Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp market phân tử

1
PHẦN I: GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa,
cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả. Cây dứa với ưu thế
chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là
một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh
tế xã hội. Với tiềm năng kinh tế cao, diện tích dứa đang được mở rộng trên phạm vi cả
nước (36.541 ha năm 2002) (Tuấn và Tiến, 2002) nhằm tăng sản lượng cho tiêu dùng
và nguyên liệu cho các nhà máy chế biến ở các tỉnh như: Tiền Giang, Kiên Giang,
Long An, Hậu Giang, Thành Phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai.. Trước đây, dứa Queen
được trồng phổ biến ở nước ta nhưng có nhiều nhược điểm không phù hợp với công
nghệ cơ giới và tỉ lệ thành phần trong chế biến thấp. Chính vì thế, dứa Cayenne đang
là giống được quan tâm với nhiều đặc điểm tốt và diện tích trồng đạt 3600 ha năm
2002 ở các tỉnh phía Bắc và Đông Nam Bộ (Tuấn và Tiến, 2002). Tuy nhiên, diện tích
trồng mới nguồn vật liệu này vẫn còn thấp do nhu cầu giống chưa đủ và phần lớn
giống là nhập ngoại. Vì vậy, trước hết cần phải tìm hiểu tính đa dạng di truyền của
giống dứa Cayenne, trên cơ sở đó để thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống
đồng thời xây dựng các định hướng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các
giống cây trồng sẵn có trong nước cũng như du nhập từ nước ngoài.
Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài “nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa
Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử”.
Để nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị
(marker) DNA (RFLP, RAPD, AFLP, SSR..). Tuỳ vào đối tượng, điều kiện và mục
đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này
chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của dứa Cayenne bằng
marker RAPD.
Hy vọng kết quả của đề tài này sẽ đóng góp một phần nhất định vào tiền đề của

công tác chọn tạo giống dứa ở Việt Nam.



2
1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
- Tìm hiểu và sưu tầm nguồn gen của cây dứa Cayene bằng phương pháp chỉ thị
(marker) phân tử.
- Tìm hiểu sự đa dạng về kiểu hình của các dòng dứa từ giống Cayenne.
- Đề xuất vật liệu lai ban đầu cho công tác chọn và tạo giống dứa Cayenne.

1.2.2. Yêu cầu
- Thành thạo thao tác ly trích DNA.
- Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện.
- Nắm vững các kỹ thuật sử dụng chỉ thị RAPD
- Hiểu rõ về các phần mềm xử lý thống kê sinh học như NTSYS-pc, Excel,
IRRISTAT ...

3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Một số khái niệm về đa dạng sinh học
2.1.1. Đa dạng sinh học
Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên-WWF (Word Wildlife fund) (1989), đa
dạng sinh học được định nghĩa như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự
sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa
đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi
trường”.
Do vậy đa dạng sinh học được xem xét theo 3 mức độ:

- Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ
vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.
- Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần
thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể.
- Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các
loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh vật tồn
tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền,
2002).
- Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân
biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới .

2.1.2. Đa dạng di truyền
Các cá thể trong một quần thể thường có genome khác nhau. Sự đa dạng về
genome được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác
nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể
khác nhau là khác nhau. Những cây trồng được trồng lai ghép hay những động vật
được lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi
cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack, 1999).
Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ
tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến.

4
Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong
quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể
này thích nghi hơn với những thay đổi môi trường (Richard B. Primack, 1999).

2.1.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên
và nó cũng quan trọng đối với con người.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng

với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường. Sự đa dạng di
truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật
nuôi mới phục vụ lợi ích của con người.

2.2. Giới thiệu chung về dứa Cayene
2.2.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây dứa có tên khoa học Ananas comosus L. (Merrill), thuộc họ Bromeliaceae,
chi Ananas , trong chi này có 6 loài, trong đó loài Ananas comosus là có giá trị kinh tế
hơn cả. Dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, theo K.F Baker và J.L.Collin thấy xuất hiện ở
miền nam Braxin, bắc Achentina và Paragoay.
Theo Hume và Miller, các giống dứa đang trồng hiện nay được chia làm 3
nhóm: Cayene, Queen (hay còn gọi là Nữ hoàng), Spanish (hay Tây Ban Nha). Trong
đó nhóm Cayene được chia làm các giống như Smooth Cayene, Sarawak (giống có
khả năng chịu ẩm, úng và chống bệnh héo), Enville, Baron roth schild, Typhone,
Smooth Guatemalan...
Ở Việt Nam, theo đều tra nghiên cứu của viện nghiên cứu rau quả đã tập hợp
được 3 giống Cayenne được trồng ở nước ta gồm: Cayenne chân mộng trồng ở Vĩnh
Phú, Cayenne Phủ Quỳ trồng ở Nghĩa Đàn - Nghệ An, Cayenne Đức Trọng trồng ở
Lâm Đồng và ở Nam Bộ chủ yếu là Cayenne trơn nguồn gốc từ Pháp. Nguồn gốc của
các giống Cayene trồng ở nước ta thường nhập từ nước ngoài và qua tiến hành lai tạo
(Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002).

5
2.2.2. Giá trị kinh tế
Về mặt dinh dưỡng, dứa được xem là “hoàng hậu” trong các loại quả vì hương
vị thơm ngon và giàu các chất dinh dưỡng. Wooster và Blank (1950) đã phân tích
thành phần dinh dưỡng của quả dứa Cayenne ở Hawaii cho kết quả sau:
- Đường 11 - 15 %, saccharose chiếm 1/3, còn lại là glucose và fructose
- Acid: 0,6 % gồm 78 % acid citric, còn lại là acid malic và acid khác
- Hàm lượng các loại vitamin: vitamin A - 130 đơn vị quốc tế, vitamin B1 - 0,02

mg, vitamin C - 4,2 mg / 100 g
- Các chất khoáng: Ca - 16 mg, P - 11 mg, Fe - 0,3mg, Cu - 0,07 mg
- Protein - 0,4 g và lipit - 0,2 g
- Hydratcacbon - 13,7 g, nước 85,5 g và xenlulose - 1,4 g
Ngoài ra trong quả dứa còn có men bromelin giúp cho việc tiêu hoá rất tốt. Nó
được dùng trong công nghiệp thực phẩm, thuộc da, vật liệu làm phim...
Về hiệu quả kinh tế: Cayenne cho quả to, sản lượng cao, có thể đạt trên diện
tích lớn ở HaWaii 80 – 100 tấn / ha. Aubert cho rằng sản lượng Cayenne có thể gấp
đôi dứa Queen. Đồng thời, ưu điểm lớn của Cayenne là vỏ mỏng, nước nhiều, quả hình
ống, là loại hình lý tưởng để chế biến đồ hộp, dù là dứa khoanh hay nước dứa.Về mặt
canh tác, nhờ quả không có gai nên thao tác thuận lợi, hiệu suất lao động tăng lên
nhiều. Hiện nay ngành nông nghiệp nước ta đang có kế hoạch phát triển và mở rộng
diện tích dứa nhằm tăng sản lượng cho các nhà máy chế biến (Vũ Công Hậu, 1999).

2.2.3. Đặc điểm hình thái của dứa Cayenne
Dứa là một loại cây thảo lâu năm: sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân
tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một quả;
quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Các mầm nách của cây con lại cho phát triển và
cho một quả thứ ba.
Cây dứa trưởng thành cao 1,0 - 1,2 m và có hình dạng như một con cù (cù- thứ
đồ chơi của trẻ em) có đường kính khoảng từ 1,3 - 1,5 m, có đáy bẹt, tán cây xoè rộng.
Cấu tạo của dứa (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002) gồm có các thành phần sau:




6
2.2.3.1. Rễ
Rễ thường là bất định và mọc ngang mặt đất. Dựa vào nguồn gốc phát sinh chia
thành các dạng: rễ cái, rễ nhánh và rễ bất định. Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do

nhân giống bằng chồi (nhân giống vô tính) nên mọc từ thân ra, nhỏ và phân nhiều
nhánh. Ở tầng đất dày rễ có thể ăn sâu 0,9 m. Nhưng bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng
đất 10 - 26 cm và phát triển rộng đến 1 m.
Rễ dứa thuộc loại háo khí ưa xốp và thoáng nên trồng tốt nhất trên đất đồi
feralit đỏ vàng và kém phát triển trên đất cát, đất sét. Đồng thời rễ dứa phát triển tốt
trong đất có hàm lượng nước từ 10 – 20 %, độ pH thích hợp nhất từ 4.0 - 5.5, giới hạn
3.5 - 6.0. Để cho bộ rễ phát triển bình thường cần cung cấp dinh dưỡng N, P, K, Ca,
Fe, Mg, S…trong đó N, P có vai trò quan trọng. Thiếu N, P rễ phát triển kém, không ra
quả.
Sinh trưởng và phát triển của rễ bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt độ. Trong
phạm vi 12 - 30
0
C, nhiệt độ càng tăng bộ rễ phát triển càng mạnh và ngược lại. Nhiệt
độ giới hạn 5 - 43
0
C nếu cao hay thấp hơn trong nhiều ngày bộ rễ sẽ chết. Theo Mao
Tác nghiên cứu 3 giống dứa Cayenne ở Philippin, Đài Loan và Nam Ninh năm 1960
cho biết hoạt động của bộ rễ đạt đỉnh cao vào tháng 5 và tháng 10 do nhiệt độ các
tháng này tăng cao. Các nguyên liệu chồi khác nhau đem trồng đều có ảnh hưởng đến
sinh trưởng phát triển bộ rễ dứa.

2.2.3.2. Thân
Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần ở dưới đất.
Hình dạng của thân biểu hiện tình trạng của cây như thân ngắn, bặm chứng tỏ cây
khỏe, ngược lại thân dài bé là cây yếu. Thân cây dứa trưởng thành dài 20 - 30 cm,
đường kính 3 – 7 cm, trọng lượng 200 – 400 g. Ở trung tâm thân là một mô rỗng,
mềm, chứa các chất dinh dưỡng chứa nhiều tinh bột ở giữa, nối tiếp là một lớp bó
mạch có nhiều xơ, và ngoài cùng được bao bọc bởi một lớp biểu bì và gốc lá.
Thân mọc khỏe trong đều kiện nhiệt độ 25
0

C trở lên, nếu dưới 5
0
C thì ở đỉnh
thân và gốc lá bị những vết cháy do rét. Nếu vừa lạnh vừa mưa kéo dài thì đỉnh thân sẽ
bị thối. Trường hợp ngập nước thì cả rễ và thân đều bị thối.



7
2.2.3.3. Lá
Lá mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp
ngang và dài. Mặt lá và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác
dụng làm giảm độ bốc hơi nước cho lá. Hình dạng lá không có gai, trừ một vài cái gai
ở ngọn, màu xanh thẩm với đốm nâu đỏ, lá dài từ 80 – 100 cm, rộng 5 – 8 cm, khi
trưởng thành có khoảng 60 - 80 lá. Hình dạng lá thay đổi tuỳ theo vị trí, tuổi của chúng
từ đó dẫn đến việc sắp xếp chúng thành nhiều loại khác nhau. Diện tích lá lớn thì quả
thường to và ngược lại cho nên cần phải tìm cách tác động cho cây đạt được số lá tối
đa. Nhiệt độ giới hạn của dứa là 5 - 40
0
C. Trên 40
0
C cây ngừng hoạt động, ở 8
0
C cây
cũng ngừng ra lá, 5
0
C các hoạt động ngừng và dưới 0
0
C cây chết rét. Sinh trưởng của
lá còn bị ảnh hưởng bởi độ phì của đất. Bón phân bổ sung một cách hợp lý làm cho

cây sinh trưởng khỏe, bộ lá sum xuê. Vì vậy, ta cần phải cung cấp đủ lượng dinh
dưỡng và cân đối giữa NPK cùng các nguyên tố khác để đảm bảo cho bộ lá sinh
trưởng tốt.

2.2.3.4. Hoa, quả, hạt
Dứa trung bình có 150 hoa ,với lá bắc dưới hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6
nhị đực xếp thành 2 vòng, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh mờ với
biến sắc màu đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Trong
một năm dứa ra hoa nhiều vụ thường vào tháng 2 – tháng 3 và thu hoạch quả vào
tháng 6 – tháng 7.
Cuống quả của dứa có chiều dài so với chiều dài quả tương đối ngắn, trọng
lượng quả trung bình cao từ 2 - 4 kg / trái, hình trụ, mắt to và dẹt, màu đỏ da cam, khi
chín ở giữa mắt hơi nhô lên. Thịt quả khi chín ít nhiều trong, không xơ, màu vàng
nhạt. Vị ngọt và chua, đường kính lõi trung bình khoảng 2,5 cm.Trên ngọn quả dứa là
một chồi ngọn thường to và đơn độc. Theo Cl.Py và Tissesau (1960) nhiệt độ thích
hợp cho quả chín là 25
0
C nếu quá cao sẽ làm tăng độ chua trong quả và phẩm chất
kém.
Dứa không có hạt nếu để tự do. Nếu đem lai các giống khác nhau thì có thể có
hạt. Hạt dứa rất bé, có màu tím đen, hình trứng tròn chỉ dài độ 3 mm, mỗi quả con chỉ
có vài hạt. Hạt dứa nảy mầm rất yếu cần phải xử lý mới có tỷ lệ nảy mầm cao.


8
2.2.4. Đặc tính di truyền học
Năm 1931, J.L Collins và K.R.Kern đã xác định số nhiễm sắc thể của Ananas
Comosus và các loài lân cận là 2n = 50. Ở tất cả các loài A.comosus thì nhiễm sắc thể
đều nhỏ và hình cầu.
Một trong những đặc trưng di truyền thể hiện ở dứa là hình thái lá. Nó được

phân biệt thành 3 dạng:
- Lá chỉ có gai ở ngọn, đặc trưng cho Smooth Cayenne.
- Lá hoàn toàn có gai, trường hợp xuất hiện hầu hết ở các loài.
- Lá hoàn toàn không gai hay còn gọi với tên lá viền.
Tính trạng chỉ có gai ở ngọn và gai là những đôi tính trạng trong đó chỉ có gai ở
ngọn là tính trạng trội (S) và có gai là tính trạng lặn (s). Đều này chứng minh rằng
Cayenne là dị hợp tử và tất cả các loại có gai là đồng hợp tử với tính (s). Mặt khác,
tính trạng lá viền hay không viền là cặp tính trạng độc lập (P) và cân đối hơn với tính
trạng (S) (s). Đồng thời Collins đã chứng minh sự tồn tại của những gen khác, tất cả
những gen này hình như là những đôi tính trạng đối với gen „có gai‟.
Số lượng trung bình của chồi cuống trên một cây cũng là một đặc trưng di
truyền nhưng lại ảnh hưởng ngoại cảnh và sự phát triển sinh trưởng của dứa khi phân
hoá hoa tự. Đây là một đặc trưng quan trọng cần theo dõi bởi nó là vật liệu tốt để trồng
sau này và dễ xảy ra nhiều biến dị trong quá trình phát triển.
Một số biến dị di truyền thường xảy ra ở dứa ảnh hưởng về phương diện kinh tế
như: biến dị kéo dài ở quả, với hình dạng dài ra và đường kính bé; biến dị “quả khô”
tất cả bộ phận hoa đều không đậu, trừ các lá bắc, và trở thành biến dị “cổ chai” khi cho
các bộ phận hoa ở phần trên hoa tự không đậu; hay là những biến dị biểu hiện bằng
những lá sinh sôi nảy nở quanh các mắt hay tại mắt (Claude Py và m.A.tisseau, 1993).

2.2.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nƣớc và thế giới
2.2.5.1. Thế giới
Theo số liệu thống kê (Anon., 2002) thu thập từ FAO (Food and Agriculture
Organisation) của Hoa Kỳ, sản lượng dứa thế giới 1999 - 2001 là 13.527.149 triệu tấn
và ước tính sẽ ổn định trong 3 năm. Sản lượng trên thế giới đã tăng gấp 3 lần trong 30
năm qua (3.833.137 năm 1961 đến 13.738.735 năm 2001). Những nước đứng đầu về
sản lượng năm 2001 bao gồm Thái Lan (2.300.000 tấn), Philippine (1.571.904 tấn),

9
Brazil (1.442.300 tấn), Trung Quốc (1.284.000 tấn).. Những nước chiếm ưu thế về thị

trường dứa tươi (khoảng 670.000 tấn) như Costa Rica, Philippine và Cote d‟Ivoire; về
dứa đông lạnh là Thái Lan và Philippine (Rohrbach và ctv, 2003). Mỹ là nước nhập
khẩu dứa lớn nhất từ năm 1998 - 2000 bình quân 552597 ngàn USD / năm ở các dạng
dứa đóng hộp, tươi và cô đặc.
Theo thống kê, sản lượng giống dứa Smooth Cayene chiếm 70 % sản lượng thế
giới và hầu hết ở dạng đóng hộp (khoảng 95 %). Tuy nhiên giống này sản xuất ở dạng
dứa tươi chất lượng chưa tốt nên đã trở thành áp lực cho các nhà đầu tư đòi hỏi phải
cải thiện giống Cayenne để cung cấp dạng tươi tốt hơn (Sanewski and Scott, 2000).
Hiện nay, một số nước đang cố gắng phát triển giống Cayenne như Đài Loan,
Malaysia, Cuba, Brazil và Pháp.

2.2.5.2. Trong nƣớc
Theo số liệu điều tra của viện quy hoạch và thống kê nông nghiệp, diện tích dứa
Cayenne năm 2002 là 3.641 ha trồng ở 18 tỉnh, thành phố và con số này đã được gia
tăng trong những năm gần đây. Các tỉnh có diện tích dứa Cayenne nhiều như Ninh
Bình (700 ha), Nghệ An (695 ha), Hà Tỉnh (438 ha),(Tuấn và Tiến, 2002). Sản lượng
dứa tươi sản xuất cả nước theo tổng cục thống kê Nông-Lâm-Ngư dao dộng từ 263 –
316 ngàn tấn / năm trong đó Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm gần 71 %. Nguyên liệu
cung cấp cho các nhà máy chế biến đang trong tình trạng cung chưa đủ cầu do sự ra
đời của nhiều nhà máy chế biến dứa với công suất cao và kỹ thuật hiện đại như Đồng
Giao ở Tiền Giang, An Giang hay nhiều nhà máy nhỏ công suất nhỏ ở Hà Tỉnh, Hồ
Chí Minh, Cần Thơ..

2.3. Nguyên tắc và ứng dụng của một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di
truyền nhờ vào chỉ thị (marker)
2.3.1. Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị hình thái
Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát mà
sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng do tác động của môi trường, có thể được dùng
làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000).
Chỉ thị hình thái đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu về đa dạng di truyền

trên nhiều đối tượng khác nhau. Trong đó, có nhiều thành công trên thực vật như: ở

10
dứa, Duval và d‟Eeckenbrugge., (1993) đã phân tích 5 nhóm dứa trồng với 18 tính
trạng chất lượng và 27 tính trạng số lượng bao gồm đặc tính thực vật, hoa và trái. Kết
quả đã cho thấy sự tương đồng giữa các giống Cayenne, Queen và Pernambuco, trong
khi Mordilona và Spanish nằm trong nhóm khác.
Ngoài ra ở lúa, Kato và cs., (1928, 1930) bằng chỉ thị hình thái đã chia lúa trồng
thành 2 loài phụ Indica và Japonica. Sau này cũng bằng chỉ thị hình thái Morinaga
(1954) chia thêm một loài phụ thứ 3, Javanica.
Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình
nhưng chúng lại có những hạn chế nhất định: ảnh hưởng rất nhiều do tương tác kiểu
gen với môi trường, số lượng marker có giới hạn chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện
ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 2004).

2.3.2. Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị izozyme
Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác cùng một phản ứng,
nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau do đó có nhiều dạng và hiệu quả xúc tác
khác nhau.
Isozyme có bản chất protein và là chất đa điện ly, nên trong dung dịch nó ở
trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác
nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tích điện..sẽ chuyển động với tốc độ khác
nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di. Các phân tử protein
enzyme là do gen quy định. Trong quá trình tiến hoá, dưới tác động của môi trường
bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hình thành các allen khác nhau và nó
mã hoá cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khác nhau về trong lượng, kích
thước, lực tích điện..Vì vậy, dùng phương pháp điện di có thể tách được các loại
protein khác nhau. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền sự khác nhau của các protein
phản ánh sự khác nhau về đặc điểm di truyền giữa các cá thể. Chính vì vậy isozyme

được dùng làm marker trong phân tích mức độ đa dạng về di truyền của loài.
Phân tích isozyme nhìn chung là phương pháp khả thi, đồng tính trội và tương
đối rẻ tiền. Khoảng 90 isozyme đã được sử sụng trên thực vật, với những vị trí (loci)
isozyme đang được lập bản đồ trong nhiều lĩnh vực (Tanksley và ctv, 1991). Tuy

11
nhiên số lượng marker isozyme ít do đó không đủ để nghiên cứu toàn vẹn sự đa dạng
di truyền, phân tích dựa trên kiểu hình nên dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường.
Ứng dụng của marker isozyme đã được sử dụng thành công để nhận diện giống
ở một số loài cây ăn trái như bơ ( Goldring và ctv, 1985), táo (Weeden và Lamb,
1985), xoài (Chemda Degani và Ruth EI-Batsri, 1990 - 1992). Đối với dứa, marker
isozyme cũng đã được sử dụng để phân nhóm 161 dòng dứa dựa vào 6 enzyme
(Aradhya M.K. và ctv, 1994).

2.3.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị (marker) phân tử
Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc
phân tử di truyền lại cho đời sau, giống như các nhân tố di truyền Meldel, nhưng lại có
thể định lượng được. Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt được hai cá thể,
hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem như là một marker DNA. Marker
DNA có nhiều ưu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện
tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trường.
Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể
trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài (thứ), phát
hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Ahn et al., 1993; Dunforal et al.,
1995). Chúng có thể được dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair et al., 1995; Zhang et al.,
1995).
Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2004):
- Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain
Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS

- Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization-
based): RFLP, minisatellite.







12
Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)
Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ
RAPD Random amplified polymorphic DNA
AP-PCR Arbitrary primer-PCR
DAF DNA amplification fingerprinting
AFLP Amplified fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
SSCP Single strand conformation polymorphism
RFLP Restriction fragment length polymorphism
STS Sequence-tagged sites
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lược được thế giới ủng hộ từ năm
1995, là phương pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết
quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu. Sau khi
đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác
của phương pháp (Bùi Chí Bửu, 2002).

2.3.3.1. Chỉ thị RFLP (RFLP marker)
Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều
dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh

năm 1980. Nguyên lý này dựa vào các đặc tính sau:
- Tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa
là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất định của DNA
(loại enzyme 6 cắt và 4 cắt). Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những
trình tự nucleotide đặc trưng và tạo thành những đoạn có kích thước khác nhau.
- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý
nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương
đồng với nó trên DNA genome.

13
Cụ thể nguyên lý của phương pháp này: DNA của genome sẽ được xử lý bởi
cùng enzyme giới hạn tạo ra những đoạn có kích thước khác nhau biểu hiện nhờ điện
di trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành những sợi đơn và được chuyển lên
màng lai cellulose hoặc nylon. Quá trình lai diễn ra giữa DNA mục tiêu với các đoạn
DNA thăm dò trên màng lai (probe) có gắn đồng vị phóng xạ. Kết quả của quá trình
này được phát hiện nhờ những chất phát quang (fluorescens). Khi phân tích đa dạng di
truyền, sự đa dạng của cá thể sẽ thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng.
Chỉ thị RFLP đã được ứng dụng nhiều trong chọn giống và đa dạng di truyền ở
thực vật. Chẳng hạn, Takashige Ishii và cs (1995) đã phân tích sự đa dạng di truyền
của 112 giống lúa ở Châu Á qua sử dụng 12 probe DNA có kích thước từ 0,8 - 3,4 kb
liên kết với các vùng của các nhiễm sắc thể từ số 1 - 12. Tương tự, Qifa Zang và cộng
sự (1992) đã xác định được sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng)
và japonica (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP. Ở Việt Nam, RFLP được sử dụng
trong nghiên cứu đa dạng quần thể nấm đạo ôn miền bắc và miền trung Việt Nam ( Lã
Tuấn Nghĩa và ctv, 1997) và còn được dùng trong phân tích đa hình DNA các giống
lúa kháng, nhiễm bệnh đạo ôn (Nguyễn Trịnh Toàn và cs, 1997). Tuy có nhiều ứng
dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phương pháp này đòi hỏi số lượng và
chất lượng DNA phải cao, tốn nhiều công sức, thời gian và đắt tiền (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2004).

2.3.3.2. Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR
Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain
reaction). Đây là một kỹ thuật ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng
dụng chỉ thị phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn. Phương pháp PCR tạo nên
ALP ( amplicon length polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể,
các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di. Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả
nhanh, không đòi hỏi sử dụng đồng vị phóng xạ, giá thành thấp, số lượng DNA ít. Tuy
nhiên, khuyết điểm của phương pháp này đòi hỏi phải tổng hợp primer và Taq
polymerase.
Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại
một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primer) tương hợp với hai đầu 3‟ ở

14
cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence). Để primer được gắn vào DNA mục
tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau
đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo
nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA
polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra. Đó là một chu kỳ của PCR. Do các sản phẩm
mới được tổng hợp lại được dùng làm khuôn cho primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số
bản sao của DNA lại được tăng gấp đôi so với chu kỳ trước đó. Chu kỳ gồm ba bước
như trên được lập lại nhiều lần và tạo ra hàng triệu DNA trong vài giờ (Khuất Hữu
Thành, 2003).
Quy trình chuẩn của PCR được tiến hành như sau:
- Bước 1:Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 94
0
C - 96
0
C trong vòng 30
giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu)
- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 -

72
0
C thường là 55
0
C và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt độ tăng lên đến
72
0
C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt (Chien và ctv,
1976) và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại.
Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lập lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tuỳ vào ứng
dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72
0
C trong 5
phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở
4
0
C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang,
2004).
Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau:
Tổng số khuếch đại = m x 2
n

Trong đó n là số chu kỳ, m là số copy của chuổi mã hoá cần nghiên cứu. Giả sử
chúng ta đạt hiệu quả là 100 %, sau 30 chu kỳ chúng ta sẽ có tổng số sản phẩm khuếch
đại là 1,07*10
9
.
Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR:
- DNA polymerase: được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Themus

aquticus, có tính ổn định nhiệt rất cao. Trong hầu hết các protocol, người ta khuyến
cáo nồng độ Taq sử dụng là 0,5 U / 25 µl. Nếu nồng độ Taq quá cao (> 1,25 U / 25 µl,

15
những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ
Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR
mong muốn (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004).
- Primer và dNTP
Dung dịch dNTP làm stock phải được trung tính ở pH=7.0 và tồn trữ ở -20
0
C.
Stock được dùng nên có nồng độ dNTP là 1mM. Sự ổn định của dNTP trong suốt các
chu kỳ lập lại ước còn khoảng 50 % sau 50 chu kỳ (Innis và ctv, 1990). Hàm lượng
dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính. Bốn
dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện
tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó.
Sự khuếch đại chuyên biệt đối với DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc các
primer tương xứng. Do vậy, chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng
quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nếu có 50 % G+C,
thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 - 20 nucleotide và có tính
đặc hiệu hơn, còn đối với primer chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ
làm mất tính đặc hiệu.
- DNA mục tiêu
Người ta cần phải có những đoạn DNA mang mật mã biết trước, được gọi với
thuật ngữ “ target DNA” (DNA mục tiêu) trong kỹ thuật PCR. Kết quả thu nhận sẽ tốt
nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá. Số lượng DNA cần cho một
phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì
lượng này là 5 – 25 ng DNA.

 Chỉ thị RAPD (RAPD marker)

Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin
về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer tương
ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng
mới sẽ gặp nhiều khó khăn.
Vào đầu thập kỹ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên
gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai
phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990 và Welsh et al., 1991). Kỹ thuật này cho
phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng

16
một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9-12
oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có ngàn hàng loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số
lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer
đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các
điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000
nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này được quan
sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương
đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các
primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng
trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phương pháp có hiệu quả để
xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa
hình RAPD là 0.3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana, là 0.5 / 1primer ở cây đậu
tương, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000).
Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide
của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa
hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số
lượng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện
đa hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân
thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân
loại.

Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các
bước như sau:
- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.
- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc,
UPGMA cluster.)., lập dendrogam. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách
biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di
truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng
cho những mục đích sau:

17
- Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như
tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni et al.,
1996; Winter et al., 1995).
- Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
- In dấu vân tay (DNA fingerprinting).
- Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation).
Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD
cũng có một số hạn chế như sau:
- Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị
hợp tử
- Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất
- Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.
- Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.

Hình 2.1: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu
sự đa dạng di truyền.

 Marker AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) – đa dạng chiều dài các
đoạn DNA được nhân bản chọn lọc, là phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR. Ở đây
sản phẩm PCR là kết quả của quá trình nhân bội các đoạn DNA sau khi đã được cắt
bằng enzyme giới hạn (Zabow M. Và Vos P.,1993). Nguyên lý của kỹ thuật này như
sau: trước khi làm phản ứng PCR người ta gắn các đoạn DNA ngắn (adaptor) vào hai

18
đầu của mảnh DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn sau đó thiết kế các primer theo
các đoạn DNA ngắn có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng
PCR. Khi thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối
ta có thể nhận được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau. Sản phẩm được phân
tích trên gel polyacrymide, kết quả thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu
thí nghiệm.
Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ
dàng lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào (Zabeau, 1993)
do đó được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di
truyền ở cây trồng như lúa, lạc..(Redona et al., 1998; He et al., 1997). Tuy nhiên,
AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành đắt nên phần nào hạn chế sử dụng.

 Marker SSR ( Microsatellite marker)
Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại
nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen
thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất nhạy
cảm (Ramakrishna và ctv, 1995). Được gọi với thuật ngữ chuỗi mã đơn giản lập lại
nhiều lần (Simple sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp. Do đó SSR có
thể khuếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer
theo miền của 2 bên trên một locus. Kết quả dựa vào độ dài và số lượng của các đoạn
lập lại DNA khác nhau giữa các động vật, thực vật và vi sinh vật để xác định được
mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so sánh.
Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa hình rất

cao và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhược điểm của chỉ
thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài.
Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu
di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Parasnis (1998) phát
hiện đoạn lập lại GATA kích thước 5 kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ
cái bằng marker SSR. Ngoài ra, microsattelitte marker cũng được dùng để phân tích
tính đa dạng nguồn gen cây có múi (Trần thị Oanh Yến và ctv, 2003).



19
2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di
truyền trên Thế Giới và Việt Nam
2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới
Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng
tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với
nhu cầu thị trường. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã được
thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại chỉ thị phân tử nhằm cung cấp
những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những thành công được thể
hiện qua những nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv,
1992). Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và
3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius).
Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A. ananassoidies với mức
tương quan của A. comonus (0.398) và A.ananassoidies (0.381). Qua đó cho thấy sự
khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến.
- Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001)
đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là
58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai.
- Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống

(dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của
chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác biệt
với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi
trường, tỉ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma.
- Xác định độ tin cậy kiểu gen của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker
isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003).
- Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng
marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001).
- Ngoài ra, các nghiên cứu về sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền trên
nhiều đối tượng khác như cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, dâu tây, khoai tây, cà chua
cũng đã có nhiều báo cáo thành công.



20
2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến
hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen.., sử dụng kỹ thuật RAPD,
AFLP, SSR… Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều nhưng đã cho thấy
chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm
đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng. Dưới đây là một số nghiên cứu
đã ứng dụng thành công trên nhiều loại cây trồng như:
- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD
(Hoàng Thị Bích Thuỷ và Ctv, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm được 7
giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các quần thể Trung Quốc
220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa
Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn
gốc.
- Khảo sát tính đa hình trên cây cà chua bằng chỉ thị RAPD (Thái kỳ Tài và ctv,
2004).

- Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng
chỉ thị RAPD (Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003).
- Phân tích sự đa dạng di truyền của giống đậu nành bằng marker phân tử (Phạm
Thị Bé Tư, Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2003). Kết quả 50 giống đậu nành đã
được phân thành 5 nhóm chính thông qua 17 primer và phân tích dựa trên UPGMA .
- Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa
(Bùi chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Đức thành và ctv, 1999).
- Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác
chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (Đỗ Đức Tuyến, 2000).
- Nghiên cứu tính đa dạng di truyền trên 17 giống dưa leo dựa vào kỹ thuật RAPD
(Phan Lê Diệu Phương, 2003).







21
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005
tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở
Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ.

3.2. Vật liệu
3.2.1. Nguồn gốc mẫu
Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc sử dụng trong đề tài
STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan

cung cấp
STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan
cung cấp
1
OMK5 Nhật Long Định 26 OMK47 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
2 OMK12 Úc Long Định 27 OMK52 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
3 OMK19 Khóm Tây Ninh VLĐBSCL 28 OMK49 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
4 OMK10 Úc Long Định 29 OMK50 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
5 OMK17 Codevoire (Pháp) Long Định 30 OMK51 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
6 OMK2 Đài Loan-BL Long Định 31 OMK61 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
7 OMK7 MontiqueI (Pháp) Long Định 32 OMK66 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
8 OMK15 Thơm Phụng Long Định 33 OMK67 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
9 OMK29 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 34 OMK64 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
10 OMK18 Khóm Hà Nội VLĐBSCL 35 OMK65 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
11 OMK20 Thơm Tây Ninh VLĐBSCL 36 OMK71 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
12 OMK4 Thơm Thái Lan Long Định 37 OMK72 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
13 OMK11 Đài Loan Long Định 38 OMK73 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
14 OMK1 Đài Loan Long Định 39 OMK74 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
15 OMK8 Thơm Lâm Đồng Long Định 40 OMK75 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
16 OMK9 Thái Lan-MC Long Định 41 OMK56 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
17 OMK3 Thơm Trung An Long Định 42 OMK76 Thơm Cần Thơ VLĐBSCL
18 OMK59 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 43 OMK77 Phụng Hiệp VLĐBSCL
19 OMK16 Thơm Kiên Giang Long Định 44 OMK40 Thơm Bến Tre VLĐBSCL
20 OMK44 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 45 OMK13 Trung Quốc Long Định
21 OMK48 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 46 OMK62 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
22 OMK42 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 47 OMK63 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
23 OMK43 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 48 OMK68 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
24 OMK45 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 49 OMK69 Thơm Hà Nội VLĐBSCL
25 OMK6 Thom Bến Lức Long Định 50 OMK70 Thơm Hà Nội VLĐBSCL

22
Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne
trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng. Những dòng dứa
này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông
Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ. Danh sách được trình bày ở bảng 3.1.
Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử
lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở
dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm.

3.2.2. Dụng cụ và hóa chất
- Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng
- Tủ lạnh 4
0
C và - 20
0
C
- Tủ sấy 37
0
C
- Cân, máy đo pH

3.2.2.1. Dụng cụ và hóa chất ly trích DNA
- Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl
- Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus)
- Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức)
- Isopropanol (Đức)
- Ethanol 100 % và 70 % (Đức)
- Dung dịch đệm ly trích DNA
Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA
Thành phần Nồng độ stock Nồng độ cuối Thể tích

Tris (pH8.0) 1 M 100 mM 5 ml
EDTA 0,5 M 20 mM 2 ml
NaCl 5 M 500 mM 5 ml
Nuớc cất 38 ml
Tổng cộng 50 ml
Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA
EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) (Mỹ): tạo phức Mg
++
, gây bất hoạt
enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết

23
SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % (Đức): phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào,
màng nhân để phóng thích DNA
- Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa
polysaccharide và tạp chất khác.
10 g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) (Mỹ)
100 ml NaCl 0,5 M
- Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8.0 (Mỹ)
Bảng 3.3: Thành phần dung dịch đệm TE
Thành phần Nồng độ stock Nồng độ Thể tích
Tris (pH 8.0) 1 M 10 mM 0,5ml
EDTA 0,5 M 0,5 mM O,1ml
Nước cất 49,4ml
Tổng cộng 50,0ml

3.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose
- Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies)
- Máy chụp hình gel bằng tia UV
- Agarose (Mỹ)

- Dung dịch TAE 50X
Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X
Thành phần Thể tích 1 lít
Tris base 2M 242 g
Glacial acetic acid 57,1 ml
EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml

- Ethidium bromide
- DNA ladder làm thang chuẩn
- DNA loading buffer




24
Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer
Thành phần Thể tích
Tris 1 M (pH=8.0) 0,5 M
Glycerol 5,0 ml
EDTA 0,5 M (pH=8.0)
100 l
Xylen Cyanol 0,2 % 15 mg
Bromophenol blue 0,2 % 15 mg
Nước cất 4,5 ml
Tổng cộng 50 ml

3.2.2.3. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR
- Máy thermal cycler (Biorad)
- Mẫu DNA ly trích
- Dung dịch stock của dNTPs (5 mM).

- Dung dịch stock của PCR buffer (10X).
Bảng 3.6: Thành phần dung dịch đệm PCR 10X
Thành phần Nồng độ Nồng độ cuối Thể tích
Tris (pH 8.3) 1 M 200 mM 1,0 ml
KCl 1 M 500 mM 2,5 ml
MgCl
2
150 mM 15 mM 0,5 ml
Gelatin 0,01 % 0,5 ml
Nước cất 1,0 ml
Tổng cộng 5,0 ml

- Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có
kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung
dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL.
- Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long .




25
3.3. Phƣơng Pháp
3.3.1. Đánh giá kiểu hình
Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện tự nhiên, không xử
lý ra hoa và tiến hành đo các đặc tính nông học trong cùng thời gian ở giai đoạn các
cây trưởng thành và bắt đầu cho hoa. Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên hai lần lập
lại, cách đo được tiến hành như sau:
- Chiều cao cây (cm) đo từ mặt đất đến đỉnh của lá.
- Chiều rộng cây (cm) đo khoảng cách lá vươn rộng ra hai bên.
- Chiều dài lá (cm) đo ngẫu nhiên 3 lá trên / 1 cây, chiều rộng lá đo phần rộng của

lá.
- Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây.
- Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái.
- Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch.
- Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở
một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức
độ màu khác nhau.
Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó
phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version
2.1. Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng
hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính
sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được
tính toán theo Sneath và Sokal (1973). Dựa trên ma trận tương quan (Correlation
matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp
UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những
mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non-
overlapping) (Sneath và Sokal, 1973).

3.3.2. Đánh giá kiểu gen
3.3.2.1. Tách chiết DNA
DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium
bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly
trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất