Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (gossypium hirsutum l ) kháng sâu xanh (helicoverpa armigera hübner)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
***




TRỊNH MINH HỢP




NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP
CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM
HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA
ARMIGERA HÜBNER)






LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
***



TRỊNH MINH HỢP



NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP
CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM
HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA
ARMIGERA HÜBNER)




LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP



Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62. 62. 05. 01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
2: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN



HÀ NỘI - 2012

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và
chưa từng được sử dụng để bảo vệ học vị nào. Các tài liệu trích dẫn được chỉ
rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đã được cám ơn.

Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012
Tác giả luận án





Trịnh Minh Hợp

ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến
GS. TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Phan Hữu Tôn, những người thầy đã tận
tình dìu dắt, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh
học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học và Viện Đào tạo Sau đại học,
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ Viện Nghiên cứu
Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ về
mọi mặt để tôi thực hiện đề tài này. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn các đồng
nghiệp Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật đã trợ giúp tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu của
Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng chân thành cảm ơn gia đình, người thân và
bạn bè đã cho tôi động lực, chia sẻ với tôi mỗi khi gặp khó khăn trong quá
trình thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012
Tác giả luận án

Trịnh Minh Hợp

iii
MỤC LỤC

Trang
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Ký hiệu và chữ viết tắt trong luận án
ix
Danh mục bảng trong luận án
xi
Danh mục hình trong luận án
xiv
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………….
1
1. Tính cấp thiết của đề tài …………………………………………
1
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ………………………
2
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài …………………………………
2
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài …………………………………
3
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài …………………………………

3
3.1. Mục đích của đề tài ………………………………………
3
3.2. Yêu cầu của đề tài …………………………………………
3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ……………………
4
4.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài …………………………
4
4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài ……………………………
4
5. Đóng góp mới của luận án ………………………………
4

iv

Trang
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ………………
5
1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam
5
1.1.1. Sơ lược về cây bông ……………………………………
5
1.1.2. Tình hình sản xuất bông trên thế giới …………………
5
1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam ………
6
1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra …………………………………
9
1.2.1. Sâu hại bông ………………………………………………

9
1.2.2. Tổn thất do sâu hại bông và chi phí phòng trừ …………
11
1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu
12
1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu …………………………
14
1.4.1. Tăng năng suất …………………………………………….
14
1.4.2. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu ……………………………….
14
1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt ……………………………….
16
1.6. Tái sinh cây bông
17
1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ………………
17
1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi ………………….
22
1.7. Chuyển gen cây bông …………………………………………
23
1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens …………
24
1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn
28
1.7.2.1. Cơ chế của chuyển gen PTP …………………………
28

v

Trang
1.7.2.2. Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông ……………
30
1.7.2.3. Thuận lợi và khó khăn của chuyển gen PTP ………
30
1.7.2.4. Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen PTP …
32
1.7.2.5. Nguyên tắc cơ bản trong thao tác vi tiêm ………
33
1.8. Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen …………………………
33
1.8.1. Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị
chọn lọc …………………………………………………
34
1.8.1.1. Gen chỉ thị chọn lọc ………………………………….
34
1.8.1.2. Gen chỉ thị chọn lọc thông dụng ……………………
35
1.8.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây
chuyển gen ………………………………………………
37
1.8.2.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào
bằng PCR ……………………………………………
37
1.8.2.2. Xác định sự gắn kết và số bản sao gen chuyển bằng
Southern blot …………………………………………
39
1.8.3. Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển trong cây
chuyển gen ……………………………………………
41

1.8.3.1. Đánh giá hoạt động phiên mã của gen chuyển bằng
Northern blot …………………………………………
41
1.8.3.2. Đánh giá hoạt động dịch mã của gen chuyển bằng
Western blot ………………………………………….
42
1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt ……
43

vi

Trang
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
46
2.1. Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………
46
2.1.1. Giống bông ………………………………………………
46
2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn ……………….
46
2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu ………………………………………….
48
2.1.4. Hoá chất …………………………………………………
48
2.1.5. Máy móc, thiết bị ………………………………………….
49
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ………………………….
49
2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens ……
49

2.2.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma …………
49
2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi
51
2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens
53
2.2.2. Chuyển gen vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua
đường ống phấn …………………………………………
55
2.2.2.1. Xác định thông số vi tiêm ……………………………
55
2.2.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T
0
………………
55
2.2.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen ………………….
56
2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh …….
56
2.2.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR …………
57
2.2.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen ….
57

vii

Trang
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………
60
3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens ………

60
3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma …
60
3.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi ………………….
71
3.1.3. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens
78
3.1.3.1. Xác định thông số chuyển gen ……………………….
78
3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen ……………………………….
84
3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy
qua đường ống phấn ……………………………………
90
3.2.1. Xác định thông số vi tiêm …………………………………
91
3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T
0
……………………
94
3.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen ……………………….
97
3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh ………….
97
3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin …
97
3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin …….
100
3.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ………………
107

3.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen
110
3.3.3.1.
Đánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuyển
gen thế hệ T
2
giống Coker312 và SSR60F
………
110
3.3.3.2.
Đánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuyển
gen thế hệ T
2
giống LRA5166, MCU9 và TM1
…
111

viii

Trang
3.3.3.3.
Đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen
thế hệ T
2
……………………………………………
115
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………………….
120
1. Kết luận …………………………………………………………
120

2. Đề nghị ……………………………………………………………
121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ
LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI …………………………………………….
122
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………….
123
PHỤ LỤC ………………………………………………………………
141




















ix

CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
Ký hiệu, chữ viết tắt
Diễn giải
2,4D
2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
2iP
N
6
-(2-Isopentenyl)adenine
A. tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
a.i.
Active ingridient - thành phần độc tính
BA
N
6
-Benzyladenine hoặc 6-Benzylaminopurin
Bt
Bacillus thuringiensis
C, S, L, M, T-T
m
/n
Ký hiệu cây và dòng chuyển gen. Trong đó, C ký hiệu
của giống Coker312, S - SSR60F, L - LRA5166, M -
MCU9 và T - TM1; T
m
ký hiệu thế hệ, m = 0, 1, 2…; n
là số thứ tự cây hoặc dòng chuyển gen, n = 1, 2, 3, …
CTAB
Cetyltrimethylammonium bromide

DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
ĐC, ĐC+ và ĐC-
Đối chứng, đối chứng dương và đối chứng âm
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
GA
3

Gibberellin A
3
gfp
Green fluorescent protein
gus
β-Glucuronidase
hpt
Hygromycin phosphotransferase
IAA
3-Indoleacetic acid
IBA
Indole-3-butyric acid
ICAC
International cotton advisory committee - Ủy ban cố
vấn bông quốc tế
ICP
Insecticidal crystal protein - protein tinh thể diệt sâu

x

Ký hiệu, chữ viết tắt
Diễn giải
ISB
Information systems for biotechnology - hệ thống thông
tin công nghệ sinh học
Ka.
Kanamycin
Kb
Kilo base
kDa
Kilo Dalton
MSB
5
Môi trường chứa muối MS và vitamin B
5

NAA
α-Naphthaleneacetic acid
nptII
Neomycin phosphotransferase II
OD
230
,
260
,
280
,
600
Optical density - mật độ quang điện ở bước sóng 230, 260,
280 và 600 nm

PCR
Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp
PE
Polyethylene
Picloram
4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid
PTP
Pollen tube pathway - đường ống phấn
RNA
Ribonucleic acid
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
TDZ
Thidiazuron
TE
Tris - EDTA buffer
Tris-HCl
Tris hydrochloride: Tris(hydroxymethyl)aminomethane
hydrochloride
VIP3A
Vegetative insecticidal protein - protein sinh dưỡng diệt
côn trùng
Zeatin
6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purine

xi
DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN
Bảng

Nội dung
Trang
Bảng 2.1.
Trình tự 3 cặp mồi đặc hiệu và kích thước 3 phân đoạn
DNA dự kiến nhân …………………

48
Bảng 2.2.
Tổ hợp nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4D và
kinetin trong các môi trường CI ……………………….

50
Bảng 2.3.
Quy ước đánh giá mức độ cảm ứng mô sẹo và mức độ
lớn của mô sẹo …………………………………

50
Bảng 2.4.
Tổ hợp nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4D, BA và
NAA trong các môi trường MSI …………………

52
Bảng 2.5.
Tổ hợp nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA
trong các môi trường S ………………………………

52
Bảng 2.6.
Thành phần của các môi trường R …………………….
53

Bảng 3.1.
Tỷ lệ và mức độ cảm ứng mô sẹo trên các môi trường CI
62
Bảng 3.2.
Mức độ lớn của mô sẹo trên môi trường CP
65
Bảng 3.3.
Tỷ lệ cảm ứng phân hóa phôi trên môi trường EI ……
66
Bảng 3.4.
Số lượng và tỷ lệ cây tái sinh hoàn chỉnh trong ống nghiệm
69
Bảng 3.5.
Tỷ lệ cây tái sinh sống ở các phương pháp huấn luyện,
trồng cây tái sinh ………………………………………

71
Bảng 3.6.
Tỷ lệ cảm ứng đa chồi của phôi hạt trên các môi trường MSI
72
Bảng 3.7.
Tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi/cụm trên các môi trường S
75
Bảng 3.8.
Tỷ lệ cây tái sinh ra rễ trên các môi trường R ……
77
Bảng 3.9.
Tỷ lệ cây tái sinh sống trong nhà kính và nhà lưới …
78
Bảng 3.10.

Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo trên môi trường CI
4
và mô sẹo
sống sót trên môi trường CP bổ sung hygromycin ở 6
nồng độ ………………………………………………

80

xii
Bảng
Nội dung
Trang
Bảng 3.11.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo, phân hóa phôi và nhiễm A.
tumefaciens trên môi trường CI
4
bổ sung cefotaxime ở
5 nồng độ


81
Bảng 3.12.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo, nhiễm A. tumefaciens ở 4 mật
độ và thời gian nhiễm khuẩn

82
Bảng 3.13.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo, nhiễm A. tumefaciens ở 4 thời
gian đồng nuôi cấy

83
Bảng 3.14.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo và nhiễm A. tumefaciens ở 4
nhiệt độ đồng nuôi cấy

84
Bảng 3.15.
Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo, mô sẹo sống sót và phân hóa
phôi ở 3 đợt chuyển gen ……………………………….

86
Bảng 3.16.
Số cây tái sinh trong ống nghiệm, nhà kính, nhà lưới và
cây ra hoa - đậu quả bình thường ……………………

90
Bảng 3.17.
Tỷ lệ hoa nở ở các thời điểm trong ngày của 4 giống bông
92
Bảng 3.18.
Kích thước bầu nhụy, chiều dài trụ noãn và độ sâu kim
tiêm của 4 giống bông …………………………………

93
Bảng 3.19.
Số hoa vi tiêm, quả đậu và hạt chuyển gen thế hệ T
0
thu
được của 4 giống bông trên 3 nồng độ DNA plasmid …

94
Bảng 3.20.
Tỷ lệ đậu quả và số hạt/quả của 4 giống bông trong
điều kiện không vi tiêm và vi tiêm

95
Bảng 3.21.
Tỷ lệ đậu quả và số hạt/quả vi tiêm của 4 giống bông
trên 3 nồng độ DNA plasmid

96
Bảng 3.22.
Mức độ dị dạng quả vi tiêm và mức độ khó - dễ thao
tác vi tiêm của 4 giống bông …………………

97
Bảng 3.23.
Số lượng và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
kháng
hygromycin …………………………………………….
99

xiii
Bảng
Nội dung
Trang
Bảng 3.24.
Số lượng và tỷ lệ cây kháng hygromycin của 7 dòng
chuyển gen thế hệ T

2
giống Coker312 và SSR60F ……

100
Bảng 3.25.
Số lượng và tỷ lệ cây chuyển gen thế hệ T
1
, dòng
chuyển gen thế hệ T
2
kháng kanamycin ……….………

101
Bảng 3.26.
Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 7 dòng chuyển gen thế
hệ T
2
giống LRA5166 …………………………………

105
Bảng 3.27.
Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 64 dòng chuyển gen
thế hệ T
2
giống MCU9 …………………………

106
Bảng 3.28.
Tỷ lệ cây kháng kanamycin của 9 dòng chuyển gen thế
hệ T

2
giống TM1 ………………………………………

107
Bảng 3.29.
Tỷ lệ sâu chết khi ăn lá của 7 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
giống Coker312 và SSR60F ………………………

111
Bảng 3.30.
Tỷ lệ sâu chết khi ăn lá của 7 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
giống LRA5166

111
Bảng 3.31.
Tỷ lệ sâu chết khi ăn lá của 64 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
giống MCU9

112
Bảng 3.32.
Tỷ lệ sâu chết khi ăn lá của 9 dòng chuyển gen thế hệ
T
2
giống TM1

113
Bảng 3.33.
Số dòng chuyển gen thế hệ T
2
kháng sâu cao, trung bình
và yếu

114
Bảng 3.34.
Tỷ lệ sâu chết và sống sót ở các tuổi khi ăn lá của 87
dòng chuyển gen thế hệ T
2


116
Bảng 3.35.
So sánh đặc điểm sâu sống sót khi ăn lá dòng chuyển
gen thế hệ T
2
và giống ĐC

119



xiv
DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN
Hình
Nội dung

Trang
Hình 2.1.
Sơ đồ của 2 vector chuyển gen …………………………
47
Hình 3.1.
Mô sẹo cảm ứng trên các môi trường CI
61
Hình 3.2.
Mô sẹo nhân trên môi trường CP
64
Hình 3.3.
Tiền phôi và phôi chín
67
Hình 3.4.
Nảy mầm và tái sinh cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm
68
Hình 3.5.
Huấn luyện, trồng cây tái sinh trong nhà kính và nhà lưới
70
Hình 3.6.
Phôi hạt cảm ứng đa chồi trên các môi trường MSI
73
Hình 3.7.
Tạo và phát triển cụm chồi
74
Hình 3.8.
Cây tái sinh hoàn chỉnh trong ống nghiệm, huấn luyện -
trồng cây tái sinh

76

Hình 3.9.
Đoạn thân nuôi trên môi trường CI
4
bổ sung hygromycin
ở 6 nồng độ

79
Hình 3.10.
Mô sẹo chuyển gen cảm ứng sau 3 tuần nuôi cấy trên
môi trường CI
4
bổ sung 12,5 mg/l hygromycin

85
Hình 3.11.
Nhân, chọn lọc mô sẹo; phân hóa, phát triển, chín phôi;
nảy mầm, tái sinh cây chuyển gen

87
Hình 3.12.
Cây chuyển gen thế hệ T
0
trồng trong nhà lưới và một số
dị dạng của cây chuyển gen

89
Hình 3.13.
Quá trình nở hoa bông
91
Hình 3.14.

Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
bằng hygromycin
98
Hình 3.15.
Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
bằng hygromycin
99
Hình 3.16.
Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
1
bằng kanamycin
102
Hình 3.17.
Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T
2
bằng kanamycin
104
Hình 3.18.
Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen hpt ………………
108

xv
Hình
Nội dung
Trang
Hình 3.19.
Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen nptII ………………
109

Hình 3.20.
Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CryIAc ……………
109
Hình 3.21.
Sâu sống trên ĐC và chết trên dòng chuyển gen thế hệ T
2

117
Hình 3.22.
Sâu sống trên ĐC và dòng chuyển gen thế hệ T
2
sau 10
ngày nuôi ………………………………………
118


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, bông (Gossypium sp.) là cây trồng kinh tế lấy sợi tự
nhiên quan trọng nhất. Hiện nay, cây bông được trồng ở gần 100 quốc gia, với
diện tích niên vụ 2010/2011 khoảng 33,3 triệu ha, sản lượng đạt 25,1 triệu tấn
bông xơ, giá trị trên 50 tỷ USD (ICAC, 2012 [67]). Tuy nhiên, cây bông bị
nhiều loài sâu gây hại. Trước khi có bông Bt, hàng năm, mức tổn thất do sâu
hại gây ra chiếm 24,5% tổng sản lượng bông và tiêu tốn lượng thuốc trừ sâu
chiếm 25% tổng lượng thuốc sử dụng trong nông nghiệp, trong khi, diện tích
trồng bông chỉ chiếm 2,4% tổng diện tích đất trồng trọt toàn cầu (Krattiger,
1997) [79]. Để khắc phục tổn thất do sâu hại gây ra, tăng hiệu quả kinh tế cây
bông và bảo vệ môi trường sinh thái, các nước trồng bông lớn đã sử dụng
phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu.

Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống, được trồng nhiều ở vùng
Tây Bắc, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam bộ. Tuy nhiên,
diện tích và sản lượng rất thấp, chỉ đáp ứng 5% nhu cầu ngành dệt may [15].
Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích và tăng sản lượng bông
nước ta, nhưng quan trọng nhất từ trước tới nay vẫn là sâu hại. Trong điều
kiện nhiệt đới ẩm như ở nước ta, sâu hại thường phát sinh và gây hại quanh
năm trên cây bông. Các loài sâu hại phổ biến là sâu xanh, sâu keo, sâu khoang
và sâu hồng. Trong số đó, sâu xanh là loài nguy hiểm nhất, có mặt và gây hại
nặng ở hầu hết các vùng trồng bông từ Bắc tới Nam và là đối tượng cần
phòng trừ (Ngô Trung Sơn, 1999 [11]; Nguyễn Hữu Bình, 1990 [1]; Nguyễn
Thị Hai, 1996 [5]). Trong đó, biện pháp phòng trừ bằng giống kháng đã được
đặt ra. Tuy nhiên, đến nay, chúng ta vẫn chưa tạo được giống bông kháng sâu
tốt vì không tìm thấy nguồn gen kháng sâu xanh hiệu quả trên cây bông.

2
Theo Chương trình phát triển cây bông đến 2015 và định hướng đến
2020 [13], Việt Nam cần phát triển theo hướng tăng cường đầu tư thâm canh
nâng cao năng suất, chất lượng, đảm bảo hiệu quả kinh tế, nâng cao sức cạnh
tranh của cây bông và bảo vệ môi trường sinh thái; với chỉ tiêu đến năm 2015,
đạt 20 nghìn tấn bông xơ và đến 2020 là 60 nghìn tấn. Để thực hiện được điều
này, bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch, đầu tư, tài chính…, thì giải
pháp khoa học công nghệ mà trong đó ứng dụng phương pháp chuyển gen để
tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết.
Để tạo cây bông Bt, chủ yếu sử dụng phương pháp chuyển gen thông
qua A. tumefaciens, vì có ưu điểm đơn giản, chi phí thấp, không cần thiết bị
đặc biệt, số bản sao gen chuyển thấp và di truyền ổn định. Tuy nhiên, phương
pháp này phụ thuộc hệ thống tái sinh mất nhiều thời gian, tỷ lệ tái sinh thấp và
bị giới hạn bởi kiểu giống. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường
ống phấn là phương pháp mới, có ưu điểm thao tác đơn giản, tỷ lệ chuyển gen
khá cao, khắc phục được những hạn chế của tái sinh và có thể chuyển gen vào

bất kỳ giống bông nào. Mặc dù, cũng có nhược điểm như quy mô chuyển gen
lớn, tốn nhiều công lao động, phụ thuộc vào ngoại cảnh, nhưng phương pháp
chuyển gen này đang ngày càng được quan tâm sử dụng.
Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương
pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu
xanh (Helicoverpa armigera Hübner)” được tiến hành.
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương
pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng lọc, đánh giá và chọn
lọc cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển lĩnh vực
khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu.

3
- Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực
cho công tác chọn tạo giống bông truyền thống và làm cơ sở áp dụng để chọn
tạo các loại giống cây trồng kháng sâu khác.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu
xanh để làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu,
nhằm cung cấp cho sản xuất bông hàng hóa trong nước.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản
xuất, góp phần giảm thiểu rủi ro cho nông dân, giảm chi phí sản xuất, hạ giá
thành sản phẩm, tăng thu nhập cho người trồng bông, bảo vệ môi trường sống
và tính bền vững của hệ thống sản xuất nông nghiệp.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản
xuất, tạo bước tăng trưởng đột phá về diện tích và sản lượng, từng bước đáp
ứng nhu cầu bông xơ ngày càng tăng của ngành dệt may Việt Nam.
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài
3.1. Mục đích của đề tài

- Ứng dụng được phương pháp chuyển gen để chuyển thành công gen
CryIAc vào một số giống bông, đặc biệt là giống bông Việt Nam.
- Tạo ra một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao (tỷ lệ giết
sâu ≥ 80%) làm vật liệu quý cho chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước.
3.2. Yêu cầu của đề tài
- Chuyển được gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp
chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn.
- Sàng lọc, đánh giá và chọn lọc được một số dòng bông chuyển gen
kháng sâu xanh cao.

4
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài
- Giống bông SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166,
MCU9 và TM1.
- Gen CryIAc, vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc và pIBT-CryIAc,
vi khuẩn E.coli chủng DH5 và A. tumefaciens chủng C58.
- Sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner).
4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài
- Phạm vi nội dung nghiên cứu là chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng
phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy
qua đường ống phấn; và sàng lọc, đánh giá, chọn lọc cây chuyển gen bằng
kháng sinh, PCR và bio-test (nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng).
- Phạm vi không gian và thời gian là phòng thí nghiệm, nhà kính và nhà
lưới của Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật - Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố - Nhơn
Sơn - Ninh Sơn - Ninh Thuận; từ năm 2005 đến 2011.
5. Đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam:
- Tái sinh thành công một số giống bông bằng phương pháp tái sinh

thông qua tạo phôi soma và tạo đa chồi.
- Chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương
pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua
đường ống phấn.
- Tạo được 87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh. Đặc biệt, tạo
được 50 dòng kháng sâu xanh cao làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo
giống bông kháng sâu trong nước.

5
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam
1.1.1. Sơ lược về cây bông
Cây bông (Gossypium sp.) thuộc chi Bông (Gossipyum), họ Cẩm Quỳ
(Malvaceae). Chi Bông có 45-50 loài, trong đó, 40-45 loài nhị bội (2n = 2x =
26) và 5 loài tứ bội (2n = 4x = 52). Có 4 loài bông trồng trọt: 2 loài nhị bội là
loài bông Cỏ châu Á (G. arboreum L.) và bông Cỏ châu Phi (G. herbaceum
L.), có trung tâm khởi nguyên ở Ấn Độ, Tây Nam Châu Á (Cỏ châu Á) và
Đông Phi (Cỏ châu Phi); và 2 loài tứ bội là loài bông Luồi (G. hirsutum L.) và
bông Hải Đảo (G. barbadense L.), có trung tâm khởi nguyên ở trung Mỹ
(Luồi) và trung tâm Nam Mỹ (Hải Đảo) (Brubaker et al., 1999 [28]; Endrizzi
et al., 1984 [43]; Fryxell, 1992 [50]).
Loài bông Cỏ châu Á được trồng chủ yếu ở Ấn Độ và Pakistan, loài
bông Cỏ châu Phi chỉ được trồng ở vùng khô hạn của châu Phi và châu Á.
Hiện nay, loài bông Luồi và Hải Đảo chiếm ưu thế về diện tích và sản lượng
trên thế giới. Loài bông Hải Đảo có chất lượng xơ tốt, được trồng ở Liên Xô
(cũ), Xu Đăng, Pêru, Ấn Độ và một số quốc gia khác, cung cấp 8% sản lượng
bông xơ. Loài bông Luồi có chất lượng xơ kém hơn bông Hải Đảo, nhưng cho
năng suất cao hơn và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đóng góp
90% sản lượng bông xơ (Zhang et al., 2007) [145].

1.1.2. Tình hình sản xuất bông trên thế giới
Theo ICAC (2012) [67], trong niên vụ 2010/2011, diện tích trồng bông
trên toàn thế giới khoảng 33,3 triệu ha, sản lượng đạt 25,1 triệu tấn bông xơ
và có giá trị trên 50 tỷ USD. Trong đó, gần 80% diện tích trồng và 83,5% sản

6
lượng bông xơ là của Ấn Độ (11,1 triệu ha và 5,8 triệu tấn), Trung Quốc (5,2
triệu ha và 6,4 triệu tấn), Mỹ (4,3 triệu ha và 3,9 triệu tấn), Pakistan (2,8 triệu
ha và 1,9 triệu tấn), Uzbekistan (1,3 triệu ha và 0,9 triệu tấn) và Braxin (1,4
triệu ha và 2,0 triệu tấn).
Trên thế giới, có gần 100 quốc gia trồng bông, nhưng diện tích trồng
lớn tập trung chủ yếu ở một vài nước. Hơn 3 thập kỷ gần đây, có 4 quốc gia
dẫn đầu về sản xuất bông và đóng góp lớn vào tăng trưởng sản lượng bông
của thế giới là Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ và Pakistan. Ở niên vụ 1970/1971, 4
nước này đóng góp tới 48% sản lượng bông xơ thế giới, đến niên vụ
2009/2010, tỷ lệ này là 75%. Đặc biệt, sự gia tăng sản lượng bông xơ của
Trung Quốc và Ấn Độ làm cho tỷ lệ đóng góp của Châu Á vào sản lượng
bông xơ thế giới tăng từ 35% (niên vụ 1980/1981) đến 65% (niên vụ
2009/2010) (Babacan et al., 2010) [19].
Từ 1950 đến nay, năng suất bông thế giới trải qua các giai đoạn tăng
trưởng chậm xen kẽ với giai đoạn tăng trưởng nhanh, nhưng sản lượng bông
xơ liên tục tăng từ niên vụ 1977/1978 (khoảng 12 triệu tấn) đến niên vụ
2003/2004 (khoảng 26,5 triệu tấn). Việc chấp thuận và trồng ngày càng nhiều
bông chuyển gen dẫn đến năng suất bông tăng vọt trong giai đoạn 1999/2000-
2003/2004. Tuy nhiên, năng suất và sản lượng bông xơ dường như bước vào
giai đoạn tăng trưởng chậm từ niên vụ 2005/2006, do tỷ lệ mở rộng diện tích
trồng bông chuyển gen bị chậm lại (Babacan et al., 2010) [19]. Trong vài thập
kỷ tới, hy vọng những tiến bộ mới về công nghệ có thể tạo ra giai đoạn tăng
trưởng mới về năng suất và sản lượng bông xơ.
1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghề trồng bông có từ lâu đời. Theo nhiều tài liệu nghiên
cứu, nghề trồng bông ở Việt Nam bắt nguồn từ Ấn Độ, các giống bông được
trồng đầu tiên thuộc loài bông Cỏ châu Á, loài bông Luồi mới du nhập vào

7
Việt Nam khoảng cuối thế kỷ 19, đầu thế kỷ 20 (Hoàng Đức Phương, 1983 [9];
Vũ Công Hậu, 1962 [6]; 1971 [7]).
Đến năm 1975, nghề trồng bông ở Việt Nam được củng cố trở lại và
ngày càng phát triển, nhằm tự túc một phần nguyên liệu dệt may. Từ đó,
nghiên cứu chọn tạo giống bông mới để cung cấp cho sản xuất được nhà nước
hết sức quan tâm. Qua 20 năm nghiên cứu (1976-1996), đã thuần hóa, chọn
tạo và đưa vào sản xuất nhiều giống bông Luồi như TH1, TH2, M456-10,
MCU5, MCU9, LRA5166, TM1, D16-2, C118… Nhờ đó, các vùng trồng
bông ngày càng mở rộng tại miền Đông Nam bộ, duyên hải miền Trung và
Tây Nguyên. Mặc dù, các giống này cho năng suất khá cao (khoảng 0,8 tấn
hạt/ha) nhưng vẫn chưa ổn định trước những biến đổi bất lợi của các tiểu
vùng sinh thái trồng bông rất đa dạng. Bên cạnh đó, các giống này không có
khả năng kháng một số loại sâu hại chính như sâu xanh, rầy xanh, đồng thời
chất lượng xơ vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp dệt may, nên
sản xuất bông của nước ta trong giai đoạn này gặp nhiều khó khăn, diện tích
trồng bông hàng năm trong cả nước chỉ dao động khoảng dưới 10 nghìn ha
(Nguyễn Hữu Bình và Đào Hữu Vinh, 1998) [2].
Từ năm 1990 trở đi, Việt Nam nhập nội và thử nghiệm một số giống
bông lai từ Ấn Độ, đồng thời đẩy mạnh nghiên cứu sử dụng ưu thế lai, tập
trung vào giống lai cùng loài bông Luồi. Kết quả sử dụng giống lai nhập nội
Bioseed7 và giống lai nội địa đầu tiên L18, VN20 và VN35 thành công trong
sản xuất, đã góp phần mở rộng diện tích đáng kể và tăng năng suất 1,5-2 lần
(từ 0,6-0,7 tấn/ha lên 1-1,2 tấn/ha). Cho dù, các giống bông lai L18, VN20 và
VN35 có ưu thế lai cao về năng suất, chất lượng, có khả năng kháng rầy xanh
trung bình đến khá, nhưng chúng không có khả năng kháng sâu xanh, nên

năng suất bông thường bấp bênh. Vì vậy, diện tích sản xuất bông ở giai đoạn
này mặc dù có tăng nhưng còn chậm, tổng diện tích sản xuất bông của cả

8
nước trong giai đoạn 1996-1997 khoảng hơn 10 nghìn ha, sản lượng chỉ đáp
ứng 7-10% nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt may trong nước (Nguyễn Hữu
Bình và Đinh Hữu Vinh, 1998) [2].
Từ năm 1996/1997, việc nhập nội các nguồn gen quý kháng sâu, kháng
rầy xanh, chịu thuốc trừ cỏ… đã giúp công tác chọn tạo giống bông nước ta
có bước đột phá mới. Từ năm 2000 đến nay, nhiều giống bông lai mới lần
lượt ra đời, áp dụng vào sản xuất, đáp ứng kịp thời nhu cầu đa dạng hóa giống
sản xuất trên các vùng sinh thái trồng bông của Việt Nam, trong đó, nổi bật
nhất là VN15, VN01-2, VN02-2, VN04-3, VN04-4 và VN04-5. Các giống
này, bên cạnh khả năng cho năng suất với ưu thế lai khá cao (20-30%), còn có
khả năng kháng sâu xanh. Trong đó, giống VN01-2 bên cạnh khả năng kháng
sâu xanh còn có khả năng kháng rầy xanh, giống VN02-2 có khả năng kháng
sâu xanh và chịu thuốc trừ cỏ. Chính nhờ áp dụng nhanh tiến bộ mới về
giống, đã góp phần quan trọng giúp cho sản xuất bông có bước tăng trưởng
nhanh chóng, diện tích sản xuất bông của cả nước tăng cao nhất trong giai
đoạn này đạt 32.267 ha (niên vụ 2002/2003) với năng suất bình quân 1,5-2
tấn/ha (Viện Nghiên cứu và Phát triển cây Bông, 2006) [14]. Tuy nhiên, bắt
đầu từ niên vụ 2006/2007, diện tích trồng bông của ta bắt đầu giảm sút còn
17.300 ha và đến niên vụ 2007/2008 chỉ còn 7.324 ha. Hiện nay, diện tích sản
xuất bông hàng năm của Việt Nam dao động khoảng 8-10 nghìn ha (Viện
Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố, 2010) [16].
Cho nên, thời gian tới, để khôi phục và phát triển cây bông theo như
yêu cầu và chỉ tiêu nêu ra trong Quyết định 29/QĐ-TTg [13], bên cạnh áp
dụng các giải pháp quy hoạch, đầu tư, tài chính…, thì giải pháp khoa học
công nghệ mà trong đó có đẩy mạnh nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học
để tạo giống bông chuyển gen kháng sâu mới, có năng suất cao, chất lượng xơ

tốt, phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam là rất cần thiết.