Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme mannanase cố định trên chitosan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHĐN
KHOA HĨA


ĐỒ ÁN CƠNG NGHỆ 2

ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ NHÀ MÁY SẢN XUẤT MANNANASE CỐ
ĐỊNH VỚI NĂNG SUẤT 800 TẤN SẢN PHẨM/NĂM

GVHD

: TS. Nguyễn Hoàng Minh

SVTH

: Trần Thu Trang

LỚP

: 17SH

MSSV

: 107170278


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Đà Nẵng, 2021

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bài đồ án Công nghệ 2 này trước hết em xin gửi đến q thầy,cơ
giáo trong khoa Hóa trường Đại học Bách Khoa - ĐHĐN lời cảm ơn chân thành.
Đặc biệt, em xin gởi đến cơ – TS. Nguyễn Hồng Minh, người đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ em hồn thành đồ án này lời cảm ơn sâu sắc nhất.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn đã đồng hành, giúp đỡ tôi, hỗ trợ tôi
rất nhiều khi làm bài đồ án
Vì kiến thức bản thân cịn hạn chế, trong q trình làm đồ án, em khơng tránh
khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ cơ cũng như tồn
thể thầy cơ khoa Hóa để đồ án của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Trang 2
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

GVHD: TS. Nguyễn Hồng Minh

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 2
Họ và tên sinh viên: Trần Thu Trang

Mã số sinh viên: 107170278

Lớp: 17SH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khoa: Hóa

1. Tên đề tài:
Thiết kế phân xưởng sản xuất enzyme mannanase cố định năng suất 800 tấn
sản phẩm / năm.
2. Nội dung của đồ án:
-

Tổng quan tài liệu

-

Chọn và thuyết minh dây chuyền cơng nghệ

-

Tính cân bằng vật chất

-

Tính và chọn thiết bị

-

Kết luận

-

Tài liệu tham khảo

3. Các bản vẽ
-

Bản vẽ mặt bằng phân xưởng sản xuất chính

(A3)

-

Bản vẽ mặt cắt phân xưởng sản xuất chính

(A3)

4. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoàng Minh
5. Ngày giao đề tài
6. Ngày hoàn thành đề tài
Đà Nẵng, ngày tháng năm 2021
Tổ trưởng bộ môn

Giáo viên hướng dẫn

Trang 3
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Mục Lục
MỤC LỤC HÌNH.............................................................................................................. 6
MỤC LỤC BẢNG.............................................................................................................7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................9
1.1

Tổng quan về Mannanase...................................................................................9

1.1.1

Giới thiệu Mannanase..................................................................................9

1.1.2

Nguồn phân lập............................................................................................9

1.1.3

Cấu tạo.......................................................................................................10

1.1.4

Cơ chế tác dụng của Mannanase................................................................10

1.1.5

Ứng dụng của Mannanase..........................................................................11

1.1.5.1 Ứng dụng trong sản xuất bột giấy...............................................................11
1.1.5.2 Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn ni...............................................11
1.1.6
1.2

Tình hình nghiên cứu Mannanase...............................................................12

Vi sinh vật sản xuất Mannanase........................................................................12

1.2.1

Giới thiệu về Aspergillus Niger..................................................................13

1.2.2

Đặc điểm sinh học[8].................................................................................14

1.2.3

Đặc điểm sinh hóa[8].................................................................................14

1.2.4

Ứng dụng của Aspergillus Niger.................................................................15

1.2.5

Tách và thu nhận enzyme endo-beta-1,4-mannanase.................................16

1.3

Enzyme cố đinh.................................................................................................16

1.3.1

Giới thiệu....................................................................................................16

1.3.2

Các phương pháp cố định enzyme..............................................................17

1.3.3

Chất mang Chitosan...................................................................................17

1.3.4

Cố định Enzyme mannanase lên chất mang Chitosan................................17

CHƯƠNG 2: CHỌN VÀ THUYẾT MINH QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ.........................19
2.1

Chọn dây chuyền công nghệ..............................................................................19

2.2

Thuyết minh dây chuyền công nghệ...................................................................20

2.2.1

Chuần bị chất mang....................................................................................20

2.2.2

Xử lý nguyên liệu........................................................................................20

2.2.3

Phối trộn.....................................................................................................22

2.2.4

Thanh trùng................................................................................................23
Trang 4

SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

2.2.5

Làm nguội...................................................................................................23

2.2.6

Chuẩn bị vi sinh vật....................................................................................23

2.2.7

Lên men......................................................................................................24

2.2.8

Nghiền mịn.................................................................................................25

2.2.9

Trích ly........................................................................................................26

2.2.10 Lọc...............................................................................................................26
2.2.11 Cố định enzyme lên chất mang...................................................................26
2.2.12 Ly tâm.........................................................................................................27
2.2.13 Rửa.............................................................................................................27
2.2.14 Phối trộn chất bảo quản.............................................................................27
2.2.15 Sấy phun.....................................................................................................27
2.2.16 Đóng gói.....................................................................................................28
CHƯƠNG 3: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT..................................................................29
3.1 Kế hoạch sản xuất của phân xưởng.......................................................................29
3.2 Cân bằng vật chất.................................................................................................30
3.2.1

Bao gói.......................................................................................................31

3.2.2

Sấy..............................................................................................................32

3.2.3

Phối trộn.....................................................................................................32

3.2.4

Rửa.............................................................................................................33

3.2.5

Ly tâm.........................................................................................................34

3.2.6

Cố định Enzyme.........................................................................................35

3.2.7

Chuẩn bị chất mang....................................................................................35

3.2.8

Lọc.............................................................................................................. 38

3.2.9

Trích ly........................................................................................................39

3.2.10 Nghiền........................................................................................................40
3.2.11 Lên men......................................................................................................40
3.2.12 Làm nguội...................................................................................................41
3.2.13 Thanh trùng................................................................................................41
3.2.14 Phối trộn.....................................................................................................42
3.3

Tính lượng giống cần cho lên men....................................................................44

3.3.1 Nhân giống sản xuất.......................................................................................44

Trang 5
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

3.3.2 Nhân giống cấp II..........................................................................................45
3.3.3 Nhân giống cấp I.............................................................................................45
3.3.4 Hoạt hóa giống..............................................................................................46
3.4

Tổng kết.............................................................................................................46

CHƯƠNG 4: TÍNH TỐN VÀ LỰA CHỌN THIẾT BỊ...................................................49
4.1 Cơng thức tính số thiết bị sử dụng:.......................................................................49
4.2 Tính thiết bị cho công đoạn chuẩn bị enzyme........................................................49
4.2.1 Máy sàng.........................................................................................................49
4.2.2 Thiết bị phối trộn...........................................................................................50
4.2.3 Thiết bị thanh trùng.........................................................................................52
4.2.4 Thiết bị lên men:.............................................................................................53
4.2.5. Thiết bị nhân giống sản xuất:.........................................................................54
4.2.6 Thiết bị tiệt trùng khay:..................................................................................55
4.2.7 Thiết bị nghiền................................................................................................56
4.2.8 Thiết bị trích ly................................................................................................57
4.2.8 Thùng cố định enzyme.....................................................................................58
4.2.9 Thiết bị ly tâm.................................................................................................59
4.2.10 Lựa chọn thiết bị rửa.....................................................................................61
4.2.11 Lựa chọn thiết bị sấy.....................................................................................62
4.2.12 Thiết bị sấy phun [40]...................................................................................64
4.2.13 Bơm ly tâm:...................................................................................................65
4.2.14 Bơm định lượng:...........................................................................................66
4.2.15 Lựa chọn thiết bị bao gói..............................................................................67
4.3 Tính bunke.............................................................................................................69
4.3.1 Bunke chứa cám gạo.......................................................................................70
4.3.2 Bunke chứa bã đậu nanh.................................................................................70
4.3.3 Bunke chứa canh trường nấm mốc..................................................................71
4.3.4 Bunke chứa canh trường sau làm nguội..........................................................71
4.4. Thiết bị tháo dỡ tự động.......................................................................................72
4.5 Tổng kết.................................................................................................................73
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................74

Trang 6
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH

ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Trang 7
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

MỤC LỤC HÌNH
Hình 1: Enzyme mannanase [1].......................................................................................9
Hình 2: Cơ chế tác dụng của endo-beta-1,4-mannanase [7]..........................................11
Hình 3: Hình ảnh hiển vi (độ phóng đại 100 lần) của Aspergillus niger , được ni
cấy trên mơi trường thạch Sabouraud [13]....................................................................14
Hình 4: Hình ảnh chi tiết của A. niger [13]....................................................................15
Hình 5: Thu nhận endo-beta-1,4-mannanase từ Aspergillus Niger.................................16
Hình 6: Bột cám gạo.......................................................................................................20
Hình 7: Bã đậu nành khơ................................................................................................21
Hình 8: Máy phối trộn nằm ngang [22]..........................................................................22
Hình 9: Máy sàng lọc GY-450 [23]................................................................................49
Hình 10: Máy trộn bột nằm ngang [22]..........................................................................51
Hình 11: Thiết bị tiệt trùng UHT dạng tấm [24].............................................................52
Hình 12: Thiết bị tiệt trùng dạng đường hầm [25].........................................................55
Hình13: Máy nghiền [26]...............................................................................................56
Hình 14: Thiết bị trích ly hoạt động liên tục dạng roto [27]...........................................57

Hình 15: Thiết bị khuấy trộn [28]...................................................................................58
Hình 16: Thiết bị ly tâm [29]..........................................................................................60
Hình 17: Thiết bị rửa băng chuyền[30]..........................................................................61
Hình 18: Thiết bị sấy rung tầng sơi [31].......................................................................63
Hình 19: Thiết bị sấy phun [32].....................................................................................64
Hình 20: Bơm ly tâm Ebara model CMD [33]...............................................................65
Hình 21: Bơm định lượng của hãng Doseuro D 050N-30...............................................66
Hình 22: Thiết bị bao gói dạng bột DXD-40B [35]........................................................68
Hình 23: Bunke..............................................................................................................69
Hình 24: Cơ cấu tháo dỡ tự động canh trường nấm mốc [35].......................................72

Trang 8
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

MỤC LỤC BẢNG
Bảng 1: Nguồn thu nhận enzyme mannanase [3].............................................................9
Bảng 2: Thành phần hóa học của cám gạo[19]..............................................................21
Bảng 3. Giá trị dinh dưỡng của bã đậu nành.................................................................22
Bảng 4: Thành phần môi trường thạch sapec:................................................................23
Bảng 5: Biểu đồ sản xuất của nhà máy:.........................................................................29
Bảng 6: Bảng tỷ lệ hao hụt qua các công đoạn...............................................................30
Bảng 7 : Tỉ lệ nguyên liệu...............................................................................................36
Bảng 8: Độ ẩm nguyên liệu trước và sau phối trộn........................................................42
Bảng 9 Thành phần môi trường sapec:...........................................................................44
Bảng 10: Bảng tổng kết các công đoạn:........................................................................46

Bảng 11: Nhu cầu nguyên liệu dung trong ngày.............................................................47
Bảng 12: Các thông số kỹ thuật của máy sàng [30].......................................................50
Bảng 13:Thông số kĩ thuật: Máy trộn số hiệu CH-50.....................................................52
Bảng 14: Thông số kĩ thuật thiết bị tiệt trùng [32].........................................................53
Bảng 15 : Các thông số kỹ thuật của máy tiệt trùng dạng đường hầm PLB...................55
Bảng 16: Các thông số kỹ thuật của máy trích ly hoạt động liên tục dạng roto..............58
Bảng 17: Các thông số kỹ thuật của máy khuấy trộn IT-04............................................59
Bảng 18: Các thông số kỹ thuật của máy ly tâm đĩa ly Flottweg AC 1000 Separation
........................................................................................................................................ 60
Bảng 19: Các thông số kỹ thuật của máy rửa băng chuyền............................................62
Bảng 20: Thông số thiết bị sấy rung...............................................................................63
Bảng 21: Thông số thiết bị sấy.......................................................................................65
Bảng 22 : Các thông số kỹ thuật của bơm ly tâm............................................................65
Bảng 23: Số lượng bơm ly tâm qua các công đoạn........................................................66
Bảng 24: Các thông số kỹ thuật của bơm định lượng.....................................................66
Bảng 25: Số lượng bơm định lượng qua các công đoạn.................................................67
Bảng 26: Các thông số kỹ thuật của cơ cấu tháo dỡ tự động..........................................72
Bảng 27 :Tổng số thiết bị cần dùng................................................................................73

Trang 9
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

LỜI MỞ ĐẦU

Mannanase là một enzyme được sử dụng rộng rãi hiện nay. Nó có rất nhiều ứng

dụng cần thiết trong cuộc sống của chúng ta như góp phần sản xuất thức ăn gia súc, gia
cầm, ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy. Do vậy việc sản xuất enzyme này và
các chế phẩm của nó là rất cần thiết.
Bên cạnh đó, Chitosan đã được nghiên cứu rộng rãi về khả năng cố định
enzym. Nó mang lại hiệu quả tốt khi sử dụng để cố định Mannanase. Enzyme này khi cố
định lên chitosan khơng làm mất đi hoạt tính của nó mà cịn đem lại nhiều lợi ích đáng
kể hơn.
Dể hiểu rõ hơn về loại Enzyme này cũng như quy trình tạo ra nó, trong bài đồ án
này, tơi xin giới thiệu và trình bày về phương pháp sản xuất Mannanase cố định trên vi
hạt Chitosan.

Trang 10
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về Mannanase
1.1.1 Giới thiệu Mannanase
Mannanase là một loại enzyme tự nhiên có tác dụng phân hủy polysaccharide
được tạo ra từ mannose, là một loại đường đơn. Ở nhiều loài thực vật, mannanes trong
hạt là nguồn dự trữ carbohydrate [1].
Mannanase hay còn gọi là hydrolases glycoside. Được biết Hydrolases glycoside
là một nhóm phổ biến rộng rãi của các enzym thủy phân polysaccharides.
Điển hình như Enzyme endo- beta-1,4-mannanase là một thành phần trong cụm
mannase, đây là enzyme thủy phân đường glycosyl của mạch polymannan tạo ra các
manno-oligosaccharide nên có vai trị phân hủy hemicellulose trong sinh khối thực vật.

Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và đồ uống,
công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt là trong ngành công nghiệp sản xuất bột
giấy và giấy [2]

Hình 1: Enzyme mannanase [1]
1.1.2 Nguồn phân lập
Có rất nhiều nguồn để thu nhận Mannanase từ tự nhiên
Bảng 1: Nguồn thu nhận enzyme mannanase [3]
Từ tự nhiên
- Nấm mốc

Từ vi khuẩn
- Bacillus sp

Trang 11
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

- Nấm men
- Tảo biển/ tảo nước ngọt
- Hạt nảy mầm - Động vật …
- Bã cơm dừa, bã men,…

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

- Streptomyces
- Caldibacillus cellulovorans
- Caldicellulosiruptor Rt8B

- Caldocellum saccharolyticum …

Tuy nhiên, việc sử dụng mannanase trong các ngành cơng nghiệp cịn hạn chế do
hiệu suất sinh tổng hợp enzyme này của vi sinh vật tự nhiên cịn thấp, chi phí sản xuất
enzyme còn cao. Mặt khác, các chủng sinh tổng hợp mannanase trong tự nhiên thường
đồng thời sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác làm ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng
enzyme[3]
1.1.3 Cấu tạo
Mannanase có nguồn gốc khác nhau thì có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác
nhau:
Ví dụ : Endo-beta-1,4-mannanase của Pseudomonas cellulose bao gồm 423 axit
amin, với cấu trúc chia thành 3 vùng : vùng A từ Prolin 44 đến Isoleucin 323, vùng B từ
Leucin 32 đến Tryptophan 360 và vùng C từ Threonin 392 đến Threinin 419. Các chuỗi
Arg 39-Lys 43, Arg 324-Gly 331, Arg 361-Thr 391, và Leu 420-Lys 423 có chức năng
nối các vùng trên lại với nhau. Toàn bộ phân tử endo-beta-1,4-mannanase được cấu tạo
bởi 8 chuỗi xoẵn anpha và 8 chuỗi beta.
1.1.4 Cơ chế tác dụng của Mannanase
Endo-beta-1,4-mannanse có tác dụng thủy phân liên kết beta-1,4-mannosidic
trong chuỗi polysaccaride galactomannan, glucomannan, galactoglucomannan và
mannan. Sự thủy phân mannan và các hợp chất của mannan bằng beta-1,4-mannanase
tạo ra các sản phẩm là beta-D mannooligosaccharides và hỗn hợp các oligosaccharides
có chứa các D-mannose, D-glucoe và D-galactose. [7]

Trang 12
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

endo-beta-1,4-mannanase

Hình 2. Cơ chế tác dụng của endo-beta-1,4-mannanase [7]
Giải thích : Mannanase (beta-1,4-mannan mannohydrolase) phân cắt liên kết beta1,4-mannosit trong mạch mannan do vậy nó xúc tác thủy phân mannan, glucomannan,
galactomannan và galatoglucomannan tạo thành mannobiose, mannotriose và hỗn hợp
các oligosaccarit.

1.1.5 Ứng dụng của Mannanase
1.1.5.1

Ứng dụng trong sản xuất bột giấy

Phần lớn tiềm năng ứng dụng của mannanase là trong việc sử dụng enzyme đó để
tấy trắng bột giấy. Để bột gỗ được hòa tan trước tiên phải tách và loại bỏ lignin. Trước
đây việc loại bỏ là phá hủy mối liên kết lignin trong hemicelluloses, được tiến hành
trong dung dịch kiềm[6] Mặt hạn chế của phương pháp này là chỉ đạt hiệu quả cao với
bột gỗ mềm và nó cũng gây vấn đề ô nhiễm đến môi trường.
Việc sử dụng mananase trong tẩy trắng bột giấy không những mang lại kết quả tốt
như việc sử dụng dịch kiềm để loại bỏ lignin mà còn khắc phục được những vấn đề về ơ
nhiễm mơi trường. Đây là lợi ích to lớn mà công nghệ tẩy trắng bột giấy cần quan tâm.
Nó thực sự khả thi, tuy nhiên việc tẩy trắng bằng enzyme địi hỏi khi phá vỡ
hemicelluloses mà khơng làm hư hỏng chất lượng sản phẩm khi tác động vào các sợi
cellulose. Thành phần chính của bột gỗ mềm chiếm 15-20% là hemicelluloses, thành
phần cấu tạo là galactomannan, galactoglucomannan. Mannanase có lợi cho q trình
tẩy trắng bột giấy, máy móc, nó làm giảm bớt hoặc loại trừ những phần bị oxi hóa trong
q trình tẩy trắng [5].

Trang 13
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH

ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

1.1.5.2

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn ni

Ngồi ra Mannanase có nhiều cơng dụng khác như là một chất phụ gia trong
thức ăn gia súc, Beta-mananase là enzyme phân giải beta-mannan, Beta-mannan có mặt
trong bã đậu nành, và một số nguyên liệu thực vật khác. Các thí nghiệm trên heo được
tiến hành ở các giai đoạn phát triển khác nhau, kết quả cho thấy ß-mannanase có tác
động tích cực đến hiệu quả chăn nuôi (Petty et al, 2002, Hahn et al, 1995, Van Heugten,
2000). Ngồi ra mannanase cịn có trong trong các sản phẩm tiêu dùng có chứa chất tạo
gel và chất làm đặc kẹo cao su [2].
1.1.6 Tình hình nghiên cứu Mannanase
Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, đặc biệt là sự phát triển của các kĩ
thuật sinh học phân tử tạo ra tiềm năng lớn để sản xuất mannanase từ vi sinh vật. Công
nghệ gene cung cấp khả năng để hiện thị chỉ một loại enzyme mong muốn trong các vật
chủ mà không sinh tổng hợp enzyme có liên quan.
Có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về Mannanase hiện nay cả về trong nước và
thế giới như:
i. Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo Prebiotic Mannooligosaccharide bằng
Endo-β-1,4-Mannanase từ Aspergillus Niger của các tác giả Đỗ Biên Cương,
Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu thuộc Viện CN Sinh học và CN
Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
ii. Nghiên cứu thu nhận endo-beta-1,4-mannanase theo phương pháp lên men bề
mặt, ứng dụng trong sản xuất thức ăn gia súc. Của TS. Đỗ Biên Cương giảng

viên Trường Đại học Bách khoa Hà Nội vào năm 2005.
iii. Nghiên cứu quá trình cố định chất xúc tác sinh học beta-mannanase and
chitosanase trên bề mặt tế bào Lactobacillus plantarum hướng đến việc phát
triển tế bào vi khuẩn thành chất xúc tác sinh học. Tác giả TS. Nguyễn Hoàng
Minh trường đại học Bách Khoa Đà Nẵng cùng các tác giả Mathiesen G, Elena
Maria Stelzer, Mai Lan Pham, Katarzyna Kuczkowska, Alasdair Mackenzie, Jane
W. Agger, Vincent G. H. Eijsink, Montarop Yamabhai, Clemens K. Peterbauer,
Dietmar Haltrich, Thu-Ha Nguyen. Năm 2016
iv. Từ mannan đến cồn sinh học: bề mặt tế bào đồng hiển thị của β-mannanase và
β-mannosidase trên bề mặt Saccharomyces cerevisiae của tác giả Jun Ishii thuộc
Đại học Kobe, tác giả Fumiyoshi Okazaki thuộc Viện Khoa học Indonesia, tác giả
Kiyotaka Hara thuộc Đại học Shizuoka cùng các cộng sự vào tháng 9 năm 2016.
Và cịn rất nhiều cơng trình nghiên cứu khác mới mẻ và hấp dẫn đang được thực hiện
bởi nhiều nhà nghiên cứu.
1.2 Vi sinh vật sản xuất Mannanase

Trang 14
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Hiện nay, nguôn thu Mannanase dối dào và đang được quan tâm nghiên cứu là từ
các vi sinh vật. Nhiều cơng trình nghiên cứu cho kết luận rằng cả vi khuẩn, nẩm men,
nấm mốc đều có khả năng sinh tổng hợp Mannanase.
Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp Mannanase là : Aeromona, Bacillus,
Cellulomannan, Enterococcus, Casseliflavus, Pseudomonas, Streptomyces... Endo
Mannanase của vi khuẩn thường được tiết ra ngoài tế bào. Song ở một số loài vi khuẩn

như Sporocytophaga myxococoides, Aerobacter mannanolyticus và Xanthomonas
campestris cũng tôn tại endo Mannanase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào.
Các chủng nấm mốc gồm : Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Fomes
cennosus, Penicillin, Sclerotium, Trichoderma
Các chủng xạ khuẩn: Streptomyces,…
Các chủng nấm men: Talacromyce,…
Nghiên cứu trên 29 mẫu vật giàu mannan như gỗ mục, bã cơm dừa, bã cà phê,
quả hỏng, phân lập được 87 chủng sinh B-mannanase. Tần suất xuất hiện nấm sợi trên
các mẫu bã cà phê và cam hỏng cao hơn các mẫu khác. Chủng Aspergillus Niger phân
lập từ vỏ cam canh hỏng cho hoạt độ B-mannanase cao nhất (56,8 U/ml và 7,1 U/mg
protein, sau 144 giờ nuôi cấy). Hoạt độ B-mannanase của A. niger NCH-189, A. niger gr
và A. flavus gr đã được công bố lần lượt là 28, 26 và 24 U/ml [18]
Chính vì vậy việc lựa chọn A.Niger để phân lập Mannanase đem lại hiệu quả tốt
và năng suất cao.
1.2.1 Giới thiệu về Aspergillus Niger
1.2.1.1 Lịch sử phát hiện
Giống Aspergillus do Michelli lần đầu tiên được mô tả lần đầu vào năm 1729.
Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này.
Raper và Fennell (1965) chỉ dung một số tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo
thành bào tử trần. Như vậy, Asp.niger có vị trí phân loại như sau:
Lớp: Deuteromyces
Bộ: Moniliales
Họ: Moniliaceace
Giống: Aspergillus
1.2.1.2

Giới thiệu chung

Aspergillus niger là một loại nấm và là một trong những lồi phổ biến nhất của
chi Aspergillus, nó là một loại ưa nhiệt: nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của nó là 20-40 ° C,

sinh trưởng tốt ở 37 ° C. Nó có thể tồn tại ở 60 ° C nhưng, ví dụ như trong nước trái
cây, có thể bị chết khi tiếp xúc ở 63 ° C trong 25 phút
Nó gây ra một loại bệnh gọi là "mốc đen" trên một số loại trái cây và rau quả như
nho, mơ, hành tây và đậu phộng, và là chất gây ô nhiễm thực phẩm phổ biến. Nó có mặt
ở khắp nơi trong đất và thường được báo cáo từ môi trường trong nhà, nơi các khuẩn lạc
màu đen của nó có thể bị nhầm lẫn với khuẩn lạc Stachybotrys (lồi còn được gọi là
"mốc đen"). [8]
Trang 15
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Hình 3: Hình ảnh hiển vi (độ phóng đại 100 lần) của Aspergillus niger , được nuôi
cấy trên môi trường thạch Sabouraud [13]
Aspergillus niger gây ra bệnh mốc meo trên hành và cây cảnh. Nhiễm A. niger
cây hành có thể trở thành tồn thân, chỉ biểu hiện khi có điều kiện thuận lợi. A. niger gây
ra một bệnh sau thu hoạch phổ biến trên hành, trong đó có thể quan sát thấy các bào tử
đen nằm giữa các vảy của củ. Nấm cũng gây bệnh cho lạc và nho
Aspergillus niger ít gây bệnh cho người hơn một số loài Aspergillus khác. Trong
một số trường hợp cực kỳ hiếm, con người có thể bị ốm, nhưng điều này là do một bệnh
phổi nghiêm trọng, aspergillosis , có thể xảy ra. Đặc biệt, bệnh Aspergillosis thường xảy
ra ở những công nhân làm vườn hít phải bụi than bùn , có thể chứa nhiều bào
tử Aspergillus . Loại nấm này cũng được tìm thấy trong xác ướp của các ngôi mộ Ai Cập
cổ đại và có thể được hít vào khi chúng bị phân tán. [9]
1.2.2 Đặc điểm sinh học[8]
A.nigerlà vinh sinh vật hiếu khí bắt buộc, dị dưỡng hóa năng, sinh sản bằng
bào tử, sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8ºC, tối đa 45-47ºC, tối ưu 25-28 ºC,

độ ẩm tối thiểu 23%. Độ ẩm mơi trường thích hợp để lên men bán rắn là 60-65%.
A.nigersinh trưởng và phát triển khi có mặt O2, pH tối ưu 4-6,5. Tuy nhiên, theo Patt
(1981) cũng có những chủng Asp.nigersinh trưởng được ở pH=2.
Trên mơi trường thạch Czapek, Asp.nigermọc thưa, đường kính khuẩn lạc
khoảng 4cm. Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn lạc
Asp.nigermọc tốt và to hơn, đạt đường kính trung bình khoảng 6cm.
Trên mơi trường thạch malt, khuẩn lạc mọc tốt nhưng không to như trên môi
trường thạch Czapek-cao nấm men.
1.2.3 Đặc điểm sinh hóa[8]
Khả năng lên men đường:

A.nigercó khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như:
glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose. A.niger đồng hóa được
galactose, lactose ở mức độ kém hơn.
Khả năng tổng hợp enzyme:

Trang 16
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định









GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

α- amylase: A.niger có khả năng tổng hợp α- amylase ngoại bào để thủy
phân nhanh tinh bột tạo thành dextrin và một ít maltose và glucose.
Protease:A.niger có khả năng tạo thành 2 loại protease. Protease thứ nhất phân
giải protein thành polypeptid, pepton; protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản
phẩm trên thành acid amin.
Cellulase:A.nigercó khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase Cx
và b-glucosidase hay cellobiase.
Pectinase, Xylanase:A.nigercó khả năng tạo pectinase, xylanase ở nhiệt độ tối
thích 25 độ C, pH 5,6.
Ngồi ra, Asp.niger cịn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác như: lipase,
mananase.

1.2.4 Ứng dụng của Aspergillus Niger
Aspergillus niger được nuôi để sản xuất công nghiệp nhiều chất. [10] Nhiều
chủng A. niger khác nhau được sử dụng trong sản xuất công nghiệp axit xitric (E330)
và axit gluconic (E574), sản phẩm từ loài nấm này đã được Tổ chức Y tế Thế giới đánh
giá là có thể chấp nhận được để tiêu thụ hàng ngày . [11] A. niger lên men là "thường
được công nhận là an toàn" (GRAS) của Hoa Kỳ Food and Drug Administration
Nhiều enzym hữu ích được sản xuất bằng cách sử dụng q trình lên men cơng
nghiệp của A. niger . [12] Ví dụ, A. niger sản xuất Mannanase ứng dụng trong ngành
công nghiệp tẩy trắng giấy hoặc dùng làm phụ gia trong thức ăn chăn ni gia súc

Hình 4: Hình ảnh chi tiết của A. niger [13]
1.2.5

Tách và thu nhận enzyme endo-beta-1,4-mannanase.
Đối với mỗi nguồn thu enzym endo-beta-1,4-mannanase thì đều có mỗi cách thu

nhận khác nhau.[4][5]

Trang 17
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Dịch enzyme thơ

Kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4
Thẩm tích
Lọc qua màng
Tinh sạch bằng phương pháp
sắc ký trao đổi ion
endo-beta-1,4-mannanase

Hình 5: Thu nhận endo-beta-1,4-mannanase từ Aspergillus Niger
1.3 Enzyme cố đinh.
1.3.1 Giới thiệu
Enzyme cố định là enzyme được định vị vật lý vào một vài vùng xác định trên
chất mang mà vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể sử dụng lặp lại nhiều lần [14].
Có thể nói “enzyme cố định là enzyme được định vị trên các chất mang khơng hịa tan
được gắn với nhau bằng liên kết đồng hóa trị tạo nên đại phân tử enzyme khơng hịa tan”
[14]. Enzyme cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn enzyme tự do, có thể sử dụng lặp đi lặp
lại nhiều lần trong một thời gian dài; enzyme không tan không lẫn vào trong sản phẩm
nên không gây ảnh hưởng xấu đến màu sắc, mùi vị sản phẩm; có thể làm ngừng nhanh
chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng; enzyme

cố định khá bền với nhiệt độ, pH, dung môi hữu cơ…
Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme cố định cũng có những hạn chế nhất định như:
sự chuyển khối bị hạn chế, có thể mất hoạt tính sau khi cố định; khơng có hiệu quả đối
với cơ chất rắn, mất tính thích nghi hình thể… Những hạn chế trên là khơng đáng kể so
với những lợi ích mà enzyme cố định đem lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu
mới cũng như các công nghệ mới để cố định enzyme[14].

Trang 18
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Yếu tố quan trọng trong chế tạo enzyme cố định là lựa chọn chất mang. Các
polymer có thể được sửdụng làm chất mang để cố định enzyme bởi chúng có các nhóm
chức thích hợp và dễ biến đổi về mặt hóa học. Một trong những chất mang quan trọng
nhất cho mục đích này là các polymer tự nhiên như agarose và chitosan [15]
1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme
Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố định dựa trên cơ sở lý hóa
học như sau [20]:






Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố định khơng hịa tan có
mang hoặc khơng mang điện tích.

Phương pháp nhốt enzyme ở bên trong polymer tạo thành xung quanh enzyme
một hệ thống lưới có lỗ nhỏ để khơng cho phân tử enzyme đi khỏi màng, nhưng
các lôc đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra đi qua được dễ dàng.
Phương pháp hóa học: liên kết cộng hóa trị và liên kết ion
Phương pháp cố định enzyme trên vi sinh vật.

1.3.3 Chất mang Chitosan.
Chitosan là một polymer sinh học có bản chất hóa học là polysaccharide mạch
thẳng gồm các đơn vị D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine liên kết với nhau
thông qua kiểu liên kết β-(1,4)-glycoside [16].
Chitosan là một nguyên liệu tương đối rẻ, có tính trơ, ưa nước và tương thích về
mặt sinh học nên là một vật liệu phù hợp cho việc cố định enzyme. Hơn nữa, sự có mặt
của các nhóm amin (-NH2) của chitosan và enzyme dễ dàng tạo liên kết cộng hóa trị với
cầu nối, ví dụ các gốc aldehyde[16].
1.3.4 Cố định Enzyme mannanase lên chất mang Chitosan.
Chitosan đã được nghiên cứu rộng rãi về khả năng cố định enzym. Trong nghiên
cứu này, các vi hạt chitosan từ tính (MCM) được tổng hợp bằng ferrofluid, sử dụng
amoni bicacbonat để tạo chitosan khơng hịa tan; những vi cầu này được sử dụng để cố
định enzyme. Dung dịch axit axetic (1% w / v) được sử dụng làm dung môi phân tán
chitosan (2% w / v), sau cho phản ứng với ferrofluid (2% v / v) để 2 giờ với khuấy liên
tục, sau đó enzyme được thêm vào, và sau một thời gian, tất cả dung dịch được làm khô
trong máy sấy phun thu được vi cầu chitosan với enzyme cố định, việc xác định đặc tính
của vi cầu được thực hiện với hình ảnh hiển vi SEM / ESEM được xác nhậnhình thái
hình cầu. Quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDX) được sử dụng để phát hiện sắt
trong các mẫu [17].
Mannanase được cố định trên các vi cầu chitosan từ tính bằng cách quấn và liên
kết ngang với glutaraldehyde. Sự cố định được nghiên cứu để đạt được sự bảo tồn hoạt
tính của xúc tác. Sự xúc tác của mannanase cố định chấp nhận được khi so sánh với các

Trang 19

SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

đặc tính tương tự của enzym tự do. Đặc tính từ tính của những vật liệu này thể hiện sự
cho phép dễ dàng loại bỏ của enzyme sau khi sử dụng [17]

Trang 20
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

CHƯƠNG 2: CHỌN VÀ THUYẾT MINH QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
2.1 Chọn dây chuyền công nghệ
Bã đậu nành

Nấm Aspergillus
Niger

Cám gạo

Làm sạch, định lượng

Sắt Clorua:

FeCl2, FeCl3

Hoạt hóa
Phối trộn
Nhân giống cấp 1
Thanh Trùng

Trộn

Nhân giống cấp 2

Mảnh
Chitosan

Làm nguội

Rửa pH=7
Lên
(35)

Nhân giống đại trà

Men

Trộn
Nghiền

Dịch

Bã men

Sấy phun (60C)

Nước

Chất mang
Chitosan

Trích ly

Lọc
Cố định Enzym

Ly tâm

Nước

Tinh bột

Rửa

Nước thải

Phối trộn

Sấy

Đóng gói

Sản phẩm

Trang 21
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

2.2 Thuyết minh dây chuyền công nghệ
2.2.1 Chuần bị chất mang.
Nguyên tắc: Chuẩn bị mảnh chitosan để hấp phụ hạt nano sắt từ, đồng thời nhóm
-NH2 của chitosan có khả năng tạo liên kết đồng hóa trị với nhóm -CHO của
glutaraldehyde (chất tạo cầu nối giữa enzyme với chất mang).
Tiến hành chế tạo hạt nano sắt từ: Hạt nano sắt từ được điều chế và kiểm tra
cấu trúc tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội: Hạt nano sắt từ được điều chế từ hỗn hợp muối sắt FeCl2.4H2O và
FeCl3.6H2O với nồng độ thích hợp theo tỷ lệ mol Fe2+ : Fe3+ = 2 : 1. Dung dịch được
khuấy 600 rpm trong 30 min ở nhiệt độ 25-27 C. Sau đó thêm dung dịch NaOH 1M ,
pH = 10 thì dừng lại. Phản ứng tiếp tục được thực hiện trong 30 phút ở nhiệt độ 80 C
Lọc rửa hỗn hợp huyền phù thu được bằng nước cất đến pH 7,0. Sau đó sấy chân
khơng ở nhiệt độ 60C, P = 40 mbar trong 2 giờ. Hạt nano thu được được giữ trong môi
trường chân không để sử dụng gắn enzyme.
2.2.2 Xử lý nguyên liệu
Mục đích: Làm sạch và cân đủ lượng nguyên liệu
Tiến hành: Nguyên liệu đưa về được sàng lọc, loại bỏ tạp chất. Sau đó được làm
sạch sơ và đem đi định lượng. Yêu cầu đặt ra cho nguyên liệu là phải không lẫn nhiều
tạp chất, khi đó Enzyme thu được sẽ dễ dàng tinh sạch hơn
Cám gạo
Cám gạo là một phế phẩm khi xay xát hạt lúa để loại bỏ lớp vỏ tạo ra hạt gạo.

Trong cám gạo có chứa tương đối đủ các chất phù hợp cho sự phát triển của vi sinh vật
đặc biệt là nấm sợi, hàm lượng tinh bột chiếm lượng lớn.

Hình 6: Bột cám gạo

Trang 22
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Bảng 2: Thành phần hóa học của cám gạo[19]
S
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Thành phần

Đơn vị

Số lượng

Protein
Lipit
Gluxit tổng

%
%

12,20
22,70

%

40,30

%
%
mg/100g
mg/100g
mg/100g
mg/100g

6,30
6,50
30,00
4,60
14,00
0,96

số
Cellulose
Tro
Canxi
Photpho
Sắt
Vitamin B1

Cám gạo được gàu tải vận chuyển lên bunke chứa, sau đó được vít tải vận chuyển
từ bunke đến sàng phân loại. Cám gạo đạt yêu cầu được vít tải vận chuyển đến máy trộn.
Bã đậu nành
Là phế liệu thu được khi xay nhuyễn phần đậu đã tách ép lấy dầu thơng qua q
trình tinh chiết.

Hình7: Bã đậu nành khô

Trang 23
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Bảng 3. Giá trị dinh dưỡng của bã đậu nành
Thành phần
Chất khơ
Protein thơ
Chất xơ thơ
Chất xơ trong q trình chế biến

Phần trăm (%)
89
48
0.3
0.7

Bã đậu nành được gàu tải lên bunke chứa. Sau đó vít tải vận chuyển bã đậu nành
từ bunke đến máy nghiền. Sau khi nghiền xong, vít tải vận chuyển bã đậu nành đến máy
trộn.
2.2.3

Phối trộn
Mục đích: Trộn đều môi trường dinh dưỡng.

Tiến hành: Cho nguyên liệu sau khi đã làm sạch và định vào trong máy phối trộn và
tiến hành chạy máy

Hình 8: Máy phối trộn nằm ngang [22]
Nguyên liệu sau khi phối trộn phải đạt được độ hịa lẫn nhất định, được trộn đều
và khơng bị lẫn các chất khác khi trộn
2.2.4

Thanh trùng
Trang 24

SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH


ĐACN 2: Sản xuất Mannanase cố định

GVHD: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Mục đích: cám và các ngun liệu khác có chứa nhiều VSV, để đảm bảo chủng
ni phát triển bình thường cần phải thanh trùng.
Tiến hành:




Khởi động thiết bị trước 10 phút
Hấp thanh trùng dưới áp suất hơi 1÷ 1.5atm, nhiệt độ 140˚C thời gian 45-50 phút.
Đưa nguyên liệu ra khỏi thiết bị

2.2.5 Làm nguội
Mục đích: Nguyên liệu sau khi thanh trùng sẽ có nhiệt độ tương đối cao vì vậy cần
tiến hành hạ nhiệt độ xuống để nấm men có thể sinh trưởng và phát triển thuận lợi.
Tiến hành:




Khởi động máy làm nguội.
Sau khi hấp thanh trùng, môi trường được chuyển qua băng tải làm nguội đến nhiệt
độ khoảng 38÷ 40˚C.
Sau khi nguyên liệu đi qua hết bang tải thì kết thúc quá trình làm nguội.
Thời gian làm nguội phải ngắn để hạn chế sự nhiễm VSV.

2.2.6 Chuẩn bị vi sinh vật
Giống trong ống nghiệm được giữ ở trạng thái hoạt động bằng cách cấy truyền mỗi

tháng một lần trong các môi trường thạch sapec.
Bảng 4: Thành phần môi trường thạch sapec:

Nước

1000ml

Saccroza

30g

NaNO3

3g

KH2PO4

1g

MgSO4.7H2O

0.5g

KCL

0.5g

Trang 25
SVTH: Trần Thu Trang – Lớp 17SH