Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của chủng nấm men Candida glabrata RN4 từ gạo nếp cẩm lên men

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4
DOI: 10.15625/vap.2020.00046

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN
Candida glabrata RN4 TỪ GẠO NẾP CẨM LÊN MEN
Trần Văn Tuấn1,*, Vũ Xuân Tạo2
Tóm tắt: Nấm men Candida glabrata thường được liên hệ với khả năng gây bệnh
cơ hội ở người. Tuy nhiên, một số chủng của lồi này lại có khả năng sinh ethanol
và chịu được các điều kiện sinh trưởng khắc nghiệt trong quá trình lên men. Với
khả năng lên men sinh ethanol và chịu được nồng độ ethanol cao mà C. glabrata
có thể vơ tình được sử dụng hoặc bị nhiễm vào sản phẩm lên men trong quá trình
sản xuất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được chủng C. glabrata
RN4 trong một sản phẩm gạo nếp cẩm lên men. Chủng RN4 có hình thái tế bào
trên cả mơi trường thạch và dưới kính hiển vi đều rất giống với lồi nấm men
rượu Saccharomyces cerevisiae. Chủng RN4 có đặc tính kết lắng và bám dính bề
mặt giống với một số chủng nấm men S. cerevisae đã được nghiên cứu. Đặc biệt,
chủng này có khả năng lên men hình thành khí CO2 và chịu được nồng độ ethanol
trong mơi trường nuôi cấy lên đến 7%. Việc phân lập được chủng nấm men C.
glabrata trong sản phẩm lên men cho thấy cần phải có sự kiểm sốt chặt chẽ về
chất lượng của gạo nếp cẩm lên men theo hình thức thủ công để tránh nhiễm
nấm men gây bệnh cơ hội có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dùng.
Từ khóa: Candida glabrata, Saccharomyces cerevisiae, gạo nếp cẩm lên men.

1. MỞ ĐẦU
Sau Candida albicans, Candida glabrata là nguyên nhân thường gặp nhất liên quan
đến các bệnh về da, miệng và đường sinh dục ở người. Nấm men C. glabrata có thể gây
nhiễm trùng hệ thống, viêm da hoặc viêm đường sinh dục ở những người bị suy giảm
miễn dịch (Pfaller & Diekema, 2004).
Tương tự với nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae, C. glabrata có khả năng
bám dính để dễ dàng tiếp cận và xâm nhập vào cơ thể vật chủ. Khả năng bám dính cũng là
yếu tố cần thiết trong tương tác giữa các tế bào và tạo các khối đa bào (Brückner &

Mưsch, 2011). Nhờ có khả năng sinh lượng lớn ethanol trong quá trình lên men mà C.
glabrata đã được nghiên cứu để dùng trong sản xuất ethanol sinh học (Watanabe et al.,
2010). Tuy nhiên vì lồi nấm men này có nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe con người, nên
C. glabrata chỉ được nghiên cứu sử dụng cho mục đích cơng nghiệp.
Nấm men S. cerevisiae thường được sử dụng trong sản xuất thực phẩm lên men và
các đồ uống có cồn (Walker & Stewart, 2016). Ở những cơ sở sản xuất nhỏ lẻ, việc kiểm
soát chất lượng men giống dùng trong sản xuất còn rất hạn chế. Men giống (dạng bột hoặc
1Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ
*Email:
2Trung


BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

370

dạng bánh men) thường được bổ sung vào nguyên liệu ở mỗi lần sản xuất. Nếu chủng
giống khơng được kiểm sốt về mặt phân loại mà chỉ dựa vào hiệu quả lên men sẽ rất khó
để đánh giá được mức độ an toàn. Ngoài ra trong q trình lên men theo sản xuất thủ cơng
cũng có thể xuất hiện sự tạp nhiễm của nấm men gây bệnh cơ hội như C. glabrata. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được chủng C. glabrata RN4 trong sản phẩm gạo
nếp cẩm lên men được bán tại một chợ ở Hà Nội. Chủng RN4 có hình thái và một số đặc
tính tương đồng với nấm men rượu S. cerevisiae như khả năng lên men, đặc tính kết lắng
tế bào và bám dính bề mặt.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Mẫu gạo nếp cẩm lên men theo phương pháp thủ công được mua tại một chợ ở Hà

Nội dùng cho phân lập nấm men tổng số.
Chủng S. cerevisiae BY4741 khơng có khả năng kết lắng và khơng bám dính được
mua từ EUROSCARF (www.euroscarf.de). Chủng BY4741[FLO8] là chủng được chuyển
gen FLO8 để kích hoạt khả năng kết lắng và bám dính ở nấm men rượu do Phịng
Genomic, Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cung cấp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phân lập và quan sát hình thái
Mẫu gạo nếp cẩm lên men được tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau, sau
đó cấy trải trên mơi trường YPD (1% cao nấm men, 1% pepton, 2% dextrose, 2% agar, pH
6,5). Đĩa mơi trường sau đó được ủ ở nhiệt độ 30 ºC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc nấm men
xuất hiện được tinh sạch, thuần khiết. Hình dạng tế bào được quan sát dưới kính hiển vi
quang học.
Đánh giá khả năng bám dính
Chủng RN4 và 2 chủng đối chứng BY4741 và BY4741[FLO8] được cấy vạch trên
đĩa môi trường YPD. Sau 24 giờ nuôi ở 37 oC, tiến hành bổ sung 5-7 ml nước cất lên bề
mặt đĩa và lắc nhẹ cho đến khi khuẩn lạc nấm ở chủng đối chứng âm BY4741 trơi hết thì
đổ bỏ phần dịch lỏng. Khả năng bám dính bề mặt của chủng RN4 được so sánh với chủng
đối chứng dương là BY4741[FLO8].
Đánh giá khả năng kết lắng
Cấy một vài khuẩn lạc nấm men vào ống fancol 10 ml có chứa 3 ml môi trường
YPD dạng dịch. Ống được nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở 37 ºC. Hai chủng
BY4741[FLO8] và BY4741 được sử dụng làm đối chứng. Sau 18 giờ, các ống dịch nuôi
sẽ được dựng đứng cố định trong 1-2 phút. Các chủng có khả năng kết lắng sẽ nhanh
chóng tạo lớp sinh khối lắng dưới đáy ống fancol.
Đánh giá khả năng lên men sinh CO2 và chịu ethanol


PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC

371

Chủng RN4 và chủng đối chứng là nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae
BY4741 được ni cấy trong ống nghiệm có chứa ống Durham và 10 ml dịch môi trường
Hansen (5% glucose; 1% pepton; 0,3% KH2PO4; 0,2% MgSO4.7H2O; 1,5% agar; pH 6).
Các ống nghiệm được bọc kín và ni ở nhiệt độ 30 ºC. Các mẫu được quan sát khả năng
sinh khí sau 15-20 giờ nuôi cấy. Khả năng chịu cồn được xác định bằng cách nhỏ 10 µL
dịch tế bào nấm men RN4 và chủng đối chứng BY4743 lên bề mặt môi trường YPD đã bổ
sung ethanol để đạt được các nồng độ ethanol tương ứng là 5%, 7% và 9%. Các đĩa được
ủ trong tủ ổn nhiệt 30 oC trong 24 giờ để nấm men phát triển.
Định danh chủng RN4 bằng giải trình tự vùng ITS của rDNA
DNA hệ gen của chủng RN4 được tách chiết theo quy trình nhóm nghiên cứu đã
công bố (Tran et al., 2017). Vùng ITS của rDNA được khuếch đại từ DNA hệ gen bằng
PCR sử dụng cặp mồi đa năng đặc hiệu cho phổ rộng các lồi nấm gồm: mồi xi ITS1
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) và mồi ngược ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATAT GC)
(White et al., 1990). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,7% và tinh sạch bằng
kit tinh sạch của hãng Promega (Mỹ). Mẫu DNA tinh sạch được giải trình tự bởi Cơng ty
1st BASE (Singapore) và trình tự ITS được phân tích so sánh với cơ sở dữ liệu của
GenBank. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA6.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và đặc điểm hình thái của chủng RN4
Từ mẫu gạo nếp cẩm lên men, chúng tôi phân lập và thuần khiết được chủng nấm
men RN4. Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường YPD, khuẩn lạc chủng RN4 có màu trắng,
bóng đặc trưng của nấm men. Quan sát dưới kính hiển vi, tế bào chủng RN4 có dạng hình
oval, sinh trưởng bằng nảy chồi. So sánh đặc điểm hình thái chủng RN4 với chủng nấm
men chuẩn S. cerevisiae BY4741 nhận thấy chúng đều có khuẩn lạc trịn, màu trắng đục,
bề mặt lồi và bóng, hình thái tế bào dưới kính hiển vi của chúng cũng rất giống nhau
(Hình 1). Nếu chỉ dựa vào hình thái khuẩn lạc hoặc hình thái tế bào, rất khó có thể phân
biệt được hai chủng này.

Hình 1. Hình thái khuẩn lạc chủng nấm men RN4 và S. cerevisiae BY4741 trên môi trường YPD
và hình thái tế bào dưới kính hiển vi

3.2. Định danh chủng RN4 bằng giải trình tự vùng ITS của rDNA
So với các gen 18S rRNA và 28S rRNA của rDNA, vùng ITS nối giữa gen 18S
rRNA và 28S rRNA (gồm ITS1; 5,8S rRNA; ITS2) ở nấm có mức độ biến đổi cao giữa


372

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

các lồi gần gũi. Do đó vùng trình tự này được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu phân
loại nấm (Curran et al., 1994, White et al., 1998).
DNA hệ gen của chủng nấm RN4 được tách chiết dùng để khuếch đại vùng ITS
bằng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose chỉ cho một
băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 760 bp (Hình 2a). Kết quả so sánh trình tự ITS
thu được với dữ liệu trong GenBank cho thấy chủng RN4 thuộc lồi Candida glabrata với
độ tương đồng về trình tự ITS là 99,9% (Hình 2b).

Hình 2. Định danh chủng RN4 dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA
(a) Sản phẩm PCR vùng ITS trên gel agarose 0,7%, (b) Cây phát sinh chủng loại
dựa trên trình tự ITS của rDNA

3.3. Khả năng bám dính và kết lắng của của chủng RN4
Khả năng bám dính tạo thành các cụm tế bào hoặc bám dính bề mặt là điều kiện tiên
quyết cho các phương thức sinh trưởng, khả năng hấp thụ dinh dưỡng và thích ứng với các
yếu tố khắc nghiệt của môi trường như nồng độ ethanol cao, dinh dưỡng cạn kiệt
(Brückner & Mösch, 2011). Đối với các chủng nấm men gây bệnh, khả năng bám dính bề
mặt giúp chúng có thể bám và xâm nhập vào tế bào chủ để lây nhiễm. Chủng RN4 cùng 2

chủng đối chứng BY4741 và BY4741[FLO8] được kiểm tra khả năng kết lắng và bám
dính. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy chủng RN4 có khả năng kết lắng giống với chủng
đối chứng BY4741[FLO8]. Dựa trên lượng sinh khối kết lắng cho thấy chủng RN4 có khả
năng sinh trưởng và kết lắng rất mạnh (Hình 3a). Sau khi rửa trôi bằng nước, các tế bào
chủng RN4 hầu như không bị rửa trôi so với đối chứng âm là chủng BY4741 và khá tương
đồng với chủng đối chứng dương BY4741[FLO8]. Thậm chí chủng RN4 cịn thể hiện đặc
tính bám dính bề mặt mạnh hơn cả chủng đối chứng dương BY4741[FLO8] (Hình 3b).
Ở nấm men rượu S. cerevisiae, khả năng bám dính và kết lắng được quyết định bởi
một nhóm gen thuộc họ FLO mã hóa các protein gồm Flo1, Flo5, Flo9, Flo10 và Flo11.
Sự biểu hiện của các protein Flo được kiểm soát bởi protein điều hịa Flo8 mã hóa bởi gen
FLO8. Trên thực tế, nhiều các chủng nấm men rượu tự nhiên khơng có khả năng bám dính
và kết lắng do gen FLO8 bị đột biến dẫn đến bất hoạt (Fichtner et al., 2007). Khả năng
bám dính ở hai lồi nấm men quan trọng nhất của chi Candida là C. albicans và C.
glabrata cũng được kiểm sốt bởi gen điều hịa FLO8 (Cao et al., 2006; Mundy &


PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC

373

Cormack, 2009). Ở lồi C. glabrata, protein Flo8 điều hịa biểu hiện các gen thuộc họ
EPA mã hóa protein gắn bề mặt. Khả năng bám dính giúp nấm men dễ dàng xâm nhập và
lẫy nhiễm tế bào vật chủ (Mundy & Cormack, 2009).

Hình 3. Khả năng kết lắng và bám dính của chủng RN4 so với nấm men rượu S. cerevisiae.
(a) Khả năng kết lắng (b) Khả năng bám dính

3.4. Khả năng sinh khí CO2 và chịu ethanol của chủng RN4
Khả năng lên men của chủng RN4 được xác định gián tiếp qua sự hình thành khí
CO2 tích tụ trong ống Durham. Sau 15-20 giờ nuôi cấy, ống nghiệm với chủng RN4 và

chủng đối chứng là nấm men S. cerevisiae BY4741 đều sinh khí CO2. Khả năng sinh CO2
ở chủng RN4 thậm chí cịn mạnh hơn so với chủng BY4741 (Hình 4a). Thử nghiệm ni
trên mơi trường YPD có bổ sung các nồng độ ethanol khác nhau cho thấy chủng RN4 có
khả năng chịu được nồng độ cồn khá cao, lên đến 7% (Hình 4b).
Nấm men S. cerevisiae có khả năng lên men rượu và an toàn đối với sức khỏe con
người. Do đó, chúng được sử dụng rất nhiều trong sản xuất rượu vang, bia và một số sản
phẩm lên men khác (Legras et al., 2007). Việc chịu được nồng độ cồn cao khiến C.
grabrata dễ dàng thích ứng và sinh trưởng tốt trong các điều kiện lên men rượu. Gạo nếp
cẩm lên men là món ăn được bán rộng rãi tại các chợ truyền thống ở nước ta. Tuy nhiên,
việc phân lập được chủng C. glabrata RN4 có khả năng lên men sinh CO2 và chịu được
hàm lượng cao ethanol từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men cho thấy nguy cơ gây hại đối
với sức khỏe người tiêu dùng khi vơ tình sử dụng chủng RN4 trong lên men hoặc chủng
này bị nhiễm vào sản phẩm trong quá trình sản xuất.
Trên thế giới, một số chủng thuộc loài C. glabrata đã được nghiên cứu ứng dụng
trong lên men sản xuất ethanol từ nguyên liệu là phế thải nông nghiệp (Watanabe et al.,
2010). Tuy nhiên, việc nghiên cứu sử dụng loài C. glabrata kể cả phục vụ cho sản xuất
ethanol cơng nghiệp cũng cần được cân nhắc và kiểm sốt chặt chẽ.


374

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

Hình 4. Khả năng sinh khí CO2 và chịu ethanol của chủng RN4 so với chủng nấm men rượu
S. cerevisiae BY4741. (a) Khả năng sinh khí CO2, (b) Khả năng chịu ethanol

4. KẾT LUẬN
Đã phân lập được chủng nấm men RN4 từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men có đặc
điểm hình thái giống với lồi nấm men rượu S. cerevisiae. Chủng RN4 được phân loại
thuộc lồi C. glabrata dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA. Chủng RN4 có khả năng lên

men sinh khí CO2, chịu được nồng độ ethanol cao, có đặc tính bám dính và kết lắng. Tuy
nhiên, C. glabrata là lồi nấm men gây bệnh cơ hội ở người, nên chủng RN4 không được
phép sử dụng trong sản xuất thực phẩm.
Lời cảm ơn: Để hoàn thành nghiên cứu này, các tác giả xin cảm ơn CN. Đào Thị Bích
Ngọc đã hỗ trợ kỹ thuật cho một số thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Brückner S., Mösch H.-U., 2011. Choosing the right lifestyle: adhesion and development in
Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology Reviews, 36(1): 25-58.
Cao F., Lane S., Raniga P. P., Lu Y., Zhou Z., Ramon K., Chen J., Liu H., 2016. The Flo8
transcription factor is essential for hyphal development and virulence in Candida albicans.
Molecular Biology of the Cells, 17(1): 295-307.
Curran J., Driver F., Ballard J. W. O., Milner R. J., 1994. Phylogeny of Metarhizium: analysis of
ribosomal DNA sequence data. Mycological Research, 98(5): 547-552.
Fichtner L., Schulze F., Braus G. H., 2007. Differential Flo8p‐dependent regulation of FLO1 and
FLO11 for cell–cell and cell–substrate adherence of S. cerevisiae S288c. Molecular
Microbiology, 66(5): 1276-1289.
Legras J. L., Merdinoglu D., Cornuet J. M., Karst F., 2007. Bread, beer and wine: Saccharomyces
cerevisiae diversity reflects human history. Molecular Ecology, 16(10): 2091-2102.
Mundy R. D., Cormack B., 2009. Expression of Candida glabrata adhesins after exposure to
chemical preservatives. The Journal of Infectious Diseases 199(12):1891-1898.


PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC

375

Pfaller M., Diekema D., 2004. Twelve years of fluconazole in clinical practice: global trends in
species distribution and fluconazole susceptibility of bloodstream isolates of Candida.
Clinical Microbiology and Infection, 10(s1): 11-23.
Tran V. T., Do T. B. X., Nguyen T. K., Vu X. T., Dao B. N., Nguyen H. H., 2017. A simple,

efficient and universal method for the extraction of genomic DNA from bacteria, yeasts,
molds and microalgae suitable for PCR-based applications. Vietnam Journal of Science,
Technology and Engineering, 59(4): 66-74.
Walker G. M., Stewart G .G., 2016. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented
beverages. Beverages 2, 30; doi:10.3390/beverages2040030.
Watanabe I., Nakamura T., Shima J., 2010. Strategy for simultaneous saccharification and
fermentation using a respiratory-deficient mutant of Candida glabrata for bioethanol
production. Journal of Bioscience and Bioengineering, 110(2): 176-179.
White T. J., Bruns T. D., Lee S. B., Taylor J. W., 1990. Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, 18(1): 315.

BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF Candida glabrata RN4
ISOLATED FROM A FERMENTED GLUTINOUS RICE PRODUCT
Tran Van Tuan1,*, Vu Xuan Tao2
Abstract: The yeast Candida glabrata is often associated with the ability to cause
opportunistic disease in humans. However, some strains of this species have a high
ethanol production capacity and can endure the harsh growing conditions of
fermentation. There have been previous studies on the ability to use C. glabrata for
industrial bioethanol production. With the ability to ferment and a tolerance toward
high concentration of ethanol, C. glabrata may unknowingly contaminate the
glutinous rice fermention process. In this study, we isolated a budding yeast colony
from a fermented glutinous rice product and identified it as C. glabrata RN4. The
strain RN4 has similar morphological characteristics and cell shape to the baker’s
yeast Saccharomyces cerevisiae when grown on an agar plate and under microscopy.
RN4 possesses the features of flocculation (cell-cell adhesion) and agar surface
adhesion, which are similar to some well-known strains of S. cerevisae. RN4 has the
ability to ferment via production of CO2. This strain can grow at especially high
concentrations of ethanol (up to 7%). The successful isolation of a strain of C. glabrata
from a traditional fermented product indicates that it is necessary to have strict

control on the quality of hand-made fermented glutinous rice products in order to
avoid contamination of harmful yeasts that can cause opportunistic diseases.
Keywords: Candida glabrata, Saccharomyces cerevisiae, fermented glutinous rice.
1University

of Science, Vietnam National University, Hanoi
of Experimental Biology, National Center for Technological Progress
*Email:
2Center