CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP QUERCETIN TỪ CÂY HÀNH TÂY BẰNG KỸ THUẬT DÙNG LƯU CHẤT SIÊU TỚI HẠN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG
BỘ MÔN DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP QUERCETIN TỪ
CÂY HÀNH TÂY BẰNG KỸ THUẬT DÙNG
LƯU CHẤT SIÊU TỚI HẠN
Giảng viên hướng dẫn:
ThS. Đỗ Văn Mãi
LỚP ĐẠI HỌC DƯỢC 9B
TIỂU NHÓM 5
Họ và tên các thành viên:
Phan Ngọc An
Lê Nguyễn Thúy Hằng
Trà Thị Thu Hương
Nguyễn Thị Bích Ly
Phạm Thị Ngọc Mai
Nguyễn Minh Tấn
CẦN THƠ, 25-01-2018


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1
PHẦN 1 – TỔNG QUAN..........................................................................................3
1.1. Đại cương về phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn.........................................3
1.1.1 Định nghĩa................................................................................................3
1.1.2 Dụng cụ....................................................................................................3
1.1.3 Nguyên tắc, cơ chế hoạt động...................................................................3
1.1.4. Một số ưu, nhược điểm............................................................................4
1.1.5 Phạm vi ứng dụng.....................................................................................4
1.2 Thành phần hóa học.........................................................................................5

1.2.1 Thành phần hóa học:.................................................................................5
1.2.2.1. Sulphur hữu cơ:................................................................................5
1.2.2.2. Saponin:............................................................................................6
1.2.2.3. Flavonoid:.........................................................................................7
1.2.2.4 Các thành phần khác..........................................................................9
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM....................................................................................10
2.1 Chiết xuất quercitin bằng carbon dioxid siêu tới hạn.....................................10
2.1.1 Nguyên liệu và chất chuẩn:.....................................................................10
2.1.2 Trang thiết bị:.........................................................................................10
2.1.3. Quá trình chiết xuất:...............................................................................11
2.1.4. Hệ thống HPLC phân tích mẫu:.............................................................12
2.1.5. Kết quả và bàn luận:..............................................................................12
2.2 Chiết xuất Quercetin bằng nước siêu tới hạn.....................................................14
2.2.1 Nguyên liệu và thiết bị:...........................................................................14
2.2.2 Quá trình chiết xuất:...............................................................................15
2.2.3. Quy trình phân tích bằng HPLC:...........................................................15
2.2.4 Kết quả và bàn luận...............................................................................16
2.2.4.1 Kết quả chiết xuất bằng nước siêu tới hạn.......................................16
2.2.4.2 So sánh SWE với các phương pháp chiết khác:...............................18
2.3 Kiểm nghiêm nguyên liệu hành tây...............................................................19
i


PHẦN 3 – KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH..............................................................20
3.1. Kết luận........................................................................................................20
3.2. Nhận định.....................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................21

ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MeOH

Methanol

EtOH

Ethanol

CO2

Carbon dioxide

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
performance liquid chromatography)

SFE

Chiết lỏng siêu tới hạn (supercritical
fluid extraction)

Pc

Áp suất tới hạn

SWE

Chiết bằng nước siêu tới hạn
(subcritical water extraction)

DANH MỤC CÁC BẢNG
iii


Trang
Bảng 1.1. γ-Glutamyl peptides trong A.cepa L..........................................................6
Sitosterol...................................................................................................................7
Bảng 1.2 Các thành phần flavonoid trong Hành tây (mg/kg)....................................8
Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành đỏ..............13
Bảng 2.2. Hiệu suất chiết và độ phục hồi của SWE.................................................17
Bảng 2.3. Thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE và nguyên liệu
vỏ củ hành ban đầu..................................................................................................17

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang

Hình 1.1. Bộ dụng cụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn.............................................3
Hình 2.1. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon Dioxide siêu tới hạn.............11
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn....................................14
Hình 2.3 Sắc ký đồ của quercetin từ dịch chiết vỏ củ hành tây...............................16
Hình 2.4 So sánh các phương pháp chiết.................................................................18

v

ĐẶT VẤN ĐỀ
--------Flavonoids là polyphenols có rất nhiều trong trái cây, rau củ, và ngũ cốc.
Flavonoids được chia thành nhiều nhóm nhỏ, chúng bao gồm các anthocyanidins,
chủ yếu tạo các màu đỏ và xanh trong trái cây, nước trái cây, rượu vang và các lồi
hoa; các catechin, có nhiều trong lá trà; các flavonones và flavanone glycosides, tìm
thấy trong cam quýt và mật ong; và các flavon, flavonols và flavonol glycosides, có
nhiều trong lá trà, trái cây, rau củ, mật ong. Flavonoids được biết đến với khả năng
chống oxy hóa, tạo phức với các ion kim loại hoá trị 2, có lợi cho sức khỏe con
người. Các hợp chất này có tác dụng chống lại dị ứng, viêm nhiễm, virus, cao huyết
áp, viêm khớp, và được báo cáo ngăn ngừa đột biến, ung thư và AIDS [15].
Quercetin được nghiên cứu bởi Caltagirone rằng quercetin và apigenin ức chế sự
tăng trưởng, việc xâm lấn và tiềm năng di căn của khối u ác tính [4]. Quercetin có
tiềm năng để trở thành một liệu pháp hóa trị ung thư tuyến tiền liệt như báo cáo của
Xing (2001) [25]. Flavonols này cũng được xem là có chức năng chống oxy hóa
[19]. Có hai nhóm chất chống oxy hóa chính: tổng hợp và tự nhiên. Một trong các
xu hướng quan trọng nhất trong ngành cơng nghiệp thực phẩm hiện nay là nhu cầu
tìm về và sử dụng các chất chống oxy hoá tự nhiên. Chúng an tồn hơn, ít tác dụng
phụ và ít độc tính hơn các chất chống oxy hố tổng hợp.
Củ hành chứa rất nhiều quercetin glucosides (quercetin-3,4'-diglucoside và
quercetin-4'-monoglucoside). Lớp vỏ ngoài cùng của củ hành chuyển sang màu nâu
và khô trong quá trình già đi, và các glycosides của quercetin chuyển dạng thành
quercetin tự do. Herrmann (1976) cũng cho rằng trong củ hành khô chứa chủ yếu là
dạng quercetin tự do hơn là dạng glycoside. Theo Bilyk er al. (1984) thì lớp vỏ khơ
phía ngồi có nhiều quercetin hơn lớp bên trong ở tất cả tám giống hành được
nghiên cứu. Giống cao nhất chứa tới 34,15g quercetin/ kg vỏ hành khô. Các giống
khác chứa từ 1,14 – 16,53g quercetin/kg [11].
Chiết xuất flavonols từ mô hành trong các nghiên cứu ở trên được thực hiện
bằng cách chiết với dung môi methanol. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh

với kỹ thuật này là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý
chất thải methanol, độc tính của methanol cịn lẫn trong sản phẩm,…. Do đó,
phương pháp chiết quercetin một cách nhanh chóng, rẽ tiền và ít độc tính là một yêu
cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn có nhiều lợi thế hơn các
phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải
thiện, tự động hóa và thân thiện với môi trường.

1


Hy vọng bài báo cáo này sẽ cung cấp thêm một số thông tin về chiết xuất bằng
chất lỏng siêu tới hạn, góp phần hiện đại hố các phương pháp chiết xuất các hợp
chất thiên nhiên trong tương lai.

2


PHẦN 1 – TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn
1.1.1 Định nghĩa
Trạng thái siêu tới hạn hình thành khi nhiệt độ áp suất vượt qua điểm tới hạn
(critical point) tại điểm cân bằng lỏng hơi, khi đó chất ở trạng hái siêu tới hạn vừa
có tính chát giống pha lỏng vừa có tính chất giống pha hơi. Ở trạng thái này tỷ trọng
của pha lỏng và pha hơi bằng nhau, ranh giới phân biệt giữa hai pha biến mất. Chất
ở trạng thái siêu tới hạn có tính chất nằm giữa pha lỏng và pha hơi.
Một hợp chất ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó ở nhiệt độ và áp suất
cao hơn giá trị giới hạn. Ở trạng thái siêu tới hạn hợp chất này khơng cịn ở thể lỏng
nhưng vẫn chưa thành thể khí.
/>
1.1.2 Dụng cụ

Điều
chỉnh

Bình ngưng tụ

0

P, t C

(CO2 lỏng)

Bình
tách

Bình
chiết

Bình chứa
CO2

Làm
nóng

Bơm

Làm
lạnh

Hình 1.1. Bộ dụng cụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn
Hệ thống gồm một nguồn cung cấp CO2, một máy bơm, một bộ làm lạnh, một

bộ tăng nhiệt, bình chiết chứa dược liệu, bình tách thu sản phẩm và bình ngưng tụ.
1.1.3 Nguyên tắc, cơ chế hoạt động
-

Nạp dược liệu vào bình chiết, khóa nắp lại.

-

Mở dịng CO2 lỏng đi qua bộ phận làm lạnh rồi qua bơm nén. Sau đó qua bộ
tăng nhiệt. Khi đạt nhiệt độ và áp suất, CO2 trở thành dòng siêu tới hạn
3


-

Dịng này vào bình chiết. Hoạt chất theo dịng CO 2 qua bộ phận làm lạnh. Tại
đây CO2 hóa lỏng và được đưa vào bình tách.

-

Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 biến thành dạng khí, sản phẩm
sẽ lắng xuống, được thu riêng.

-

CO2 dạng khí được đưa qua bộp phận nén lạnh, hóa lỏng và đưa trở lại bình
chứa. Quá trình chiết lại tiếp tục.

1.1.4. Một số ưu, nhược điểm
Ưu điểm:

-

Khả năng khuếch tán tốt.

-

Độ nhớt thấp, áp suất hơi cao, điểm siêu tới hạn của CO2 dễ đạt.

-

Độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần chiết. Vì thế chất chiết tương đối sạch.

-

Dễ áp dụng ở qui mô công nghiệp.

-

Thân thiện với môi trường.

-

Tốc độ phản ứng lớn.

-

Tc = 31,1o C nên hòa tan chất dễ phân hủy ở nhiệt độ cao.

- Có khả năng tái sử dụng vì vậy chi phí rẻ hơn.
Nhược điểm:

-

Thiết bị chun dùng, đắt tiền.

-

Khơng thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng.

-

Khó lường được khi chiết trên một mẫu mới. Cần có nhiều nghiên cứu tìm
các thơng số tối ưu để chiết thành công.

1.1.5 Phạm vi ứng dụng
Lưu chất siêu tới hạn được ứng dụng trong rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, trong công nghiệp, trong y học…
Ứng dụng của dung môi siêu tới hạn trong ngành dược.
- Chiết lỏng siêu tới hạn: (supercritical fluid extraction - SFE) chiết từ các chất
rắn như cà phê, trà, hoa bia hay các thành phần trong thực phẩm (hoa bia, vitamin,
lipid...).
- Cắt phân đoạn (supercritical fluid fractionation – SFF): từ hỗn hợp lỏng.
Ngày nay người ta ứng dụng để ly trích hương liệu từ dịch nhiều thành phần được
chưng cất. Hoặc dùng để tách lipid phân cực hay những polyme.

4


- Sắc ký lỏng siêu tới hạn (Prerarative scale supercritical fluid
chromatography- PSFC): dùng để tách phân đoạn sau cùng gồm những chất có cấu
trúc rất giống nhau.

- Phản ứng (supercritical fluid reactions – SFR): lưu chất siêu tới hạn có thể
xúc tác các phản ứng tổng hợp, nhất là phản ứng hydrogen hóa.

1.2 Thành phần hóa học
1.2.1 Thành phần hóa học:
Củ tươi của A. cepa L. bao gồm chủ yếu là nước (khoảng 88%), saccharides
(khoảng 6%) và protein (khoảng 1,5%). Tuy nhiên, thành phần hoá học cụ thể phụ
thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn như điều kiện phát triển, thời gian thu hoạch, thời
gian và điều kiện bảo quản.
1.2.2.1. Sulphur hữu cơ:
A. cepa L. chứa nhiều hợp chất khác nhau và đã được nghiên cứu trong vòng
hơn 100 năm qua. Giống như các lồi khác trong chi Allium, ví dụ: A. sativum L.
hoặc A. ursinum L., A. cepa L. đặc trưng bởi hàm lượng cao hợp chất sulphur hữu
cơ. Chiếm ưu thế nhiều nhất trong các hợp chất sulphur hữu cơ là các axit amin
cysteine và methionine, S-alk(en)yl-cysteine thay thế sulphoxides và γ-glutamyl
peptide [23].
S-Alk(en)yl-substituted cysteine sulphoxides: các amino acid như L-cysteine,
L-cystine và L-methionine chiếm tỷ lệ tương đối thấp trong hành. Cho đến nay, bốn
S-alk(en)yl-cysteine sulphoxides, gồm (+)-S-methyl-, (+)-S-propyl-, trans-(+)-S-(1propenyl)-L-cysteine sulphoxide và cycloalliin, đã được phát hiện trong A. cepa L.
S-alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides được chuyển hóa thành axit sulphenic do tác
động của alliinase hoặc khi các mô bị phân hủy (ví dụ như bị cắt hoặc ép). Các hợp
chất của lưu huỳnh tạo ra axit sulphenic tạo nên vị hăng cay làm chảy nước mắt và
mùi hôi, gây nên những hương vị đặc trưng của hành [23].
γ-glutamyl peptide: cho đến nay tổng cộng 14 γ-glutamyl peptide đã được xác
định trong hành và 9 trong số đó có chứa nguyên tử lưu huỳnh (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. γ-Glutamyl peptides trong A.cepa L.
γ-Glutamyl peptides

γ-Glutamyl peptides chứa sulphur

γ-Glutamyl-valine

γ-Glutamyl-methionine
5


γ-Glutamyl-isoleucine

γ-Glutamyl-S-methyl-L-cysteine

γ-Glutamyl-leucine

γ-Glutamyl-S-methyl-L-cysteine sulphoxide

γ-Glutamyl-phenylalanine

γ-Glutamyl-S-trans-(1-propenyl)-L-cysteine
sulphoxide

γ-Glutamyl-thyrosine

γ-Glutamyl-S-(2-carboxypropyl)-cysteinylglycine
Glutathione
Glutathione-γ-glutamyl-cysteine-disulphide
Glutathione-cysteine-disulphide
S-Sulphoglutathione

γ-glutamyl peptide xuất hiện chủ yếu ở hạt giống khơng hoạt động và củ hành
khơ, đóng góp vào sự nảy mầm của hạt giống và có vai trị như một chất dự trữ. (+)S-Alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides liên kết với chuỗi axit amin γ-glutamyl khơng

được chuyển hóa bởi alliinase. Sau khi phân cắt bởi peptidases và transpeptidases,
alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides tự do tạo chất dễ bay hơi trong chiết xuất củ hành.
Khoảng 90% hợp chất lưu huỳnh hữu cơ tan được tồn tại ở dạng γ-glutamyl peptide,
các hợp chất này đóng vai trị quan trọng trong chất lượng hương vị của hành tây và
hoạt tính dược lực thành phần chiết xuất từ củ hành [20], [23].
1.2.2.2. Saponin:
Các saponin được tìm thấy trong hành tây là: sitosterol, oleanolic acid và
một ít amyrin [13]. Các chất này đã được phân lập và xác định cấu trúc từ những
năm 1982. Trong đó sitosterol có cấu trúc thuộc nhóm steroid cịn oleanolic acid và
amyrin có cấu trúc triterpenoid.
Gần đây năm 2004, các nhà khoa học đã làn đầu tiên phân lập được 4 saponin
trong hành tây đều có cấu trúc ruscogenin là: [14]
(25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabino pyranoside (I)
(25R)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside (II)
(25R)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (III)
(25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (IV)
Ngồi ra, hành tây cịn có các loại sapogenin khác là diosgenin và cepagenin.

6


Sitosterol

Oleanolic acid

1.2.2.3. Flavonoid:
Flavonoid chủ yếu trong hành tây là dẫn chất của quercetin: isoquercetin,
quercetin diglucoside, quercetin monoglucoside và quercetin tự do. Hành tây cịn
chứa kaempferol nhưng hàm lượng rất ít. Quercetin monoglucoside và quercetin
diglucoside là flavonoid chính chiếm 80% các chất có chứa quercetin. Tỷ lệ

quercetin monoglucoside và quercetin diglucoside là 1:2,2 [22].

Kaempferol

Isorhamnetin

Các nhà khoa học Italia đã dùng phương pháp HPLC để tách và xác định hàm
lượng các flavonoid khác nhau trong 12 giống hành với các màu vỏ khác nhau.
Nhận thấy ngoài các dẫn chất của quercetin và kaempferol cịn có isorhamnetin (3methylquercetin) và Isorhamnetin monoglycoside. Dấu vết của kaempferol chỉ được
tìm thấy ở giống White Hawk [13].

Bảng 1.2 Các thành phần flavonoid trong Hành tây (mg/kg)
Cultivar

Quercetin

Quercetin

Quercetin

monoglyc

diglyc

7

Rutin

Isorhamnetin

Isorham.

Tổng

monoglyc.

flavonoid


Hành vàng
Festival

55,9

374,0

43,1

1,8

3,8

47,2

525,8

Tamara

66,5

460,0

37,9

4,7

2,7

45,1

616,9

Daytona

111,7

713,4

41,3

5,7

6,5

54,2

932,8

Dorata
Density

95,4

725,2

73,3

13,6

5,9

65,7

979,1

Castillo

65,0

610,9

50,6

9,0

n.d.

50,7

786,2

Santana

92,3

547,3

49,2

6,3

6,5

48,2

749,8

Trung bình

81,1

571,8

49,2

6,9

5,1

51,9

765,8

557,8

125,9

11,4

1,8

50,4

15,6

762,9

352,1

32,6

2,7

3,7

38,3

486,9

Hành đỏ

Tropea rossa
Rossa Lilia

57,5

Redwing

76,6

418,6

30,4

1,7

6,3

48,1

581,7

Trung bình

230,6

298,9

24,8

2,1

20,1

34,0

610,5

Gladstone

0,7

0,8

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

1,5

Southport

0,7

2,0

n.d.

n.d.

n.d.

tr.

2,7

White Hawk

0,6

0,6

tr.

n.d.

tr.

n.d.

1,2

Trung bình

0,7

1,1

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

1,8

Hành trắng

n.d.= not detected (khơng phát hiện)

tr.=trace(<0,5) (phát hiện vết)

Theo đó, hành vàng và hành đỏ chứa lượng flavonoid nhiều hơn dáng kể so
với giống hành trắng. Đây cũng là cơ sở để chọn hành vàng và hành trắng trong
chiết xuất quercetin.
1.2.2.4 Các thành phần khác
Trong 100g hành tây có chứa các chất sau: nước 88g, protid 1,8g, glucid 8,3g,
chất xơ 0,1g, tro 0,8g; các chất khoáng vi lượng: Ca 38mg, P 58mg, Fe 0,8 mg; các
vitamin: B1 0,03mg, B2 0,04mg, PP 0,02mg, C 10mg, caroten 0,03mg.
Ngồi ra cịn có các ngun tố: Na, K, S, Si; acid acetic tinh dầu bay hơi,
glucokinin, oxydase và diatase…

8

Trong hành tây có chất kháng sinh rất mạnh là phytoncid, khi nhai hành tây
trong miệng từ 1-2 phút miệng trở nên rất sạch.

9


PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM
2.1 Chiết xuất quercitin bằng carbon dioxid siêu tới hạn
Phương pháp này được thực hiện tại đại học bang Michigan của Mỹ năm
2003, sử dụng CO2 làm chất lỏng siêu tới hạn.

2.1.1 Nguyên liệu và chất chuẩn:
- Carbon dioxide công nghiệp (CO 2, BOC gases, Murray Hill, NJ) được sử
dụng như một chất lỏng siêu tới hạn (SF).
- Hành đỏ và hành vàng được lấy từ các trang trại Muck (Đại học bang
Michigan, East Lansing, MI). Để bảo vệ nguyên liệu trong gai đoạn nghiên cứu
hành được lưu trữ tại -20oC.
- Ethyl alcohol mua từ Pharmaco (Brookfield, CT).
- Phosphoric acid 86,3% cung cấp bởi J.T. Baker (Philisburg, NJ).
- Quercetin chuẩn được cung cấp bởi Sigma (St Louis, MO).

2.1.2 Trang thiết bị:
Quá trình chiết xuất được thực hiện ở một bình thép khơng gỉ 500 mL (10)
chịu được áp suất cao (Autoclabe Engineers, Erie, PA). Bình chiết được bao bọc,
gia nhiệt và cách ly bằng giấy bạc để duy trì nhiệt độ khong đổi. Nhiệt độ này được
theo dõi và kiểm soát với một ặp nhiệt điện và bộ điều khiển nhiệt độ (Omega
Engineering, Stamford, CT).
Carbon dioxide từ bình chứa hình trụ (1) được nén bằng máy nén cao áp (2,
Haskel Inc, Burbank, CA) và được lưu trữ trong một bình chứa 2 L (3). Máy đo áp
suất (4, 7) sử dụng để theo dõi áp suất trong bình chứa carbon dioxide và van bình

chiết. Một máy tạo áp suất về phía trước (6,Tescom Corp., Elk River, MN), vị trí
giữa bình chứa carbon dioxide và van bình chiết, kiểm sốt áp lực chiết suất. Dịng
khí được theo dõi bàng cách sử dụng một đồng hồ đo (13, American Dry Test Meter
Model DTM-200A-3, American Meter Co., Philadelphia, PA). Hai van ngắt (5, 10,
Autoclave Engineers, Erie, PA) được sử dụng để hỗ trợ trong điều áp và giảm áp hệ
thống. Một bơm piston (8, Model 305, Gilson, Middle town, WI) được sử dụng để
tuần hồn khí CO2 thốt ra vào bình chiết suất. Tại van micrometering (11,
Autoclave Engineers, Erie, PA) áp suất được giảm xuống, dịch chiết sau đó được
tách khí và thu vào trong một ống thủy tinh (12). Cái khay bao gồm những lọ thủy
tinh (3,7 mL) chèn vào trong ống thủy tinh bao quanh nước đá khô. Các ống thủy
tinh được giữ ở nhiệt độ đủ để CO2 bay hơi và thu được quercetin thô.

10


Hình
2.1. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon Dioxide siêu tới hạn.
Chú thích:
1. Bình chứa CO2
2. Máy nén cao áp
3. Binh chứa khí nén
4,7 Máy đo áp suất
5,10 Điều khiển áp suất phía trước
8. Piston bơm
9. Hệ thống cung cấp nhiệt
11. Van micrometerring
12. Nơi thu mẫu
13. Đồng hồ đo thể tích khí
TC: temperature control (điều khiển nhiệt độ)

2.1.3. Quá trình chiết xuất:
Chuẩn bị mẫu: Lớp vỏ củ hành được bóc tách bằng tay, loại bỏ những phần hư
hỏng và cắt thành mảnh nhỏ khỏang 0,5 x 0,5 inch. Quy trình chiết xuất: áp suất và
nhiệt được cài đặt ở 5700 psi va 40 oC. Phải mất từu 25 - 30 phút để đạt được các
điều kiện trên. Bình chiết được gia nhiệt 24h trước khi lấy dịch chiết để thống nhất
thời gian chiết giữa các mẫu. Hành tây thái nhỏ và ethanol 5% (nồng độ phân tử so
với tổng số mol CO2 sử dụng để tạo áp lực cho hệ thống) được thêm vào binh trước
khi nó được đóng lại. Máy bơm được cài đặt 5 ml/phút. Khi các điều kiện mong
muốn đạt tới, các van micrometering được mở, CO 2 tương đương 15 L khí nén
(khỏang 4% tổng số CO2 chiếm thể tích bên trong bình chiết) đi qua khay để lấy
11


mẫu (nhanh nhất có thể để duy trì chế độ tĩnh), sau đó các van micrometcring được
đóng lại, thay các chai thủy tinh đựng mẫu mới. Quá trình này kéo dài khoảng thời
gian từ 10 - 18 phút. Sau đó, mẫu tiếp theo được lấy một lần nữa với việc mở van
micrometering. Mỗi mẫu chiết 10 lần va chiết với 5 mẫu khác nhau.

2.1.4. Hệ thống HPLC phân tích mẫu:
Hệ thống HPLC gồm:
- Phần mềm PEAKSIMPLE
- Tiền cột: C18 (1 cm x 4 mm, 5 pm)
- Bơm QUAT (Model AGP-1, Cotati, CA)
- Cột: BetaBasic C18 (250 x 4.6 mm, 5 pm)
- Bơm mẫu: Rheodyne manual injector (10 µL injection loop).
- Đầu dò: LC quang phổ (Waters, Lambda-Max, Model 481, Milford, MA).
Các thông số sắc ký:
- Pha động: dung dịch acid phosphoric [0,5% (v/v)] - methanol (2:3 (v/v))
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 280 nm

- Thời gian phân tích: 10-15 phút cho mỗi mẫu
2.1.5. Kết quả và bàn luận:
Từ năm lần lập lại, quercetin chiết xuất được trong phạm vi 226-323 µg cho
giống hành đỏ, và 101 - 225 µg cho giống hành vàng (Bảng 2.1). Trung bình 0,024
g quercetin/kg vỏ củ hành trích được cho giống màu đỏ và 0,020 g của quercetin /
kg vỏ củ hành cho giống vàng, thời gian chiết xuất tổng cộng 150 phút cho giống
màu đỏ và 156 phút cho giống màu vàng.
Ở khoảng tin cậy 95% khơng có sự khác biệt có ý nghĩa (P = 0,182) giữa khối
lượng quercetin chiết được/ kg hành đỏ và vàng, giống màu vàng có độ lệch chuẩn
thấp (0,003) so với màu đỏ (0,005).

12


Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành đỏ.
Mẫu
số

Thời
gian
chiết

Nồng

Tổng

Tỉ lệ µg

số g

độ

Quercetin

(phút)

(µg/ml)

lượng
quercetin
(µg)

/ Lít CO2

quercetin/
kg vỏ hành

Khối
lượng vỏ
hành

% Ethanol
(nồng độ
phần mol)

Hành đỏ
1

145

0,037

313

2,09

0,027

11,8

7,09

2

143

0,037

323

2,09

0,027

13,9

7,78

3

152

0,035

291

1,94

0,023

12,8

6,80

4

152

0,029

287

1,91

0,024

10,5

7,78

5

157

0,029

226

1,51

0,019

12,0

7,78

Trung bình

150

0,034

288

1,91

0,024

12,2

7,45

Hành vàng
1

156

0,015

193

1,27

0,022

8,6

7,69

2

151

0,016

201

1,32

0,025

8,1

7,69

3

159

0,020

225

1,46

0,023

9,6

8,17

4

164

0,020

149

0,99

0,018

5,8

7,69

5

150

0,014

101

0,67

0,012

8,2

7,69

Trung bình

156

0,017

174

1,14

0,020

8,1

7,79

Kết quả (Bảng 2.1) cho thấy khơng có sự tương quan giữa thời gian chiết xuất,
khối lượng vỏ hành và nồng độ ethanol (trong phạm vi mà các thông số này khác
nhau) trên tổng khối lượng quercetin, vì sự thay đổi này không ảnh hưởng đến sự
biến động của khối lượng quercetin. Mặt khác, thể tích ethanol thu được trong mẫu
cho thấy có ảnh hưởng đến lượng quercetin chiết xuất.
Tóm lại: Quercetin tự do đã được chiết xuất từ vỏ củ hành đỏ và vàng, bằng
cách sử dụng CO2 siêu tới hạn như một dung môi và ethanol như một chất mang.
Các kết quả trình bày khơng có khác biệt thống kê, ở mức độ tin cậy 95% giữa các
giống hành. Khối lượng quercetin tự do và thể tích ethanol thu được trong mỗi ống
thu tỷ lệ thuận với nhau.
Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp thay thế cho phương pháp chiết
rắn -lỏng thông thường để chiết quercetin. Tuy nhiên, trong tương lai cần chú ý
nhiều hơn các hợp chất tương tự khác có trong hành có thể ảnh hưởng đến quá trình
chiết xuất và hiệu suất chiết.
13


2.2 Chiết xuất Quercetin bằng nước siêu tới hạn
Phương pháp này được thực hiện tại đại học Ewha womans Hàn Quốc năm
2010, sử dụng nước làm chất lỏng siêu tới hạn.
2.2.1 Nguyên liệu và thiết bị:

Chẩn bị mẫu thử: củ hành tây được lấy từ Uiseong, Gyeongsangbuk-do, Hàn
Quốc, chỉ những củ có bao phủ bên ngồi lớp vỏ màu da cam mới được sử dụng.
Vỏ củ hành tây được sấy khơ với khơng khí nóng ở 60 0C trong 10 giờ và sau đó cắt
thành miếng (<10 mm) sử dụng một máy trộn tốc độ cao (Blender 7012S, Waring
Co., Torrington, CT, USA). Tất cả các mẫu được lưu trữ trong tủ lạnh duy trì ở 4 0C.
Các mảnh vỏ hành và diatomaceous earth (D, tảo cát trái đất) (ASE ® Pre DE,
DIONEXNCo., Sunnyvale, CA, USA) được pha trộn và cho vào tế bào chiết thép
không gỉ 34 ml (DIONEX Co,) có chứa giấy lọc cellulose (30mm, Dionex Co.) như
ở hình 2,5.
Thiết bị: trình bày ở hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS (Version 17.0, SPSS Inc. Chicago, IL,
USA). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, giá trị biểu thị dưới dạng giá trị trung
bình ± độ lệch chuẩn (SD).
2.2.2 Quá trình chiết xuất:
Chiết bằng nước siêu tới hạn:

14


Việc chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng một dung môi nhanh (100
ASE, Công ty DIONEX) với nước Milli-Q (MR-RO800, Công ty TNHH Mirae ST,
An Dương, Hàn Quốc) như là dung môi duy nhất. Vỏ hành tây (1 – 2g) và DE được
trộn tỉ lệ hỗn hợp giữa 0,5:3,5 và 0,2:0,2. Qúa trình chiết xuất được thực hiện như
hình 2,5.
Mẫu này được nạp vào tế bào chiết thép không gỉ và điền đầy đủ dung môi
trong khoảng 1 phút, tăng áp suất trong 5 phút. Sau khi áp suất đạt 90 bar, tế bào
chiết được cung cấp nhiệt (tượng trưng cho thời gian chiết xuất) trong khi áp suất
được suy trì ở 90-131 bar, nhiệt độ chiết xuất từ 100-1900C.

Tế bào chiết này có thể được rửa sạch dung mơi qua các đường bơm mẫu
trong vịng 30s. Việc rửa tế bào chiết được thực hiện khoảng 1-2 phút giữa các lần
chiết xuất với khí nitơ.
Dịch chiết được thu vào một lọ thuỷ tinh (40-5ml) đã biết khối lượng.
Chiết rắn - lỏng:
Sử dụng dung môi chiết là ethanol 95% (Samchun pure chemicals Co., Seoul,
Korea) và methanol 99,8% (Duksan pure chemicals Co., Ansan, Korea) ở 60 0C
trong 2 giờ với 40,l dung môi cho 1g vỏ củ hành.
Dịch chiết nước nóng được thực hiện trong 3 giờ ở 100 0C với 40ml nước/1g
vỏ củ hành.
2.2.3. Quy trình phân tích bằng HPLC:
Dịch chiết vỏ củ hành được thêm vào ethyl acetat (Duksan pure chemicals
Co., Ansan, Korea) tỷ lệ 1:1, sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng để chiết
quercerin, chiết 3 lần và làm bay hơi ethyl acetat ở 56 oC. Cắn thu được hoà tan
trong vừa đủ 10 ml methanol. Định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC (1200
series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) với cột Zorbax C18 (4,6 mm 
150 mm, 5 µm ).
Pha động là methanol-nước-trifloroacetic acid (40:60:0,04) với tốc độ dịng 1
ml / phút. Thể tích tiêm mẫu 10 µl, bước sóng phát hiện 370 nm.
Đã thiết lập được đường cong chuẩn độ gồm 6 điểm với chất chuẩn quercetin
(Quercetin dihydrate minimum 98% HPLC powder, Sigma–Aldrich, Steinheim,
Germany) ở các nồng độ 50, 100, 200, 500, 1000, và 2000 ppm.

15


Hình 2.3 Sắc ký đồ của quercetin từ dịch chiết vỏ củ hành tây
Thành phần hoá học của vỏ củ hành và sản phẩm quercetin thu được bằng
SWE được phân tích theo mơ tả của Suutarinen et al. (2003) [24]. Phân tích định
lượng các flavonoid trong nguyên liệu sử dụng và sản phẩm chiết xuất được thực

hiện theo phương pháp Crozier et al. (1997) [5] để xác định tổng lượng quercetin
trong nguyên liệu ban đầu và lượng còn lại trong mẫu đem đi chiết xuất sau lần
chiết đầu tiên và các lần chiết sau đó.

2.2.4 Kết quả và bàn luận
2.2.4.1 Kết quả chiết xuất bằng nước siêu tới hạn
Hiệu quả chiết của SWE được đánh giá bằng cách so sánh khối lượng
quercetin chiết được (mg/g vỏ củ hành) và % quercetin chiết được của từ vỏ củ
hành qua các lần chiết. SWE được thực ở nhiệt độ là 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ
hỗn hợp vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5 cho kết quả như bảng sau:

16


Bảng 2.2. Hiệu suất chiết và độ phục hồi của SWE
Số lần chiét

Năng suất (mg/g vỏ củ hành)a

Độ phục hồi (%)b

1

16,29 ± 0,75

92,40

2

1,28 ± 0,11

7,26

3

0,06 ± 0,02

0,34

4

Ndc

0

5

Nd

0

Tổng cộng

17,63 ± 0,87

100

a

Năng suất (mg/g vỏ củ hành). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, dữ liệu

thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
b

Độ phục hồi (%) = năng suất/ tổng lượng quercetin chiết được bởi SWE

c

Không phát hiện

Ngồi ra, thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE được so
sánh với nguyên liệu ban đầu (Bảng 2.3)
Bảng 2.3. Thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE và nguyên liệu vỏ
củ hành ban đầu.
Vỏ củ hành

Chiết xuất của SWEa

47,63 ± 0,87b

13,24 ± 0,62

Protein (%)

3,98 ± 0,44

1,14 ± 0,19

Lipids (%)

5,22 ± 0,59

1,68 ± 0,12

Ash (%)

7,10 ± 0,61

2,10 ± 0,076

Moisture (%)

4,81 ± 0,42

9,42 ± 1,63

17,63 ± 0,87

16,29 ± 0,75

Quercetin-40-glucoside (mg/g onion skin)

3,72 ± 0,09

3,15 ± 0,60

Kempherol (mg/g vỏ củ hành)

0,88 ± 0,23

0,68 ± 0,13

Isorahmnetin (mg/g vỏ củ hành)

0,74 ± 0,18

0,54 ± 0,09

Rutin (mg/g vỏ củ hành)

0,93 ± 0,15

0,58 ± 0,11

Chất
Carbohydrate (%)

Quercetin (mg/g vỏ củ hành)

a

SWE được thực ở nhiệt độ là 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5

b

Dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Kết quả trên cho thấy các thành phần hóa học của chiết xuất SWE giảm đáng
kể so với nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, đối với flavonoid, chiết xuất bao gồm
17

một lượng lớn quercetin (16,29 ± 0,75 mg/g vỏ củ hành), một lượng nhỏ quercetin4’-glucoside (3,15 ± 0,60 mg/g vỏ củ hành), và có dấu vết chất flavonoid khác. Kết
quả này chỉ ra rằng quercetin và quercetin-4’-glucoside chiếm khoảng 99% tổng
lượng flavonoid có trong chiết xuất và khoảng 92,40% tổng lượng quercetin so với
nguyên liệu ban đầu. Các kết quả trong nghiên cứu này chứng minh rằng SWE là
một phương pháp rất hiệu quả để chiết flavonol quercetin và do đó nước siêu tới
hạn là giải pháp tuyệt vời để thay thế dung mơi hữu cơ, góp phần nâng cao hiệu quả
chiết xuất và thân thiện với môi trường.

2.2.4.2 So sánh SWE với các phương pháp chiết khác:
Hiệu quả của SWE được so sánh với phương pháp chiết xuất thông thường.
Hình 2.10 chỉ ra rằng lượng quercetin thu được từ SWE nhiều hơn lần lượt gấp tám,
sáu và bốn lần hơn so với sử dụng dung môi là ethanol, methanol và nước.

Hình 2.4 So sánh các phương pháp chiết
Sử dụng ethanol và methanol làm dung môi chiết ở 600C trong 2 giờ cho thấy
năng suất chiết quercetin khơng có sự khác biệt đáng kể. Bên cạnh đó, việc sử dụng
nước ở nhiệt độ sôi trong 3 giờ cho tỷ lệ khai thác quercetin cao hơn. Tỷ lệ khai thác
18


quercetin cao nhất từ SWE. Vì vậy, SWE là phương pháp hiệu quả cao để chiết
flavonol quercetin từ vỏ củ hành tây.

2.3 Kiểm nghiêm nguyên liệu hành tây
Hiệu suất chiết, lượng quercetin chiết được phụ thuộc rất nhiều vào nguyên
liệu đầu vào. Vì vậy, kiểm nghiệm bán nguyên liệu hành tây trước khi tiến hành
chiết xuất là rất cần thiết. Qua tham khảo nhiều tài liệu khác nhau chúng tôi xin đề
nghị phương pháp định lượng quercetin trong hành tây bán nguyên liệu như sau:
Chuẩn bị mẫu thử: vỏ hành tây nguyên liệu được nghiền thành mảnh nhỏ, sấy

ở 60 C trong 10 giờ, cắt thành mảnh nhỏ. Cân 1,5g vỏ củ hành, tiến hành chiết xuất
như phần 2.2.2 ở 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE là
1,5:2,5, chiết 3 lần. Chiết quercetin với ethyl acetate 3 lần (tỉ lệ dịch chiết-ethyl
acetate: 1:1), thực hiện 3 lần. Cô dịch chiết ethyl acetate và hồ tan cắn vào
methanol rồi cho vào bình định mức 100ml, bổ sung methanol vừa đủ. Hút chính
xác 5ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50ml, bổ sung methanol vừa đủ, lọc
q lọc 0,45µm.
o

Chuẩn bị mẫu chuẩn: hồ tan bằng methanol khoảng 0,5g quercetin chuẩn vào
bình định mức 10ml, bổ sung methanol vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
Điều kiện và q trình phân tích bằng HPLC thực hiện như trình bày ở phần 2.
Tiêu chuẩn: có khơng ít hơn 15mg/g vỏ củ hành.

19