chuyển các tế bào
đã đuợc biến đổi này vào nguời bệnh (ex vi vo). Phuơng pháp này đuợc sử dụng chung để phân phối các
nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể. Chúng cũng đuợc sử dụng để tạo ra

các dịng tế bào đã bị biến đổi hồn tồn cho cấy ghép. Giống nhu trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào
đuợc chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sung tấy hay đáp ứng miễn dịch.

Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
■ Chuyển gen với sự hoà nhập (gen đuợc kết họp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
■ Chuyển gen khơng hồ nhập (gen khơng kết họp chặt chẽ với DNA của vật chủ)
■ Sử dụng các oligonucleotide tổng họp nhân tạo gọi là các phân tử ribozyme/antisense khơng có các thành phần
điều hồ (sự biếu hiện gen đã bị biến đổi).
Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:


■ Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích họp với những trình tự điều hồ thích họp (trình tự khởi động),
trình tự khởi động có thế là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong
các mô mà thông thuờng chúng đuợc biếu hiện.
■ Lần luợt, các gen có thể đuợc kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hố trong tất cả các mơ (phuơng pháp
chung nhất đuợc sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối với các hình tự có thể hoạt hố hay bất hoạt nhu một
công tắc. Những thao tác nhu vậy có thể đạt đuợc bằng cơng nghệ DNA tái tổ họp.
■ Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này đế có thế tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản
đuợc sử dụng để làm điều này:
s DNA có thể đuợc gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô.
Gọi là chuyến DNA trần (nacked DNA transfer)
■S DNA có thể đuợc sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral transfer shuttle). Đây là phuơng
pháp chuyến DNA hầu nhu chắc chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể
xun qua lóp màng lipit kép, nhung vector virus dễ dàng làm việc này.
•S DNA cũng có thể phối họp với các phức hệ hố học khác nhau để khuếch đại khả năng chuyển dịch
qua màng tế bào của nó.
■ Thứ ba, có hai phuơng pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh
nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi nguời bệnh (nhu tế bào tuỷ xuơng) sau đó cấy trở lại nguời bệnh.
Trong tuơng lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi truờng mô tế bào và sau đó
cấy lên nguời bệnh sẽ là tiến triển tột cùng.

- Mỗi kỹ thuật hên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phuơng pháp phân phối gen, một số nhân
tố cần đuợc cân nhắc:
■ Hiệu quả của liệu pháp phải đuợc đặt lên hàng đầu.
■ Sau đó, gen chuyển đổi phải đuợc điều hồ đúng đắn. Nó phải đuợc hoạt hố đúng lúc, với độ dài thời gian
chính xác và đúng số luợng.
2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào động vật theo 2 bước:
■ Bước 1: Tạo vector tái tổ họp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được biến đổi để khơng cịn khả
năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm


việc loại bỏ các hình tự cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotor mạnh. Sau
đó, vector tái tổ họp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì
dễ ni cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri potential).


Packaging Cell

Tramgen* Cactcttc

Rccombinant Viral Vcctor

Creating Recombinant Viral Vectors for Gene Therapy
■ Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta
đã tách các tế bào tuỷ xương. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự
thân dù gen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen
lạ tạo ra có thể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa,
nếu việc chuyển gen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế
bào chuyến gen hở lại cơ thế lại ít khi có hiệu quả do nhiều ngun nhân.
Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm sự

phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens) bổ sung
cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào của một
người lành là anh em sinh đơi của người bệnh. Sau đó các tế bào này được tiêm vào
bệnh nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của virus khi bắt cặp
và vơ hiệu hóa trình tự TAR đóng vai hị trong sự sao chép. Còn các Oligonucleotit
đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận chuyển mRNA từ nhân ra tế
bào chất.


tissue culture plastic surtace

oligonucleotides
binds to mRNA

_____ Translation

Optical Remote

mRNA ------———► Protein

Control
activated nanoparticle

conjugated
nanopartides

II

^✓I 1

protein

blocked
protein
degraded
translation
mRNA
no
surTace
protein

ĩ

ị
—

Antisense Gene Therapy

3.

• JLnucleus

Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp

- Hình thức chuyển gen có thể được thao
tác thơng qua một số cách sau:
■

Chuyển trực tiếp gen vào mô

người bệnh (liệu pháp in vi vo). Gồm:
s Lựa chọn vector liệu pháp thích họp •S Tách và tạo vector tái tố họp
mang gen liệu pháp ■S Đưa vector tái tổ họp mang gen liệu pháp vào
bằng các kỹ thuật chuyển gen như vi tiêm, súng bắn gen,...
■S Kiểm tra biểu hiện của gen liệu pháp
■ Chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh (liệu pháp ex vivo):
S Lấy tế bào có gen hỏng ra ngồi cơ thể S Chuyển gen lành vào thay
thế gen hỏng để tạo tế bào lành S Nhân tế bào lành thành số lượng lớn
rồi đưa vào cơ thể


Q

Genc
AdonoTherapeulic
Tlw.npy In Vivo
Piasnid
Vector
associatod
Gcne
Gene Transđuction
Virus
Ad©nowus
lent.vrus
Retroviais

- \.Ịm

4ặỊb»
*

J

Oonor CcllsGoncticaBy
GcncExThcrapy
Vivo
Artcícd
Thetíipamc
GíovrthGcnc
Cdh>
Gene
Vcctot
Transduction
Facts
In Vxro
Expanvon

Biopsy
LMX

^V
lmplnrM.itI

1

Géoa DèivGry Caĩh0T6f

Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp:
■ Kỹ thuật vi tiêm (Microinjection) : dùng cho cả 2 hình thức in vivo và ex vivo

Kỹ thuật xung điện (Electroporation) : thuờng dùng cho ex vivo
Kỹ thuật liposome (liposome technique) : thực hiện theo hình thức in vivo. Cần chú
MMOHMMA
Tt

1

B

*****
*
ftợrw

and attcr
Elcctroporation

Kỹ thuật dùng súng bắn gen (gene gun) : kỹ thuật này dùng để chuyển gen
liệu pháp vào tế bào đích và thuờng đạt kết quả cao. Thực hiện theo hình
thức ex vivo

ý chọn tế bào đích để nâng cao hiệu quả


V. Nguyên lý của liệu pháp gen :
1. Tách dòng gen liệu pháp :
Tách dòng gen liệu pháp được thực hiện bằng các phương pháp tách dịng thực
nghiệm thơng thường, trong các phịng thí nghiệm sinh học phân tử và kỹ thuật
gen. Gen liệu pháp có thể tách dịng từ các nguồn tế bào cho khác nhau như tế bào
vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật, tế bào người và một số loại virus. Tách dịng

gen liệu pháp có hiệu quả cao đối với các gen đã biết rõ kích thước, vị trí của gen
trong bộ gen. Hiệu quả tách dòng gen liệu pháp còn phụ thuộc vào cấu trúc, chức
năng gen, sản phẩm của hoạt động gen cũng như mức độ hiện đại của các thiết bị
thí nghiệm.
Tùy theo đặc tính của gen liệu pháp và mục đích của liệu pháp gen, có thể tách
dịng gen liệu pháp từ bộ gen (genome) hoặc từ mRNA. Trường họp cần các gen
nguyên vẹn (kế cả các vùng không mang mã di truyền) phải tách dòng từ bộ gen,
thường chỉ thực hiện với các gen có kích thước nhỏ. Nếu các gen cần thiết có kích
thước lớn, hoặc chỉ cần các phần DNA mang mã di truyền, phải thực hiện cách tách
dòng từ mRNA. Trường hợp này cần tách chiết mRNA và thực hiện kỹ thuật phiên
mã ngược đế tạo các cDNA tương ứng.
Trường họp gen liệu pháp là các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự (mạch kép
hoặc mạch đơn), có thể tạo các đoạn oligo nucleotide bằng phương pháp tổng hợp
nhân tạo.
2. Các loại vectơ thường sử dụng trong liệu pháp gen
Để có thể nâng cao hiệu quả của liệu pháp gen trong chữa bệnh, một vấn đề quan
trọng là chọn vectơ chuyển gen phù họp với gen cần chuyển, phù họp với loại tế
bào đích và loại bệnh cần trị.
Vectơ chuyển các gen liệu pháp trong liệu pháp gen gọi là các vectơ liệu pháp.
Vectơ liệu pháp có một số đặc điểm riêng:
- Phải đảm bảo đưa các gen liệu pháp vào tế bào (cơ thể) dễ dàng, không gây tổn
thương hoạt động của các gen khác trong bộ gen (khơng hoặc rất ít gây


đáp ứng miễn dịch, không gây phá hủy chức năng các mơ, khơng có tác động
kích hoạt gen tiền ung thư...).
-

Phải có khả năng mang một gen liệu pháp có kích thước càng lớn càng tốt.

-

Có sự linh hoạt với các tế bào đích, mơ đích để có thể gắn gen liệu pháp vào
đúng những vị trí định trước

Hiện nay, dựa vào nguồn gốc của vectơ liệu pháp gen, người ta chia các vectơ liệu pháp
làm 2 nhóm: vectơ có bản chất virus (viral vector) và vectơ khơng có bản chất virus
(nonviral vector).
2.1 Các vectơ liệu pháp gen có bản chất virus (viral vector)
Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus
Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn
với các tế bào chuyên biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ
thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề
mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lóp rào chắn màng tế
bào.
Khi xâm nhiễm tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của virus vào trong các tế bào
chủ. Một số nhóm virus có thể gắn được bộ gen virus hoặc một số gen của chúng vào
bộ gen của tế bào chủ, tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn với tế bào chủ,
có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia tế bào chủ, tạo nên các provirus. Hiện
tượng tạo provirus được gọi là trạng thái tiềm sinh của virus. Đối với các virus gây
bệnh, đó là thời gian ủ bệnh.
Trong quá trình tồn tại và phân chia của tế bào chủ, bộ gen virus cũng được nhân lên
tạo vô số tế bào mang gen virus, vẫn hoạt động bình thường. Khi có một tác nhân nào
đó (thường là tia tử ngoại, các chất độc, tia phóng xạ hoặc nhiệt độ cao...) tác động vào
provirus, làm cho bộ gen virus tách khỏi tế bào, thực hiện quá trình tái bản gen virus và
tổng họp các thành phần của virus trong tế bào chủ. Sự lắp ghép các thành phần của
virus tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ
và tiếp tục xâm nhiễm tế bào khác. Đây là giai đoan biểu hiên bênh rõ nhất.

Trên cơ sở hiểu biết về bộ gen virus, cơ chế xâm nhiễm tế bào, cơ chế gắn gen của virus
vào bộ gen tế bào, con người đã tìm ra các biện pháp loại bỏ hoặc gây bất hoạt các gen
có hại của virus, nhưng vẫn giữ lại các gen giúp cho sự xâm nhiễm và gắn gen virus vào
bộ gen tế bào, tạo nên các vectơ liệu pháp gen.
Các viral vector được chia thành nhiều nhóm tùy theo đặc điểm cấu trúc bộ gen, đặc
điểm xâm nhiễm, đặc điểm gây bệnh của virus... . Viral vector gồm một số loại chủ yếu:
vectơ adenovirus, vectơ retrovirus, vectơ adeno-associated virus (AAV), vectơ herpes
simplex virus (HSV)....
Đac cliém
Kká nang

Re trovir.il

Adenovir.il

Vectors

Vectors

Simplex AílenoAssociited
Viral Vectors

8 kb

7-8 ib

30 ib

Heipes

3ir.ll

Vectors
4.5 kb

Su iiồ nhập CĨ
Thu động
Khồng
Có
Tuih đạc hieii
Có
Có
Có
Khơng
mo
Chi nhiêm trong
Hợp nhất trong các
Nhiễm các tế bào
Đạc tuih
Neurotropic
các tế bào đang
tế bào ihông phàn
irViOng phân chia
phân chia
chiaex vivo
Ex vivo hoặc nhiễm
Chi
Ex vivo hoặc nhiễm
Ex vivo hoặc nhiễm
Bien pháp

tncc
tiếp
trưc tiếp
trưc tiếp
aerosolúation
Chun 11
106-109 cỉu/mL
108-1010 cíuỉmL 106-108 cfuẠnL
106-108 cfii/mĩ.
Thoi gian biêu Tót
liien gen
Múc tlo biêu
Vùa phái
liien gen
Ván (le an toán

2.1.1

Nhiễm các gen đột
biến

Thfti gian ngắn

Thời gian ngịắn

Khả nảng tốt

Cao

Vừa phải

Vùa phải

Phản ứng viêm
nhiêm, nhiêm các
gen đột biến

Nhiễm các gen đột
biến

Tính độc của
Proĩein IBP, Nhiễm
các gen đột biến

Vectơ adenovirus

Đặc điểm và cấu tạo di truyền
Adenovirus là một loại virus có caspid đa diện 20 mặt, phần lõi chứa DNA mạch kép.
Vỏ caspid của virus chứa 3 protein: hexon, íĩber và base penton. Hexon là thành phần
cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt 20 mặt, trong khi các penton tạo


thành phức hệ với fĩber cho kết quả là 12 chóp ngồi vỏ virus đóng vai trị quan trọng
trong việc gắn với các phối tử. Adenovirus đuợc phân lập đầu tiên từ amidan vòm họng
của nguời, gây các bệnh về đuờng hô hấp. Bộ gen của adenovirus là một chuỗi DNA

q

xoắn kép dài 36 kb, gồm hơn 50 gen.
Trong bộ gen của adenovirus có 4 vùng gen quan trọng, ký hiệu là Ei, E 2, E3 và E4. Gen

Ei có chức năng mã hóa cho các protein enzyme giúp cho quá trình phiên mã tổng họp
các protein sớm (protein enzyme của virus). Gen E 2 và E4 điều hòa quá trình tái bản
DNA virus, dịch mã tống hợp protein muộn đồng thời có liên quan đến sự đáp ứng miễn
dich của vật chủ trong q trình tấn cơng của adenovirus.
Ngun lỵ thiết kế vectơ adenovirus
Vectơ adenovirus đuợc tạo nên từ các adenovirus tái tổ họp. Đầu tiên cần tạo các
adenovirus tái tổ họp có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ nhung mất khả năng tái bản
trong tế bào chủ. Để thiết kế vectơ adenovirus phải loại bỏ gen Ei của adenovirus, thay
thế bằng phức họp promoter-gen liệu pháp và các gen cần thiết điều khiển quá trình
biểu hiện của gen liệu pháp trong tế bào chủ. Gen E 3 cũng đuợc gây bất hoạt hoặc loại
bỏ. Bộ gen virus sau khi loại bỏ gen Ei và E 3 đuợc đua vào tế bào đóng gói (packaging
cell) cùng với gen liệu pháp. Tại đây, quá trình tái tổ hợp ở những điểm tuơng đồng tạo
nên bộ gen adenovirus tái tổ họp chứa gen liệu pháp.


Cơ chế hoạt động
Adenovirus có thể xâm nhiễm cả tế bào không phân chia và các tế bào đang phân chia.
Vectơ adenovirus có thể mang các gen liệu pháp kích thước lớn từ 8 kb đến 30 kb,
không gây đột biến gen của tế bào đích. Điểm bất lợi nhất khi sử dụng vectơ adenovirus
là gây hiệu ứng giảm mạnh đáp ứng miễn dịch của tế bào.
Vectơ adenovirus có khả năng xâm nhiễm nhiều loại tế bào do nhiều loại tế bào đích có
các cơ quan thụ cảm phù họp với adenovirus. Khi xâm nhiễm vào trong tế bào chủ,
phần lõi mang bộ gen virus và gen liệu pháp chui qua lỗ màng nhân. Bộ gen của
adenovirus khơng có khả năng gắn với bộ gen của tế bào chủ. Trong nhân của tế bào
chủ, các gen của adenovirus thực hiện quá trình phiên mã, quá trình dịch mã trong tế
bào chất của tế bào tạo các protein liệu pháp và các protein cần thiết cho virus.
2.1.2

Vectơ retrovirus ( retroviral vector)

Đặc điểm cẩu tạo và di truyền
Retrovirus là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ cao, có khả năng gắn
bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ.
Cấu trúc retrovirus gồm phần vỏ có ba lớp. Lớp vỏ ngồi cùng là glycoprotein, tiếp đến
lóp vỏ kép lipid, trong cùng là vỏ caspid. Bên trong lóp vỏ caspid là RNA và các loại
enzyme của virus. Enzyme phiên mã ngược giúp virus chuyển bộ gen RNA sang dạng
cDNA mạch kép. Enzyme cài xen giúp cho quá hình cài xen bộ gen virus với bộ gen tế
bào chủ ở những điểm tương đồng.


Protease
gp120
Reverse
p24
capsid
transcrptase
Lipid

Viralstructure
Cor
RNA e

p17 matrix

Proteins
aretrovirus
Viral 1

enzymes
Lipids

1]
Envelope
Reverse
transcriptase

Integrase
Copyright © 2002, Elsơviar Sciơnca (USA). AM rights rôservad

courtesy www.andrew.cmu.edu

Cẩu tạo retrovirus
Bộ gen retrovirus gồm 2 sợi đơn RNA đồng dạng, kích thước khoảng 7-11 kb. Mỗi sợi
RNA chứa ba nhóm gen chủ yếu: gag, pol, env. Một số virus gây ung thư có thêm nhóm
gen gây ung thư oncogen.
Gen gag mã hóa các protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt virion, gen pol mã hóa
các enzyme phiên mã ngược và các enzyme cần thiết cho hoạt động của virus, gen env
mã

hóa

LTR

imt

pol

rnv

LTR

protein
trong

cấu

trúc các lớp
HIV-1

po
l

vỏ của virus. Hai đầu mỗi sợi RNA có một trình tự lặp dài tận cùng - LTR (long
terminal repeats). Đoạn lặp LTR mang một số trình tự cần thiết cho quá trình biểu hiện
gen của virus và một trình tự đặc hiệu giúp gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ, gọi
là trình tự gắn xen - att (attachment site). Trong bộ gen virus cịn có một trình tự giúp
q trình đóng gói bộ gen của virus gọi là trình tự 'P.

MLV


Bộ gen của virus gây bệnh ung thưMLVvà DNA của virus (hình thái của bộ
gen virus trong các tể bào bị nhiễm)
Nguyên lý thiết kế vectơ
Nguyên lý chung của quá trình thiết kế vectơ retrovirus là phải loại bỏ các gen độc của
virus, chỉ giữ lại một số gen cần thiết cho quá trình xâm nhiễm, tái bản, gắn gen, đồng
thời cài thêm các gen liệu pháp.
Các giai đoạn thiết kế vectơ retrovirus:
1. Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và oncogen, thay thế bằng gen
liệu pháp tạo thành vectơ bộ gen
2. Xử lý cắt riêng các gen gag, pol, env của retrovirus nhung vẫn đảm bảo chức

năng của các gen
3. Đua vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol,env đã xử lý của virus vào một tế
bào đóng gói
4. Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng họp các thành phần của vỏ
virus, các thành phần của vỏ virus kết họp với vectơ mang gen liệu pháp hình
thành nên vectơ retrovirus
Cơ chế hoạt động
Mỗi loại retrovirus có đặc điểm cấu trúc gen, khả năng xâm nhiễm và tái bản riêng, do
đó từ các loại retrovirus khác nhau ta có các loại vectơ retrovirus khác nhau. Hai nhóm
vectơ rctrovirus đuợc sử dụng nhiều nhất trong liệu pháp gen là Mo- MuLV (Moloney
murine luekemina) và Lentivirus ( HIV - human immune deíiciency virus, SIV - Simian
immune deíĩciency virus). Vectơ Mo-MuLV sử dụng cho những tế bào đang phân chia,
vectơ HIV và SIV sử dụng cho những tế bào ở trạng thái không phân chia.
Vectơ rctrovirus đuợc đua đến tế bào đích bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Sau khi vào
trong tế bào, các thành phần vỏ của virus bị phân hủy trong tế bào chất của tế bào đích,
RNA đuợc giải phóng. Enzyme phiên mã nguợc của virus xúc tác quá trình chuyến
RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép. cDNA qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào đích,
nhờ enzyme intergase của virus làm cho cDNA mạch kép


được gắn xen vào bộ gen ở những điểm tưong đồng. Gen liệu pháp cũng
đồng thời được gắn xen vào bộ gen của tế bào đích phiên mã và dịch mã
tạo nên các protein liệu pháp trong tế bào đích.

2.1.3

Vectơ Adeno-Associated virus

Đặc điểm cấu tạo và di truyền
Adeno-Asociated Virus (AAV) là loại virus kích thước nhỏ thuộc nhóm parvovirus

khơng gây bệnh cho người, khi khơng có mặt của một loại virus trợ giúp khác như
adenovirus, virus helper..., AAV có thể xâm nhiễm các tế bào không phân chia, gắn bộ
gen virus vào bộ gen người ở vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 19 tạo nên tiền virus
(provirus).
Bộ gen của AAV là DNA sợi đơn, được bao bọc trong lóp vỏ caspid. Kích thước bộ gen
khoảng 4,5 - 4,7 kb, hai đầu là các trình tự lặp tận cùng đảo ngược ITR (Inverted
Terminal Repeats) gồm 145 bp. Bộ gen AAV gồm 2 nhóm gen chính là gen rep và gen
cap, các promoter p5, pl9 và p40, phần cuối bộ gen là trình tự gắn đi poly Adenin poly A (polyadeninlation). Gen cap mã hóa protein trong cấu trúc vỏ caspid của AAV.
Gen rep mã hóa các enzyme giúp cho quá trình tái bản, phiên mã và quá trình gắn bộ
A
AAV Genome

gen AAV vào bộ gen tế bào chủ.


Nguyên lý thiết kể
Khi thiết kế các vectơ AAV phải loại bỏ các gen rep, cap của AAV đồng thời thay thế
vào vị trí đó là gen liệu pháp cùng promoter thích họp. Bộ gen của AAV chỉ thích hợp
với các gen liệu pháp có kích thuớc duới 4kb, khi kích thuớc gen liệu pháp lớn hơn 5kb,
vectơ sẽ mất tác dụng.
Q trình thiết kế vectơ AAV cần sự có mặt của virus trợ giúp, thuờng sử dụng là các
adenoviral helpers giúp quá trình tái tổ họp đồng thời với gen liệu pháp, gọi là sự đồng
chuyển nhiễm. Hiện nay, thiết kế vectơ AAV nguời ta sử dụng đồng thời vectơ plasmid
mang gen liệu pháp và các đoạn ITR, virus AAV và virus trợ giúp là adenoviral helper.
Quá trình chuyến nhiễm đồng thời tạo nên vectơ AAV mang gen liệu pháp và các dạng
adenovirus lai. Các adenovirus lai bị gây bất hoạt bằng kỹ thuật xử lý nhiệt, sau đó
dùng kỹ thuật siêu ly tâm phân đoạn để tách các vectơ AAV mang gen liệu pháp.
Cơ chế hoạt động
Khi vectơ AAV tiếp cận tế bào ở các thụ thể đặc trung, toàn bộ các gen qua lỗ màng
nhân vào trong nhân tế bào. Trong nhân tế bào chủ, một số gen mã hóa các protein

enzyme đuợc phiên mã và dịch mã, giúp cho quá trình tái bản DNA và gắn DNA vào vị
trí đặc hiệu trên bộ gen tế bào chủ. Gen liệu pháp cũng đuợc nhân lên, phiên mã và dich
mã tạo nên các protein liệu pháp.
2.1.4

Vectơ liệu pháp từHerpes Simplex Virus (HSV)

Đặc điểm cẩu tạo và di truyền của herpes virus
Herpes virus là một nhóm virus lớn, gây bệnh ở nguời và động vật. Herpes virus có
kích thuớc khoảng 150nm, cấu tạo gồm vỏ ngoài, vỏ trong, màng lipid, vỏ caspid và
phần lõi chứa DNA. vỏ caspid cấu tạo từ 162 đơn phân, tạo hình đa diện 20 mặt. Bộ
gen là phân tử DNA mạch kép, kích thuớc 152 260 bp.
Herpea virus tuơng đối đa dạng, gồm nhiều nhóm có sự phân biệt gọi là herpes typ 1,
herpes typ 2.., do đó đuợc gọi là virus đơn hình ( herpes simplex) ký hiệu là HSV-1,
HSV-2.


Bộ gen herpes virus gồm ba nhóm gen chủ yếu là: nhóm gen a hay gen rất sớm - IE
(immediate early), nhóm gen p hay gen sớm - E (early) và nhóm gen y hay gen muộn L (late), hai đầu là các trình tự TR (terminal repeat)... . Trong bộ gen có khoảng một
phần hai các gen khơng cần thiết cho sự tái bản của herpes virus trong tế bào chủ.

HERPESVIRUS
ES
s

nucleocapsid

tegument

lipid bilayer

Cẩu tạo của herpes virus
Nguyên lý thiết kế vectơ HSV-1
Thiết kế vectơ HSV-1 dựa trcn cơ sở tái tổ họp của virus HSV-1 với Amplicon plasmid.
Amplicon plasmid là một plasmid tái tố họp mang gen Ori, gen kháng Ampicilin trong
plasmid của E.coli đồng thời mang gen Ori và gen mã hóa khả năng đóng gói của HSV
và gen liệu pháp có gắn đoạn promoter kiểm sốt nhóm gen rất sớm.
Amplicon plasmid và virus trợ giúp cùng đuợc gây nhiễm vào tế bào khả biến. Quá
trình tái tổ hợp trong nhân tế bào khả biến tạo nên các vectơ HSV mang gen liệu pháp
có thể su dụng trong liệu pháp gen.
Cơ chế hoạt động của vectơ HSV-1
Vectơ HSV-1 có khả năng cho gắn và chuyển những gen liệu pháp kích thuớc từ 30 đến
50 kb. Vectơ HSV-1 xâm nhiễm tế bào chủ nhanh, thời gian tiềm ẩn dài, không hoặc ít
gây đáp ứng miễn dịch khơng mong muốn ở tế bào chủ.
Hiện nay, vectơ HSV-1 sử dụng trong liệu pháp gen cịn hạn chế do vectơ HSV-1 có thể
tạo một số họp chất độc trong tế bào một cách gián tiếp. Mặt khác, vectơ


HSV-1 chỉ biểu hiện đặc hiệu ở các tế bào thần kinh, do đó phạm vi ứng dụng của vectơ
HSV-1 trong chữa bệnh rất hẹp, chủ yếu điều trị các bệnh lien quan đến hệ thần kinh.
2.2 Các vector không có bản chất virus
2.2.1 Liposomes
- Liposome là vector khơng có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên của màng
tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và thành phần lipid
cũng nhu tính hịa tan nuớc khác nhau. Thành phần và cấu trúc của nó xác định các tính
chất này.
- DNA tích điện âm. Tính “béo” cao và tích điện âm của màng tế bào nguời và màng
nhân ngăn cản sự di chuyển tự do ra vào tế bào của DNA. Liposome mang điện tích
duơng, lớp vỏ ua lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng gắn chặt với
nhau, tạo nên phức họp ua lipid liposome-DNA. Tính hồ tan chất lipid này cho phép

vận chuyển nó qua màng tế bào và màng nhân, dễ dàng đua DNA vào nhân của tế bào.

Hình 15. Sơ đồ quá trình sử dụng liposomes làm vector chuyển gen.


- Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến chúng
trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại. Sự xâm nhập của protein
trong vector ngăn cản đáp ứng miễn dịch của vật chủ và chúng không bị nguy hiểm hay
bị tiêu diệt bởi các enzym (endonucleases) nội bào.
- So với tất cả các vector khơng có bản chất virus, chuyển gen liposome có tiềm năng
ứng dụng lớn nhất tại thời điểm hiện tại.
2.2.2 Các polymer cation
Các polymer cation là chuỗi các phức họp tích điện dương. Khi trộn với DNA,
chúng tạo thành phức họp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng mà có thể dễ dàng
Formation of complexes
dye exclusion assay
agarose gel electrophoresis
amino group analysis

'I

stability of complexes

Aggregation of complexes
- PCS
- Turbidometry analysis
- Zeta potential

- polyanions
• salt

• nuclease degradation 1

+
>—'
\/

+

Hum an Transf«rrin

Plasmid DMA

vào nhân. Lĩnh vực nghiên cứu này là cuộc cách mạng nhanh chóng các phân tử khơng
Hình 16. Sự xâm nhập vào tê bào của các polymer cation.
độc có tính hiệu quả hơn và chuyển các gen tới các tế bào đúng đích hơn.
Hình 17. Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu sự tạo thành và tính ổn định
của phức hệ polycation-DNA.


2.2.3 Cấy trực tiếp
Sự cấy các DNA trần hay DNA tự do là một ví dụ khác của chuyển gen khơng có
bản chất virus. Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy hực tiếp tới khối u hoặc mô.
Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein quan trọng
cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng miễn dịch giúp
ngăn ngừa bệnh. Kỹ thuật này đã được ứng dụng cho cơ xương trong điều trị các bệnh
thoái hoá cơ (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản các bệnh gan do virus (như bệnh viêm
gan), và các bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim). Ngoài ra, các nghiên cứu hên động
vật đã thành công trong điều trị ung thư như u ác tính và u bướu. Trong khi giá thấp và
tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn, cũng có một số nhược điểm. Đầu tiên, sự quản
lý hệ thống của vật chất di truyền là vấn đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi

enzym nội bào và nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận. Hiệu quả của biểu
hiện di huyền cực kỳ khó nhận thấy. Hơn nữa, trong một số trường họp khơng duy trì
được biểu hiện của gen, các DNA lạ (íịreign DNA) có thế gây đáp ứng miễn dịch
mạnh.