Khảo sát hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi muốn gởi lời cảm ơn chân thành đến TS. Hà Cẩm Anh, TS. Phan Ngọc
Hòa và Th.S Huỳnh Thư đã tận tâm hướng dẫn, hỗ trợ tơi trong suốt thời gian nghiên
cứu và hồn thành luận văn, đã truyền cho tôi không chỉ là kiến thức quý giá, cách tư
duy logic mà còn là sự kiên nhẫn cũng như những động lực để hoàn thành tốt luận văn
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí
Minh, q thầy cơ khoa Kỹ Thuật Hóa Học, đặc biệt là quý thầy cô bộ môn Kỹ thuật
Hữu Cơ đã hết lịng truyền đạt cho tơi những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi học tập và nghiên cứu trong những năm học qua, đồng thời đã hướng dẫn,
giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè đã hết lịng hỗ trợ tơi về mọi mặt trong
quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài.
Và cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn gia đình, đã luôn luôn ở bên cạnh con, làm
chỗ dựa tinh thần và nguồn động lực phấn đấu cho con mỗi khi con thất bại.

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Như đã biết, các chất béo bão hịa có nhiều lợi ích cho sức khỏe, đặc biệt là acid lauric
- thành phần chính trong dầu dừa, với những hoạt tính sinh học có giá trị như: kháng
khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa,... Luận văn đã phân lập được phân đoạn phân cực
chứa các acid béo tự do (bao gồm acid lauric) và phân đoạn không phân cực bao gồm
các este qua phản ứng thủy phân dầu dừa bằng enzyme lypase Porcine pancreas và
đồng thời khảo sát, đánh giá hoạt tính sinh học sản phẩm thu được bằng các phương
pháp bắt gốc tự do DPPH (hoạt tính kháng oxy hóa); khuếch tán đĩa thạch và pha
lỗng (hoạt tính kháng vi sinh vật). Từ đó đưa ra điều kiện thủy phân tối ưu để cho sản
phẩm có hoạt tính sinh học cao nhất. Các kết quả đạt được từ thực nghiệm như sau:
 Qua khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật, kết luận được:
Sản phẩm sau thủy phân có hoạt tính cao nhất ở điều kiện thủy phân: tỉ lệ

dầu:đệm 1:5 (v/v); pH 7,5; tỉ lệ enzyme:cơ chất 0,5 % (w, v/v); nhiệt độ 37 oC.
 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH đưa ra kết luận phân đoạn phân cực cho hoạt
tính kháng oxy hóa cao hơn phân đoạn khơng phân cực với giá trị IC 50 là
483,32±3,58 µg/mL; trong khi phân đoạn không phân cực cho giá trị IC 50 là
654,15±8,68 µg/mL.
 Phương pháp pha lỗng đưa ra kết luận phân đoạn phân cực cho hoạt tính kháng
vi sinh vật cao hơn phân đoạn không phân cực với giá trị MIC ở các chủng vi
khuẩn Staphylococcus aureus (MRSA), Methicillin-sensitive Staphylococcus
aureus (MSSA) và Enterococcus faecalis (E.faecalis) là < 4000 µg/mL; trong
khi phân đoạn không phân cực cho giá trị MIC là > 5000 µg/mL.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................I
TĨM TẮT LUẬN VĂN...............................................................................................................II
MỤC LỤC...................................................................................................................................III
DANH MỤC HÌNH......................................................................................................................V
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................................VI
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................................VII
LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................................VIII
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................................1
1.1 DẦU DỪA........................................................................................................................1
1.1.1 Nguồn gốc.................................................................................................................1
1.1.2 Phân loại...................................................................................................................2
1.1.3 Thành phần và tính chất.........................................................................................3
1.1.4 Ứng dụng..................................................................................................................5
1.2 ENZYME LIPASE.........................................................................................................6
1.2.1 Khái niệm.................................................................................................................6

1.2.2 Nguồn gốc.................................................................................................................6
1.2.3 Cấu trúc và tính chất enzyme lipase Porcine pancreas.......................................7
1.2.4 Ứng dụng..................................................................................................................8
1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN XÚC TÁC ENZYME LIPASE.......................................8
1.3.1 Định nghĩa................................................................................................................8
1.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme lipsase.......................................................................10
1.3.3 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân.....................................................................12
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM................................................................................................14
2.1 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.............................................................14
2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ.................................................................14
2.2.1 Nguyên liệu.............................................................................................................14
2.2.2 Hóa chất.................................................................................................................16
2.2.3 Thiết bị...................................................................................................................16

iii


2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................................16
2.3.1 Khảo sát nguyên liệu dầu dừa..............................................................................16
2.3.2 Phương pháp kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH.............................................20
2.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi sinh vật...........................................22
2.4 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM.....................................................................................26
2.4.1 Khảo sát tính chất ban đầu của nguyên liệu.......................................................26
2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân dầu dừa bằng xúc tác enzyme Lipase..........26
2.4.3 Chiết tách sản phẩm sau phản ứng thủy phân...................................................30
2.4.5 Xác định khả năng kháng vi sinh vật của sản phẩm thủy phân.......................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.................................................................................34
3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU DẦU DỪA...................................................................34
3.2 KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG OXY HĨA PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA SẢN
PHẨM THỦY PHÂN.........................................................................................................34

3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu và đệm..........................................................................35
3.2.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm......................................................................36
3.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme và cơ chất...............................................................37
3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................................................38
3.2.5 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm ở điều kiện phản ứng tối ưu
..........................................................................................................................................38
3.3 KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA SẢN
PHẨM THỦY PHÂN.........................................................................................................41
3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu và đệm..........................................................................41
3.3.2 Ảnh hưởng của pH đệm........................................................................................42
3.3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme và cơ chất...............................................................42
3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................................................43
3.3.5 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật sản phẩm ở điều kiện phản ứng tối ưu 44
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ.............................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................48
PHỤ LỤC.....................................................................................................................................50

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cây dừa ở Việt Nam........................................................................................1
Hình 1.2 Cấu trúc lipase và mơ hình trung tâm xúc tác.................................................7
Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của enzyme thủy phân lipase................................................11
Hình 2.1 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hóa................................20
Hình 2.2 Thực hiện cấy vi sinh vật lên dĩa thạch.........................................................26
Hình 2.3 Quy trình thủy phân dầu dừa sử dụng enzyme lipase....................................28
Hình 2.4 Sơ đồ chiết thu acid béo tự do.......................................................................32
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm (v/v) lên phần trăm bắt gốc DPPH.................35
Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên phần trăm bắt gốc DPPH.................36

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:cơ (%, w/v) chất lên phần trăm bắt gốc DPPH 37
Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ (oC) lên phần trăm bắt gốc DPPH..........................38
Hình 3.5 Phần trăm bắt gốc DPPH của phân đoạn phân cực.......................................39
Hình 3.6 Phần trăm bắt gốc DPPH của phân đoạn khơng phân cực.............................39
Hình 3.7 Phần trăm bắt gốc DPPH của Acorbic acid...................................................40

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Chỉ tiêu chất lượng của dầu dừa Tin Vui do nhà sản xuất cung cấp..........................15
Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát tính chất dầu dừa........................................................34
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm (v/v) lên đường kính vùng ức chế..............................41
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH đệm lên đường kính vùng ức chế...............................................42
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:cơ chất lên đường kính vùng ức chế...........................43
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên đường kính vùng ức chế của phân đoạn acid béo........44
Bảng 3.6 Khảo sát nồng độ mẫu acid béo lên từng vi sinh vật................................................45

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DPPH: 1,1 – diphenyl-2-picrylhydrazyl
MIC: minimum bactericidal concentration
MBC: minimum inhibitory concentration
MHA: Mueller-Hinton Agar
NA: Nutrient Agar
LPP: Lipase Porcine pancrreas
NB: Nutrient Broth

vii


LỜI MỞ ĐẦU
Từ xưa, dừa là loài cây rất thân thuộc với người Việt chúng ta, đặc biệt là người dân
Nam bộ, khơng những là một loại quả có thể giải khát trong những ngày nắng nóng,
mà tất cả các bộ phân của cây dừa là nguồn nguyên liệu cho các ngành mỹ phẩm, thực
phẩm, mỹ nghệ và một số ngành khác. Trên thị trường, sản phẩm dầu dừa được sử
dụng chủ yếu để chăm sóc sức khỏe và làm đẹp điển hình như dưỡng tóc, chống rạn
da, dưỡng ẩm, tinh dầu massage,… Tuy nhiên để mở rộng ứng dụng của dầu dừa vào
thực phẩm chức năng hay bảo quản thực phẩm thì cần nghiên cứu sâu hơn nữa.
Thành phần chủ yếu của dầu dừa là các acid béo bão hịa – đa số là Triglyceride chuỗi
trung bình. Ngồi việc có khả năng cung cấp năng lượng cho cơ thể một cách nhanh
chóng thì nhóm hoạt chất này đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như
tính kháng khuẩn, tính kháng oxy hóa, có thể được sử dụng trong cơng nghệ thực
phẩm và dược phẩm. Vì vậy các nghiên cứu về dầu dừa đang được dần mở rộng và
chuyên sâu hơn.
Mặc dù thủy phân bằng phương pháp hóa học cho hiệu suất cao, tuy nhiên phương
pháp này không đảm bảo được độ tinh khiết cho sản phẩm do trong quá trình thực hiện
sinh ra sản phẩm phụ và qui trình này thường tốn nhiêu năng lượng và địi hỏi các lị
phản ứng tốn kém. Nhằm vào mục đích, tăng độ tinh khiết của sản phẩm đầu ra để có
thể làm nguyên liệu cho các sản phẩm yêu cầu gắt gao như dược phẩm, mỹ phẩm hay
công nghệ thực phẩm thì thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase là một giải pháp hợp
lý. Với ưu điểm enzyme Porcine pancreas có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất trong
điều kiện nhiệt độ, pH nhất định, nên sản phẩm thu được có độ tinh sạch cao, ngồi ra
phản ứng diễn ra ở điều kiện áp suất khí quyển và nhiệt độ thường, cho nên phương
pháp này cũng rất thân thiện với mơi trường.
Do đó, trong luận văn này, chúng tơi nghiên cứu và khảo sát ảnh hưởng của các điều
kiện thủy phân lên hoạt tính sinh học của sản phẩm. Từ đó, đưa ra điều kiện tối ưu của
phản ứng để sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt nhất.

viii


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 DẦU DỪA
1.1.1 Nguồn gốc
- Tên khoa học của dừa: Cocos nucifera.
- Bộ: Arecales
- Họ: Arecaceae (họ Cau)
- Chi: Cocos

Hình 1.1 Cây dừa ở Việt Nam

Dừa là một loại cây lớn, thân đơn trục (nhiều khi gọi là nhóm thân cau dừa) có thể cao
tới 30 m, với các lá đơn xẻ thùy lông chim 1 lần, cuống và gân chính dài 4-6 m các
thùy với gân cấp 2 có thể dài 60-90 cm; lá kèm thường biến thành bẹ dạng lưới ôm lấy
thân; các lá già khi rụng để lại vết sẹo trên thân.
Nguồn gốc của cây dừa chưa được biết đến rõ ràng, có lẽ vì dừa đã được có mặt rộng
rãi ở khắp các khu vực nhiệt đới của thế giới từ rất nhiều năm trước đây. Dừa được cho
là có nguồn gốc từ khu vực ven biển của Đông Nam Á (Malaysia, Indonesia,
Philippines) và Melanesia. Dừa hiện nay được trồng khá phổ biến trên toàn thế giới ở
nhiều loại đất. Và dừa đã trở thành thực vật quan trọng trong đời sống cũng như kinh
tế của người dân ở các quốc gia như: Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philippines, Ấn
Độ, Sri Lanka, Kenya, Madagascar, Mozambique, Ecuador, Brazil, Mexio,
Venezuela,...
Dầu dừa là sản phẩm chính từ dừa, được thu từ cơm của quả dừa; là sản phẩm có giá
trị dinh dưỡng cao, có cơng dụng làm thực phẩm, dược phẩm,... cung cấp lượng lớn
các acid béo bão hịa chuỗi trung bình cho cơ thể con người .
1.1.2 Phân loại

1


Dầu dừa hiện nay khá đa dạng và chủ yếu được phân loại theo quy trình sản xuất, trên
thế giới có thể kể đến các loại hình sản xuất dầu dừa sau:
 Phương pháp khô: Cơm dừa khô sẽ được ép và chiết dung môi, thời hạn sử
dụng thấp, màu sắc và hương của dầu dừa được sản xuất bằng phương pháp này
không phù hợp để sử dụng trong mỹ phẩm hoặc thực phẩm.
 Phương pháp ướt: Đối với phương pháp này thì cơm dừa tươi sẽ được ép lấy
phần nước, cịn gọi là nước cốt dừa. Phần protein có trong nước cốt dừa sẽ gắn
kết phần dầu và phần nước tạo thành một thể sữa (emulsion) và từ thể sữa này
phần dầu sẽ được tách ra khỏi nước. Phương pháp truyền thống là nấu (thắng),
hay còn được gọi là phương pháp nấu thủ công mà hiện nay nhiều người vẫn
thực hiện tại nhà. Nhưng đối với sản xuất công nghiệp với một số lượng lớn thì
phương pháp nấu dầu này khơng cịn được sử dụng mà thay vào đó là sử dụng
máy quay li tâm để xử lí sản phẩm đã được sơ chế bằng nhiệt độ (nóng và lạnh),
axit, muối, enzim, điện,... hoặc kết hợp một hoặc nhiều cách trên.
 Phương pháp RBD tinh chế, lọc, khử mùi: Đối với phương pháp RBD này cơm
dừa khô được ép bằng sức nước kèm thêm nhiệt độ cho ra phần dầu. Phần dầu
thơ này hồn tồn khơng tiêu hố được vì chứa các chất ơ nhiễm và cần được
xử lí thêm bằng nhiệt độ và phương pháp lọc.
 Phương pháp Hydro hoá: Để tăng nhiệt độ hoá lỏng của dầu dừa, người ta đã sử
dụng phương pháp Hydro hoá các chất béo đơn/đa khơng no có trong dầu dừa.
Q trình này làm cho một phần axit béo đơn/đa không no trở thành chất béo
chuyển hoá và làm tăng mức nhiệt độ hoá lỏng của dầu dừa từ 24 °C lên 3640 °C.
 Phương pháp chưng cất phân đoạn: Với phương pháp chưng cất phân đoạn, các
loại axit béo được tách riêng biệt để phù hợp với nhu cầu sử dụng.

1.1.3 Thành phần và tính chất

2


Dầu dừa thu được từ cơm của quả dừa, là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, cung
cấp lượng lớn các acid béo bão hịa chuỗi trung bình cho cơ thể .
Trong dầu dừa chủ yếu chứa các acid béo bão hịa (khoảng 92,1%), trong đó có
khoảng 62% là các acid béo chuỗi trung bình (6-12 nguyên tử), thành phần các acid
béo có trong dầu dừa được thể hiện ở bảng 1.1.
Bảng TỔNG QUAN.1 Thành phần và hàm lượng các acid béo trong dầu dừa tinh luyện
của công ty TNHH dầu dừa Tin Vui

Acid béo

Hàm lượng
(%)

Caproic acid, methyl ester C6:0

0.78

Octanoic acid, methyl ester C8:0

9.47

Decanoic acid, methyl ester C10:0

7.41

Dodecanoic acid, methyl ester C12:0

54.02

Tetradecanoic acid, methyl ester C14:0

18.79

Hexadecanoic acid, methyl ester C16:0

7.87

Octadecanoic acid, methyl ester C18:0

2.72

Cis-9-Octadecenoic acid, methyl ester C18:1

4.39

Cis- 9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester C18:2

0.63

Dầu dừa bao gồm các phân tử chất béo hay được gọi là các acid béo chuỗi trung bình
(Medium chain fatty acids – MCFA). Trong khi phần lớn các chất béo trong chế độ ăn
uống của con người được tạo nên hầu hết bởi các axid béo chuỗi dài (Long chain fatty
acids – LCFA). Sự khác biệt chính giữa MCFA và LCFA là chiều dài của chuỗi carbon
tạo nên mạch chính của acid béo. MCFA có chiều dài chuỗi từ 6 đến 12 nguyên tử
Carbon còn LCFA có chiều dài chuỗi từ 14 nguyên tử Carbon trở lên.
Chiều dài của chuỗi Carbon ảnh hưởng nhiều đến tính chất vật lý và hóa học của dầu.
Khi tiêu thụ, tùy thuộc vào kích thước của chuỗi Carbon mà các q trình chuyển hóa

trong cơ thể đối với mỗi acid béo là khác nhau. Do đó, các hiệu ứng sinh lý của MCFA
trong dầu dừa khác với LCFA trong chế độ ăn hàng ngày .
3


Tất cả các MCFA trong dầu dừa đều là acid béo bão hịa, do vậy mà nó có một số tính
chất hóa lý:
- Nhiệt độ nóng chảy tương đối cao. Trên 24 oC, dầu dừa là một chất lỏng không
màu. Dưới nhiệt độ này, dầu dừa sẽ đặc lại thành chất rắn màu trắng .
- Bền với nhiệt độ nên rất lý tưởng khi dùng để nấu nướng và chiên xào.
- Điểm khói của dầu dừa ở khoảng 182 oC.
- Mùi: dầu dừa có mùi dừa thơm dịu.
- Dầu dừa không tan trong nước. Ở nhiệt độ trên nhiệt độ nóng chảy, dầu dừa có thể
tan hồn tồn với hầu hết các dung môi không phân cực như petroleum, benzene,
carbon tetrachloride. Dầu dừa tan trong ethanol tốt hơn so với hầu hết các loại dầu
khác.
- Do dầu dừa có thành phần lớn là chất béo bão hịa nên có khả năng làm chậm q
trình oxy hóa, nên có khả năng chống mùi ơi.
Ngồi ra, trong dầu dừa cịn có một số thành phần có hoạt tính sinh học có giá trị khác
như:
- Acid béo bão hòa: đặc biệt là acid lauric có đặc tính kháng khuẩn tốt, đã được
nghiên cứu trong nhiều cơng trình .
- Tocopherols: là chất chống oxi hố tự nhiên được tìm thấy trong hầu hết các loại
dầu thực vật. Trong dầu dừa, hàm lượng tocopherols tương đối thấp, khoảng 50
ppm (Taylor 1981).
- Phenolic: Các acid phenolic được tìm thấy trong dầu dừa là acid protocatechuic,
acid vanillic, acid syringic, acid p-coumaric, acid caffeic và acid ferulic. Tùy theo
phương pháp sản xuất dầu dừa mà hàm lượng acid phenolic trong mỗi dầu là khác
nhau . Thành phần phenolic này đóng vai trị là chất chống oxi hóa trong dầu dừa.
1.1.4 Ứng dụng

Theo Elias C. Canapi, và cộng sự (2005), dầu dừa có một số ứng dụng sau:
Dầu dừa được sử dụng như là sản phẩm thực phẩm và phi thực phẩm. Dầu dừa là
nguyên liệu để sản xuất thực phẩm y học và các thức ăn cho trẻ sơ sinh.
4


 Sản phẩm ăn được
Dầu dừa RBD được sử dụng rộng rãi như dầu chiên. Mứt dừa được dùng như món
tráng miệng, chất phết lên bánh mì và bánh gạo. Dầu dừa được phun lên bánh cracker
và bánh cookie nhằm tăng thời gian bảo quản của những sản phẩm này vì khả năng
chống lại mùi ơi do oxy hố. Dầu dừa được sử dụng rộng rãi như một chất béo trong
kem và là một thành phần trong kem của bánh biscuit.
 Thực phẩm y tế và thức ăn cho trẻ sơ sinh
Acid béo chuỗi trung bình, chủ yếu là C8 và C10, thu được bằng cách thủy phân dầu
dừa. Triglyceride chuỗi trung bình được hấp thụ và oxy hóa nhanh chóng với năng
lượng khoảng 34,7 kJ/g. Triglyceride chuỗi trung bình được coi như là nguồn bổ sung
chính của chất béo khơng bão hồ đa trong một số cơng thức thực phẩm trong y học và
thực phẩm cho trẻ sơ sinh.
 Sản phẩm phi thực phẩm
Một sản phẩm phi thực phẩm thường được sử dụng có nguồn gốc từ dầu dừa là xà
phịng.
Một trong những ứng dụng chính của acid béo trong cặn dầu từ quá trình lọc dầu là
trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Các thành phần béo này giúp tăng lượng calo của
thức ăn.
Acid béo trong dầu dừa và glycerol được tạo ra trong quá trình thủy phân của chất béo.
Các acid béo trong dầu dừa ngoài việc được sử dụng trực tiếp cịn được chuyển hố để
tạo ra các dẫn xuất khác. Các dẫn xuất của acid béo từ dầu dừa là nguyên liệu cho
nhiều loại sản phẩm phi thực phẩm. Các acid béo hoặc methyl ester của acid béo sau
quá trình chưng cất tạo thành nguyên liệu đầu vào cho ngành cơng nghiệp hóa dầu.
Các sản phẩm phụ, glycerol được tinh chế bằng cách chưng cất chân không. Các sản

phẩm tinh khiết được dùng như một thành phần trong dược phẩm, kem đánh răng ,
nguyên liệu trong sản xuất nitroglycerol. Ester của trimethylpropan hoặc
pentaerythritol và acid béo C8-C10 là thành phần chính trong chất bơi trơn. Phản ứng
ester hóa của acid béo C8-C10 với glycerol tạo thành chuỗi triglyceride trung bình
giúp cho dầu ổn dịnh và có độ nhớt thấp. Triglyceride chuỗi trung bình được sử dụng
5


trong xử lý bề mặt của trái cây khô và là một nguồn chất béo năng lượng cao, dễ tiêu
hóa. Phản ứng ester hóa của acid béo với rượu đơn chức, chẳng hạn như isopropanol
và acid myristic tạo thành isopropyl myristate - một thành phần quan trọng trong mỹ
phẩm. Monoglyceride được ứng dụng làm chất nhũ hoá trong thực phẩm, chất tách
khuôn, chất bôi trơn trong công nghiệp sản xuất đồ nhựa .
1.2 ENZYME LIPASE
1.2.1 Khái niệm
Enzyme lipase (acylhydrolases triacylglycerol, EC3.1.1.3) là một loại enzyme xúc tác
thủy phân các triglyceride thành các axit béo tự do và glycerol. Ngoài phản ứng thủy
phân, lipase cũng tham gia vào các phản ứng như este hóa, alcol hóa, acid hóa,... trong
mơi trường .
1.2.2 Nguồn gốc
Enzyme lipase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được tìm thấy trong nhiều lồi
động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm men và nấm. Lipase từ nguồn gốc khác nhau rất
khác nhau về tính chất vật lý và sinh hóa như axit béo đặc trưng, độ ổn định nhiệt, pH
tối ưu,... Enzyme vi sinh vật có nhiều lợi ích hơn so với các enzyme có nguồn gốc từ
thực vật và động vật vì nó đa dạng, có thể đạt được sản lượng cao, theo tác di truyền
dễ thực hiện, khả năng cung cấp thường xuyên và tăng trưởng nhanh trên các môi
trường rẻ tiền. Mặt khác enzyme vi sinh vật cũng ổn định, an toàn và dễ sản xuất hơn
so với các enzyme thực vật, động vật tương ứng .
1.2.3 Cấu trúc và tính chất enzyme lipase Porcine pancreas
Lipase từ các nguồn khác nhau (động vật, thực vật, vi sinh vật) có sự khác biệt lớn và

nguồn lipase rẻ nhất được phân lập từ tụy lợn (lipase Porcine pancreas - LPP), đây là
nguồn quan trọng để thu nhận enzyme lipase và lipase cũng là enzyme được phân lập
đầu tiên từ nguồn này. Tuy nó có phạm vi sử dụng nhỏ hơn khi so sánh với lipase vi
sinh vật, nhưng lipase Porcine pancreas vẫn có độ ổn định cao và hoạt động được
trong môi trường khan.

6


LPP là một protein hình cầu được tạo thành từ một chuỗi duy nhất gồm 449 amino
acid. Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định, hình 1.2 .

Hình 1.2 Cấu trúc lipase và mơ hình trung tâm xúc tác

- Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn
amino acid 1 – 336. Bộ ba xúc tác Ser, Asp và His lần lượt ở tại vị trí amino acid
153, 177 và 264.
- Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này
tương tác với colipase. Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử
khoảng 10 kDa.
Cấu trúc tinh thể của enzyme LPP có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác. Vị trí
của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác. Vùng võng rộng nhất
trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa Cys238 và
Cys262. Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng
N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt
7


động. Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase. Khi nắp này
mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động .

1.2.4 Ứng dụng
Enzyme lipase có khả năng tham gia vào phản ứng thủy phân, ngoài ra phản ứng qua
trung gian lipase có thể đảo ngược, do đó các enzyme có thể xúc tác cho q trình este
hóa glycerol từ mono, di và triglycerides. Tính linh hoạt này làm cho enzyme lipase có
ứng dụng tiềm năng trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm, chất tẩy rửa , dược
phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và giấy .
Enzyme từ vi sinh vật được sử dụng trong xử lý nước thải (tẩy dầu mỡ của lipid bị tắc
cống), dược phẩm (độ phân giải của các hỗn hợp racemic), sữa (thủy phân của sữa,
chất béo), da (loại bỏ các chất béo từ da thú) , chất tẩy rửa (loại bỏ dầu/vết chất béo)
và y tế (cơng cụ chẩn đốn triglyceride trong máu),...
1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN XÚC TÁC ENZYME LIPASE
1.3.1 Định nghĩa
Việc sản xuất các acid béo bằng quá trình thủy phân từ chất béo và các loại dầu tự
nhiên là một phần rất quan trọng trong việc khai thác kinh tế từ các nguyên liệu tái tạo
tự nhiên. Những sản phẩm này bao gồm các loại dầu từ ngô, hạt cả dầu, hướng dương,
cọ, dừa, ô liu,... và chất béo động vật như mỡ.
Dầu và chất béo là một phần của một nhóm các hợp chất được gọi là este béo hoặc
chất béo trung tính, và sự thủy phân của chúng về cơ bản là gồm những phản ứng với
nước để sản xuất ra các acid béo tự do có giá trị và glycerol. Có 3 cách chính hiện nay
đang được sử dụng cho quá trình thủy phân sản xuất acid béo: tách hơi nước áp lực
cao, thủy phân kiềm và thủy phân xúc tác enzyme.
Trong kỹ thuật thủy phân xúc tác enzyme, dung dịch nước của enzyme lipase sẽ được
trộn với dầu để hình thành hệ phân tán lỏng – lỏng. Các enzyme lipase sẽ là chất xúc
tác cho phản ứng thủy phân dầu thành các acid béo tự do và glycerol tại bề mặt phân
pha giữa hai chất lỏng với hiệu suất phản ứng: cho ra 1 mole glycerol và 3 mole acid
béo ứng với mỗi mole triglycerides. Triglycerides ở đây được gọi là chất béo, khơng
tan trong pha nước, do đó các phản ứng thủy phân diễn ra ngay trên bề mặt giao của
8

pha nước và pha dầu. Vì vậy, để tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha hay tăng độ bền
của hệ nhũ tương thì chất nhũ hóa có thể được thêm vào để góp phần làm ổn định hệ
phản ứng, nâng cao hiệu suất của phản ứng .
 Ưu điểm: Nó giải quyết được những hạn chế của phản ứng thủy phân khác.
- Tách hơi nước áp lực cao: Vì với nhiệt độ và áp suất cao (thường khoảng 250 oC,
70 bar) cần thiết để tách hơi nước sẽ không thể áp dụng để thủy phân các
triglycoside nhạy cảm, không liên hợp (có thể bị phân hủy do nhiệt ),...
- Thủy phân kiềm: Chi phí năng lượng cao và xà phịng hình thành cần phải có tính
acid, từ đó sản xuất các sản phẩm acid béo.
- Phản ứng xúc tác enzyme thủy phân triglyceride có thể thực hiện ở mơi trường
xung quanh (thường là 35 oC và áp suất khí quyển), đem đến lợi ích về tiết kiệm
năng lượng, sử dụng năng lượng một cách hiệu quả hơn so với các q trình thủy
phân khác.
- Sản phẩm thu được có độ tinh sạch cao, hàm lượng tạp chất chiếm tỷ lệ rất nhỏ và
thân thiện với môi trường hơn so với các xúc tác hóa học.
 Nhược điểm:
- Vì thời gian thủy phân của một mẻ là từ 2 – 3 ngày nên khó khăn cho việc thực
hiện phản ứng liên tục.
- Giá thành enzyme vẫn cịn cao.
- Khó khăn trong việc lặp lại quá trình động lực với một hệ nhũ tương vì sự ổn định
của nhũ tương thấp và nó ảnh hưởng nhiều bởi các phương pháp chuẩn bị.
1.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme lipsase
Enzyme lipase tham gia vào phản ứng thủy phân triacylglycerol tạo thành các acid béo
tự do được thể hiện trên hình 1.3.

9


Khi một phân tử triacylglycerol gặp trung tâm hoạt động (vùng kỵ nước) của enzyme
lipase, nó đi vào tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser152, His263 và Asp176. Lúc này, bộ ba

xúc tác sẽ thực hiện phản ứng thủy phân. Khi một trong số các nguyên tử oxy ở phần
cuối của Asp176 liên kết với một nguyên tử nitơ trong vòng Histidin bằng liên kết
hydro, giúp cho His263 được định vị để nguyên tử nitơ khác của nó tạo liên kết hydro
với nhóm hydroxyl của Ser152. Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từ liên kết
cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, với định vị này thì enzyme sẵn sàng
để hoạt động.
Bước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và cacbon
glycerol thứ nhất. Tác nhân ái nhân là nhóm OH - của serin mang điện tích âm tấn cơng
vào trung tâm tích điện dương của cacbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa
Cacbon glycerol thứ nhất và Oxy của este yếu đi. Oxy trong liên kết este trở nên linh
động và nó được thêm một proton H+ vào từ nhóm OH- của Ser152 để trung hịa điện
tích âm của nó. Khi oxy nhận được H +, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình
thành và hồn tồn tự do. Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy
của Ser152, tuy nhiên liên kết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của nó.
Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển của
diglyceride từ nửa đang chứa glycerol. Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần một
nhóm hydroxyl để liên kết với cacbon đầu tiên của glycerol và một ion H + để thêm một
proton trở lại vào oxy của Ser152. Một phân tử nước ở mơi trường ngồi cung cấp các
thành phần cần thiết này. Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân ly thành
H+ và OH-. Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H + với OH- của hai phân tử nước khác
nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành. Ion hydronium có một momen lưỡng
cực rất lớnHình
và hoạt
động
như một
ái nhân
lên cacbon
đầu tiên. Thời
TỔNG
QUAN.1

Cơtác
chếnhân
xúc tác
của enzyme
thủyglycerol
phân lipase
điểm này, oxy của Ser152 rời khỏi nhóm. Chuỗi bên cạnh tích điện âm của Ser152
nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H + từ nước. Lúc này, sản phẩm diglyceride
được hình thành. Liên kết hydro giữa nitơ thơm của His263 và nhóm hydroxyl trên
Ser152 được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng
khác.

10


Phản ứng thủy phân tiếp theo xảy ra để xúc tác diglyceride vừa mới hình thành thành
một acid béo và một monoglyceride. Cơ chế trong trường hợp này giống hai bước như
với thủy phân triglyceride, nhưng các các tấn công ái nhân sẽ được thực hiện trên
cacbon thứ ba của glycerol. Cơ chế này cho ra một monoglyceride và acid béo mới, và
enzyme chuẩn bị tiến đến triglyceride khác.
1.3.3 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân
Acid béo có trong dầu dừa ngồi những ứng dụng trực tiếp cịn được chuyển đổi tạo
thành các dẫn xuất khác nhau, và phạm vi ứng dụng của những chất này là rất rộng
trong ngành cơng nghiệp hóa hữu cơ. Các acid béo khác nhau có thể được trải qua các
quy trình khác nhau để tạo ra các dẫn xuất khác nhau. Sau đây là những ứng dụng phổ
biến của các sản phẩm thông thường:
 Các acid béo: Một lượng lớn các acid béo của dầu dừa được sử dụng là thành
phần chính trong các nhà máy chế biến chất tẩy rửa vệ sinh, làm xà phịng,
triglycerid chuỗi trung bình, các ester polyol, các alkanolamide…Trong đó acid
lauric là nguyên vật liệu mong muốn cho ngành cơng nghiệp hóa hữu cơ trên

tồn thế giới, đặc biệt là trong sản xuất xà phòng và chất tẩy rửa .
Acid lauric: ngồi việc đóng vai trị quan trọng trong ngành cơng nghiệp hóa
hữu cơ thì acid lauric cịn có một tính chất quan trọng khác mà những năm gần
đây nó khá được quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực y học và mỹ phẩm là khả
năng kháng khuẩn. Khi acid lauric được hấp thụ vào cơ thể nó sẽ chuyển hóa
thành monolaurin – là một hợp chất có khả năng kháng virus, vi khuẩn và nấm
bằng cách phá hủy lớp màng lipid của chúng .
Một nghiên cứu của Teruaki Nakatsuji và cộng sự (2009) về khả năng kháng
khuẩn của acid lauric đối với Propionibacterium acnes trong điều trị viêm mụn
Vulgaris đã cho thấy khả năng kháng khuẩn của acid lauric cao hơn 15 lần so
với benzoyl peroxide (BPO)- chất có hiệu quả đối với điều trị mụn trứng cá.
Ngồi ra nghiên cứu cịn cho thấy acid lauric khơng gây độc trong quá trình sử
dụng, đặc hiệu đối với khuẩn mụn Propionibacterium acnes mà không ảnh
hưởng tới u nang tuyến bã nhờn trên da .

11


 Các ester acid béo: Các acid béo khác nhau có thể được ester hóa với mono,
polyol tạo ra một lượng ester khác nhau. Các ester polyol của trimethylol
propane hoặc pentaerythritol và các acid béo C8–C10 là cơ sở tạo ra dầu bơi
trơn có hiệu suất cao. Triglycerid chuỗi trung bình được sử dụng như là dung
mơi cho các chất tạo hương , sơ chế bề mặt cho trái cây khơ, năng lượng cao,
chế độ ăn dễ tiêu hóa.
Ester hóa với monoalcohol, ví dụ như isopropanol và acid myristic tạo ra
isopropyl myristate, đây là một thành phần quan trọng trong mỹ phẩm. Các
monoester glyceryl và sáp ester được ứng dụng như là các chất nhũ hóa trong
thực phẩm, và là chất bôi trơn cho ngành công nghiệp nhựa.
 Các alcohol béo: là một sản phẩm hóa chất cơ bản được chế biến bằng cách
hydro hóa áp suất cao của các acid béo hoặc các ester methyl acid béo. Đa số

các rượu béo được sản xuất bằng một quá trình liên tục kế tiếp nhau, chẳng hạn
như : sulfate hóa, ethoxyl hóa, amine hóa, phosphat hóa, sulfit hóa… Rượu béo
có thể được phân tách gián đoạn để cho ra các phân đoạn với những ứng dụng
khác nhau như: rượu béo C8-C10 được biết đến là loại rượu dẻo (dạng lỏng) có
khả năng hịa tan tốt và làm dung mơi cho mực in và sơn mài, rượu C12-C14 lại
là phụ gia cho chất bơi trơn trong việc hình thành nên dầu thủy lực, rượu béo
C16-C18 lại là yếu tố tạo nên độ đặc, độ sệt trong các loại kem, son môi, bột
nhão và nước đánh bóng .
 Các ether polyglycol: Các ether polyglycol được sản xuất bởi các rượu béo với
ethylene oxide có tính chất giữ ẩm tốt, có khả năng tạo bọt…được sử dụng như
phụ kiện dệt may, trong dung dịch rửa chén, dung dịch tẩy dầu mỡ.
 Các amine béo: Các amine béo là dẫn xuất nitơ quan trọng của acid béo, chúng
được tạo ra bởi phản ứng giữa các acid béo với amoniac và hydrogen, được sử
dụng làm mềm vải, và diệt vi sinh vật. Oxide amine béo làm mềm cho da với
tính chất làm sạch và tạo bọt tốt, được ứng dụng như là một thành phần trong
dầu gội đầu .

12


CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Sau khi phân tích tài liệu, thấy rõ được những ưu điểm nổi trội của phương pháp thủy
phân bằng enzyme lipase Porcine pancreas cho nên mục tiêu luận văn: nghiên cứu qui
trình tối ưu thủy phân dầu dừa bằng xúc tác enzyme lipase Porcine pancreas để đạt
được sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt nhất.
Để đạt được mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:
 Chuẩn bị và đánh giá tính chất của nguyên liệu.
 Thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase Porcine pancreas.
 Tách phân đoạn sản phẩm sau thủy phân.

 Khảo sát khả năng kháng oxy bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH của sản
phẩm sau thủy phân ở các điều kiện phản ứng khác nhau.
 Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của sản phẩm sau thủy phân ở các diều
kiện phản ứng khác nhau.
2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.2.1 Nguyên liệu
 Dầu dừa
Nguyên liệu nghiên cứu là Dầu dừa tinh luyện Tin Vui, được cung cấp bởi công ty
TNHH MTV dầu dừa Tin Vui (Việt Nam) với các thông số được trình bày ở bảng 2.1

13


Bảng THỰC NGHIỆM.2 Chỉ tiêu chất lượng của dầu dừa Tin Vui do nhà sản xuất cung

cấp.
Giới hạn

Kết quả

phát hiện

thử nghiệm

0.01

Khơng phát hiện

STT

Tên chỉ tiêu

1

Hàm lượng tạp chất tính theo khối lượng, %

2

Chỉ số peroxide, meq/kg

-

1.8

3

Chỉ số xà phịng hóa,

-

250

-

0.1

-

0.1

0.03

Khơng phát hiện

0.01

Không phát hiện

0.03

Không phát hiện

0.01

Không phát hiện

4
5

Hàm lượng acid béo tự do theo acid oleic
tính theo khối lượng, %
Chỉ số acid, mg KOH/g
Hàm lượng aflatoxin, µg/kg
-

6

-

B1

B2
G1
G2

7

Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/g

-

< 10

8

Coliform, CFU/g

-

< 10

9

E.Coli, CFU/g

-

< 10

10

Staphylococcus aureus, CFU/g

-

< 10

11

Tổng số nấm men và nấm mốc, CFU/g

-

< 10

 Chế phẩm enzyme lipase Porcine pancreas:
Chế phẩm dạng bột thu được từ tuyến tụy lợn, Type II hiệu L3126 do hãng SigmaAldrich (Mỹ) cung cấp.
Một đơn vị hoạt độ riêng của enzyme (U) được định nghĩa là lượng protein của
enzyme giải phóng ra một µmol acid béo từ sự thủy phân cơ chất là dầu olive trong
1giờ tại pH 7,7, nhiệt độ 37 oC sẽ cho hoạt độ là 100 – 500 unit/mg protein. Nếu sử
dụng triacetin làm cơ chất tại pH 7,4, nhiệt độ 37 oC trong 1 giờ sẽ cho hoạt độ 30-90
unit/mg protein. [hãng Sigma-Aldrich (Mỹ)]
2.2.2 Hóa chất
14


- Mononatri orthophotphate (NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc)
- Dinatri hydrophosphate (Na2HPO4.12H2O) (Trung Quốc)
- n – Hexan (Trung Quốc)
- Diethyl Ether (Trung Quốc)
- KOH (Trung Quốc)

- DPPH (1,1-Diphenyl - 2 - picrylhydrazyl) (Sigma Chemical Co.)
- Methanol (Trung Quốc)
- Mueller-Hinton Agar (Ấn Độ)
- Nutrient Broth (Merck)
Và một số hóa chất cần thiết khác.
2.2.3 Thiết bị
Thiết bị cơ bản gồm: Cân kỹ thuật 4 số, cân phân tích, tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm (37oC),
máy cô quay, máy đo độ hấp thu UV-Vis, máy đồng hòa áp suất cao, máy khuấy từ
gia nhiệt, nồi hấp tiệt trùng, và một số thiết bị cần thiết khác.
Dụng cụ cơ bản gồm: micropipette (1000; 100; 10 µL), pipette (10; 5; 2; 1 mL), bình
cơ quay (250; 500 mL), nhiệt kế, beaker (500; 200 mL), bình tam giác (1000; 500; 100
mL), bình định mức (100; 10 mL), đũa thủy tinh, ống nhỏ giọt thủy tinh và một số
cụng cụ cần thiết khác.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Khảo sát nguyên liệu dầu dừa
2.3.1.1 Chỉ số acid
 Định nghĩa: Chỉ số acid là số lượng mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự
do trong 1 g chất thử.
 Nguyên tắc: Dùng dung dịch KOH 0.1N để trung hòa các acid tự do trong chất
cần thử, với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.
RCOOH + KOH



RCOOK + H2O
15


Chỉ số acid của dầu mỡ khơng có định, dầu mỡ càng biến chất thì chỉ số acid
càng cao. Các dầu mỡ thực phẩm chỉ số acid càng thấp càng tốt.

 Thực hiện:
- Hoá chất cần thiết:
Dung dịch KOH 0,1 N trong cồn 96 %.
Chỉ thị phenolphtalein (C20H14O4) 1% trong cồn 96 %.
Hỗn hợp dung mơi gồm 1 thể tích etylic và 3 thể tích cồn 95%.
- Cách xác định:
Cân chính xác 3-5 g dầu mỡ (nếu chỉ số axit thấp có thể đến 10 g) cho vào bình cầu
200 mLl, thêm 50 mL dung môi hỗn hợp, lắc đều (nếu chưa hồ tan có thể đun nhẹ
trên nồi cách thủy đến khi hoà tan, lắc đều, làm nguội), cho 2 giọt chỉ thị
phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1 N trong cồn (dùng dung dịch
KOH trong cồn để tránh xảy ra sự xà phịng hóa trong trường hợp hỗn hợp chứa
20% trở lên) cho đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng tươi và màu không mất đi
sau 30 giây.
- Tính kết quả:

AV 

5, 611�(a  b) �x
c

Trong đó: a - số mL dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ở bình thí nghiệm.
b - số ml KOH 0,1N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra.
c - số gam chất béo.
5,611 - số mg KOH trong 1 mL KOH 0,1N.
Có thể biểu thị bằng độ acid, tức là số phần trăm acid béo tự do trong dầu mỡ tính
theo 1 loại acid béo nào đó. Thơng thường người ta tính theo acid oleic vì nó có
nhiều trong hầu hết các loại dầu .
Độ axit = %axit béo tự do = AV. 0,503
2.3.1.2 Chỉ số peroxide
16

 Nguyên tắc: Các peroxyd tạo thành trong quá trình ôi hóa của chất béo, trong
môi trường acid có khả năng phản ứng với KI giải phóng iod
Định phân iod tạo thành bằng dung dịch thiosulfate natri:
2Na2S2O3 +

I2



2NaI

+

Na2S4O6

Chỉ số peroxyd được tính bằng số mili – đương lượng thiosulfate kết hợp hết
với lượng iod được giải phóng.
 Thực hiện:
- Hóa chất cần thiết:
Dung dịch choloroform – acid acetic.
Dung dịch hồ tinh bột 1%.
Dung dịch natri thiosulfate Na2S2O3.
Dung dịch KI bão hòa, được pha mới nhất, làm sạch iod và các chất iod tự do.
- Cách xác định:
Lấy 2 erlen dung tích 250ml. Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2 g dầu, bình 2
(bình kiểm tra) 2 mL nước cất. Cho thêm vào mỗi bình 10 mL dung dịch hỗn hợp
axit axetic và clorofom (tỉ lệ 2:1), 1 mL dung dịch KI mới pha (hoặc một ít tinh thể
KI), đậy nút. Lắc hỗn hợp cẩn thận và đặt vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm 25 mL

nước cất. Cho thêm 0,5 mL dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iod tạo thành
bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu xanh.
- Tính kết quả:
Chỉ số peroxyd được tính theo cơng thức:

PoV 

(V1  V2 ) �N �1000
m

Trong đó: V1 - thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng định phân mẫu thí nghiệm, mL.
V2 - thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng định phân mẫu trắng, mL.
N - nồng độ dung dịch Na2S2O3 đã dùng.
17