Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và hoạt tính sinh học của cao chiết từ loài adinandra bockiana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

THÂN THỊ KIM PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, tháng 12/2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

THÂN THỊ KIM PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana

Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, tháng 12/2020

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa được ai công bố.
Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020
Tác giả luận văn

Thân Thị Kim Phượng
XÁC NHẬN

XÁC NHẬN

CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

PGS.TS. Nguyễn Hữu Quân

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong
q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Văn Khang, giảng viên Khoa
Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên
Phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, cơ Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật

viên Phịng thí nghiệm Thực vật học thuộc Khoa Sinh học Trường Đại học Sư
phạm
- Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt quá trình nghiên
cứu.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Khoa Sinh học và các thầy
cô giáo thuộc bộ phận sau đại học, Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong q trình học tập và
hồn thành luận văn.
Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và
giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hồn thành luận văn.
Em xin cảm ơn sự hơ trợ kinh phí từ đề tài Quỹ Nafosted “Phân tích thành
phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư và
kháng viêm từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở Việt
Nam”, mã số
106.02-2018.338.
Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020
Tác giả luận văn

Thân Thị Kim Phượng

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... ii
MỤC LỤC .............................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................vi

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................1
3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra)....................3
1.1.1. Chi Dương đồng (Adinandra).........................................................................3
1.1.2. Loài Adinandra bockiana ...............................................................................5
1.2. Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi Adinandra...6
1.2.1. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học ...................................................................6
1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học.................................................................9
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................12
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu......................................................12
2.1.1. Vật liệu và mơi trường ni cấy ...................................................................12
2.1.2. Hóa chất, thiết bị...........................................................................................12
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................14
2.2.1. Phương pháp phân loại hình thái ..................................................................14
2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật ...................................................................14
2.2.3. Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính .....................................................15
2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ................................16
2.2.5. Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa DPPH...............................16
2.2.6. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư ni cấy dạng đơn lớp .......16
2.2.7. Phương pháp định tính cao chiết ..................................................................17
iii


2.2.8. Phân lập các hợp chất ...................................................................................19
2.2.9. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả ......................................................20
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................21

3.1. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của lồi Adinandra bockiana ..........................21
3.1.1. Đặc điểm hình thái của loài Adinandra bockiana ........................................21
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của loài Adinandra bockiana .......................................22
3.2. Hoạt tính sinh học của cao chiết từ lồi Adinandra bockiana.........................25
3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ lồi A. bockiana ............................25
3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết lồi A.bockiana...............................28
3.2.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư của cao chiết ethanol từ loài A. bockiana ..30
3.3. Khảo sát các hợp chất có trong dịch chiết của cây A. bockiana......................31
3.3.1. Định tính polyphenol ....................................................................................31
3.3.2. Định tính tanin ..............................................................................................31
3.3.3. Định tính các flavonoid ................................................................................32
3.3.4. Định tính các coumarin.................................................................................32
3.3.5. Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A. bockiana.....33
3.4. Kết quả tách chiết một số hợp chất có trong dịch chiết cây A. bockiana........34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................35
KẾT LUẬN.............................................................................................................35
KIẾN NGHỊ............................................................................................................35
CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ..............................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................37


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
C T N
h t a
ữ A t
D D
M
D i2,
P
E 2E N

C ff ồ
E E T
L
n h
IS
Et zE ử
O th
H H U
e
n
e
p
g
H pH P
P ig h
L h
I I ư
N
C n ồ
IS I Đ
S nt á
R er n
L L M
B ur
ô
ia
M A iU
C rd n
M M
eM et

MN
I
i ồ
C
n
M nM P
S/ as h
N N C
M u ộ
O
M
D
ật
T T C
T ri hỉ
T T S
L hi ắc
iv


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra phân bố tại Việt Nam ..............3
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm..................................................12
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm..........................................................13
Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ lồi A. bockiana......................25
Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết ..................................................29
Bảng 3.3. Tác động gây độc tế bào ung thư của cao chiết .....................................30

5

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Một số lồi thuộc chi Adinandra. .............................................................4
Hình 1.2. Mẫu cây A. bockiana phát hiện tại Trung Quốc [28] ...............................6
Hình 1.3. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida......................9
Hình 1.4. Các hợp chất saponin thuộc lồi A.nitida ...............................................10
Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng trong các thí nghiệm .........................................13
Hình 2.2. Quy trình điều chế mẫu cao chiết lồi A.bockiana.................................15
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các chất ..........................................................................20
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của lồi A. bockiana thu tại xã Liêm Phú, huyện Văn
Bàn, tỉnh Lào Cai ....................................................................................................21
Hình 3.2. Giải phẫu cắt ngang thân cây A. bockiana .............................................23
Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang lá cây A.bockiana ..................................................25
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với vi khuẩn B. subtilis .........26
Hình 3.5. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L. Plantarum...............26
Hình 3.6. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli...........................27
Hình 3.7. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. marcescens .............27
Hình 3.8. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. lutea ........................28
Hình 3.9. Màu sắc của mẫu khử gốc tự do DPPH trước khi đo của cao ethanol ...30
Hình 3.10. Phản ứng với muối sắt (III) (A) và với dung dịch H2SO4 đặc (B)......31
Hình 3.11. Định tính tanin bằng phản ứng với thuốc thử vanilin/H2SO4 (A) và
định tính flavonoid (B).
..................................................................................................32
Hình 3.12. Định tính coumarin phản ứng với NaOH (A) và HCl đặc (B) .............32
Hình 3.13. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (T), cao chiết ethyl acetate (E) và cao chiết
dichloromethane (D) ...............................................................................................33
Hình 3.14. Sắc ký lớp mỏng một số đoạn của cao chiết.........................................34
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng so sánh cao tổng số và chất A1.................................34

6


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật
phong phú với nguồn dược liệu dồi dào và có truyền thống sử dụng nguồn dược
liệu từ tự nhiên lâu đời. Hệ thực vật được coi là một nguồn nguyên liệu vô cùng
quý cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về
hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp
chất có nguồn gốc từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển về lĩnh
vực y dược phục vụ cho cuộc sống của con người.
Xu hướng sử dụng các hợp chất thiên nhiên có sẵn trong cây để điều chế
dược phẩm, thực phẩm hiện đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Trong
số các hợp chất thu được, có những hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung
thư, một số khác lại thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật. Tác dụng chữa bệnh, tăng
cường và bảo vệ sức khỏe con người ở nhiều loài thực vật chủ yếu là do các hợp
chất tự nhiên mà chúng đã sinh tổng hợp, tích luỹ trong q trình sinh trưởng và
phát triển.
Trên thế giới đã có một số cơng trình cơng bố về thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra), họ Chè
(Theaceae). Kết quả của những nghiên cứu đã chỉ ra nhiều hợp chất phân lập từ
loài Adinandra nitida đã thể hiện hoạt tính kháng rộng như kháng viêm, chống oxi
hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn
gây bệnh. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về chi Adinandra đã bước đầu tập trung
ở việc thống kê danh sách thành phần lồi, ngoại trừ lồi Adinandra lienii đã được
cơng bố về đặc điểm giải phẫu, hoạt tính sinh học của cao chiết và trình tự đoạn
gen matK. Trong khi lồi Adinandra bockiana chưa có cơng bố nào về đặc điểm
thực vật học, hoạt tính sinh học cũng như thành phần hóa học. Do đó, nghiên cứu

về các đặc tính sinh học cũng như tìm ra được cấu trúc hóa học, thành phần các
hợp chất mới và hoạt tính sinh học của các hợp chất mới của loài này là rất cần
thiết. Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu đặc điểm thực vật học và hoạt tính sinh học của cao chiết từ loài
Adinandra bockiana”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
1


- Phân tích được đặc điểm thực vật học của loài A.bockiana thu thập được.

2


- Phân lập, tinh sạch và xác định được hoạt tính sinh học của một số hợp chất
tách chiết từ loài A.bockiana làm cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu của loài A. bockiana.
- Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính
kháng khuẩn, chống oxi hóa và hoạt tính chống tế bào ung thư của cao chiết từ loài
A. bockiana.
- Tinh sạch một số chất thu được từ cao chiết của loài A. bockiana.

3


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về thực vật thuộc chi Dương đồng
(Adinandra)
1.1.1. Chi Dương đồng (Adinandra)

Chi Dương đồng (Adinandra) thuộc họ chè (Theaceae), bộ Theales, lớp
Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [27]. Trên thế giới có
khoảng
85 lồi thuộc chi Adinandra phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản,
Ấn Độ, Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [26]. Ở Trung Quốc, chi
Adinandra có khoảng 22 lồi, trong đó có 17 lồi là đặc hữu. Ở Việt Nam, đã
thống kê được chi Adinandra có khoảng 13 lồi, phân bố rải rác ở các tỉnh Lào
Cai, Cao Bằng, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia
Lai như loài Adinandra glischroloma, Adinandra millettii, Adinandra petelotii,
Adinandra lienii, Adinandra bockiana, Adinandra annamesis, Adinandra
megaphylla, Adinandra hongiaoensis,... [2], [20].
T
T1
2
3
4
5

6

Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra phân bố tại Việt Nam
T Tê
P C
n Quản
h ô
A nSum
di Sum
đỏ
g trị
A

Bạch
di
A đuôi
Sum Mã
Đồng
di
A. đồng
Sum Nai
Sapa
gl
lông
A Súm Quản D
di đỏ
gQuản ù
n
gKon n
a
g
Tum,
Lai
n
c
A Sum Lâm Tr
di nguy Đồng ị
nA ên
Sum Hòn b

7
8 di
A trái

Sum
di mille
9 nA tt
Sum
1
01
11
2

di
A
di
A
di
A
di

Bà
S TĐ
ap
iề
Đ a dạ
ảo
Sa Pa dà

petel Lâm
Sum
poila
Sum Đồng
Lào

lá
lớn Cai
Sum
Lào
Liên
S HCai
u
ò
4


1 A G
3 di ia

Lâm
Đồng

5


Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm. Các
hợp chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng để chữa bệnh như
giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau. Đặc biệt, flavonoid tìm thấy
trong lá của lồi A. nitida có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống
viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây
bệnh. Ngoài ra, trong các cây thuộc họ chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có
vai trị quan trọng trong lĩnh vực y học. Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y
học cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị
bệnh ung thư vịm họng, đau dạ dày, rắn cắn,...[22]. Cụ thể cơng dụng của một số
lồi tìm thấy ở Việt Nam được mơ tả trong bảng 1.1.

A

B

C

D

Hình 1.1. Một số lồi thuộc chi Adinandra.
A. A. hongiaoensis, B. A. integerrima, C. A. millettii, D. A. glischroloma
( Hình ảnh từ Internet)

6


Những lồi thuộc chi Adinandra thường là cây thân gơ ít khi là cây bụi,
nhánh non có lơng nhung. Lá đơn, mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn.
Hoa mọc đơn độc ở nách lá, lưỡng tính, hoa mẫu 5. Lá đài có lơng mềm hay lơng
ráp. Cánh hoa khơng lơng hay chỉ có lơng ở mặt ngồi. Nhị nhiều, số lượng lên tới
25 nhị trong 1 hoa. Bao phấn có lơng ngắn hay dài và có mũi nhọn. Bầu trên,
khơng lơng hoặc có lơng mềm; nỗn nhiều. Quả khơ khơng tự mở; hạt nhiều và
nhỏ [27]. Hình thái ngoài của một số loài thuộc chi Adinandra được thể hiện ở
hình 1.1.
1.1.2. Lồi Adinandra bockiana
Lồi A. bockiana là lồi thực vật có hoa thuộc chi Dương đồng (Adinandra).
Theo mơ tả của Pritzel (1900) lồi A. bockiana trồng tại Trung Quốc là cây bụi
hoặc cây gỗ, cao từ 2-9 m. Thân màu xanh thẫm, cành non màu nâu đen, nhẵn hoặc
phớt. Cuống lá có màu nâu vàng đậm, dài 5-7 mm. Phiến lá thn dài hình trứng
thn, màu xanh lục đậm, kích thước khoảng 9-13 × 3-4 cm, khơng có lơng. Hoa

mọc ở nách lá, đơn độc. Các lá đài rộng hình bầu dục hoặc hình trứng. Cánh hoa
màu trắng, hình trứng rộng, kích thước khoảng 6-7 × 4-5 mm, bên ngồi có màu
nâu vàng dọc theo phần giữa, đỉnh tròn và nhầy. Nhị hoa nhiều từ 25-30 nhị, dài 5
mm. Quả màu đen tím khi trưởng thành. Hạt nhiều, màu nâu đỏ, sáng bóng. Hàng
năm, cây ra hoa từ tháng 6 đến tháng 8 và quả chín vào tháng 9 đến tháng 11. Cây
thường mọc trên sườn núi hoặc trong thung lũng, nơi có độ cao từ 200-1500 m
(Hình 1.2). Tại Trung Quốc, lồi A.bockiana phân bố tại các tỉnh Phúc Kiến, Quảng
Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Nam và Tứ Xuyên [26]. Tại Việt Nam, loài A.
bockiana được tìm thấy ở tỉnh Lào Cai và Vĩnh Phúc.

7


Hình 1.2. Mẫu cây A. bockiana phát hiện tại Trung Quốc [28]
1.2. Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi

Adinandra
1.2.1. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Các nghiên cứu về lồi A. nitida đã được cơng bố có nhiều tác dụng sinh học
khác nhau như chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE) và
chống ung thư [13], [14], [17].
Liu và cộng sự (2008) đã tiến hành nghiên cứu khả năng chống oxy hóa, tác
dụng ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin của dịch chiết EtOH, hợp chất
camellianin A, camellianin B và apigenin từ loài A. nitida. Kết quả nghiên cứu
nhận thấy: (1) Dịch chiết EtOH, camellianin A, camellianin B và apigenin có khả
năng chống oxy hóa với giá trị IC50 tương ứng lần lượt là 14,74 μg/ml; 1,62
mg/ml; 1,8 mg/ml và 0,95 mg/ml; (2) khả năng chống oxy hóa theo phương pháp
thử DPPH và Rancimat của các hợp chất flavonoid thấp hơn nhiều lần so với dịch
chiết EtOH (khoảng 100 lần); (3) tác dụng chống oxy hóa của lồi A. nitida phụ
thuộc vào các chất có trong lá [16].

Cùng hướng nghiên cứu này, Liu và cộng sự (2010) nhận thấy, các hợp chất
flavonoid thuộc nhóm camellianin A, camellianin B và apigenin có tác dụng tốt
hơn dịch chiết EtOH. Ở nồng 500 μg/ml, tác dụng ức chế enzyme chuyển đổi
angiotensin của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và
apigenin lần lượt là
29,7; 30,16; 40,68 và 30,27%. Hoạt tính ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin
của dịch chiết EtOH phụ thuộc nhiều vào thành phần nhóm chất flavonoid [17].
8


Lá của loài A. nitida được sử dụng để làm chè uống có tác dụng chống ung
thư. Hợp chất camellianin A được chứng minh có hoạt tính chống ung thư trên
dòng tế bào ung thư Hep-G2 và dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Ở nồng độ
200μM, camellianin A ức chế tế bào ung thư MCF-7 và Hep-G2 với tỉ lệ ức chế
lần lượt là
33,8 và 8,7%. Như vậy, tác dụng gây độc tế bào của camellianin A là khá yếu. Tuy
nhiên, khi nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng mật độ tế bào ở giai
đoạn G0/G1. Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giai đoạn đầu
quá trình chết của tế bào đã được phát hiện. Như vậy, camellianin A không chỉ ảnh
hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà cịn thúc đẩy các tế bào đi vào
chu trình chết tế bào (apoptosis) [14].
Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2015) đã so sánh thành phần phenolic của
4 loài A. nitida, A. glischroloma var. jubata, A. millettii và A. latifolia ở Trung
Quốc về tác dụng chống oxy hóa và khả năng chống ung thư của 4 loài này trên
các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7. Nghiên cứu nhận thấy, hàm lượng các hợp
chất phenolic trong loài A. nitida cao nhất đạt 140,54 mg/g, tiếp đến loài A.
millettii (125,96 mg/g), lồi A. glischroloma var. jubata (84,14 mg/g). Lồi A.
latifolia có hàm lượng phenolic thấp nhất đạt 71,29 mg/g. Thành phần flavonoid
có trong lồi A. nitida là cao nhất đạt 88,72 mg/g; tiếp đến là loài A. glischroloma
var. jubata đạt

44,74 mg/g và loài A. millettii đạt 43,54 mg/g. Loài A. latifolia có hàm lượng
flavonoid thấp nhất đạt 19,13 mg/g. Như vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra
nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của lồi A. nitida và A.
millettii tốt hơn so với loài A. jubata và A. latifolia. Dịch chiết của các loài
Adinandra chứa các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá trình nhân lên
của tế bào ung thư. Các dịch chiết có thể ức chế với giá trị EC50 từ 1,05-6,44
mg/ml trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và giá trị EC50 từ 2,26-8,02 mg/ml
trên dòng tế bào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2).
Thành phần hợp chất flavonoid của loài A. nitida có chứa camellianin A,
camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài
A. milettii chưa được phát hiện [13].

9


Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của các hợp chất phenolic tự do
trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và MCF-7
L
à
A
.
A
.
A
.
A
.

E
HepM

1
0
1
0
1
0
6
0

2
0
2
0
8
0
4
0

Năm 2019, Yuan và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học và xác định các
hợp chất chống ung thư có trong trà Shiya (Adinandra nitida). Nghiên cứu đã phát
hiện ra 5 hợp chất có tác dụng ức chế quá trình tạo mỡ cũng như tác dụng chống
ung thư. Bốn hợp chất saponin triterpenoid (1-4), bao gồm một hợp chất mới (2α,
3α - dihydroxyursolic acid 28 - O – β - d - glucopyranosyl ester, 1) và flavonoid
(5) đã được xác định bằng cách sử dụng NMR (1D và 2D NMR) và sắc ký lỏng
(LC). Hợp chất (1), thành phần chính chống vi khuẩn có giá trị IC50 là 27,6 μg/ml,
đã được xác định lần đầu tiên trong trà Shiya. Để hiểu được mối quan hệ hoạt động
của cấu trúc, người ta đã thu được ba hợp chất thủy phân (1s, 2 và 5s) để cung cấp
hiệu ứng ức chế tích lũy lipid trong q trình biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1. Tác dụng
ức chế của triterpenoid (1s) khơng có nhóm đường giảm đáng kể, trong khi
flavonoid (5s) cũng khơng có nhóm đường cho thấy hoạt động tăng lên. Ngồi ra,

vị trí nhóm hydroxyl cũng có thể đóng một vai trị trong hiệu quả ức chế [24].
Ở Việt Nam, nghiên cứu đầu tiên về loài Adinandra rubropunctata do Lê
Nguyễn Thành và Vũ Thị Kim Oanh thực hiện. Nghiên cứu đã phát hiện ra lớp
chất triterpen vòng ursan (ursolic acid) và vịng lupan (betulinic acid) từ thân của
lồi A. rubropunctata, các hợp chất betulinic acid, ursolic acid thường có hoạt tính
chống ung thư tốt.
Như vậy, ở Việt Nam và trên thế giới chưa có cơng bố nào về hoạt tính sinh
học từ lồi A. bockiana.

10


1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra thành phần
hóa học của lồi A. nitida thuộc các nhóm chất là flavonoid, flavonoid glycoside
và triterpene saponin. Năm 2003, Wang và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất từ
loài A. nitida là apigenin (1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1
(4), nigaichigoside F2 (5), và peduncloside (6) (Hình 1.3) [22].
Bằng phương pháp sắc ký cột, Wang và cộng sự (2008) đã phân tích được
thành phần hóa học của loài A. nitida. Nghiên cứu đã phân lập và xác định được
cấu trúc của các hợp chất saponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, 19alphatrihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin,
sericoside; glucosyl tormentate; nigaichigoside F1 và arjunglucoside I. Trong đó
chất 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-Dglucopyranoside là hợp chất mới; các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát
hiện trong loài A. nitida [23].

Apigenin (1)

Camellianin A (2)

Quercitrin (3)

Kajiichigoside F1 (4)

Nigaichigoside F2 (5)

Peduncloside (6)

Hình 1.3. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida
11


Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại camellianin
A từ lá của loài A. nitida Merr. ex Li bằng phương pháp HPLC và chứng minh
được khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng phương pháp
DPPH và các gốc tự do. Cùng hướng nghiên cứu này, Liu và cộng sự (2013) đã
phân lập, tối ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và thu được camellianin A
từ lá của loài A. nitida; đồng thời chứng minh được khả năng chống oxy hóa của
flavonoid ở nồng độ 0,02 mg/ml. Như vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra flavonoid
như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin A và camellianin B có hoạt tính
sinh học và có khả năng chống oxy hóa [16].
Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2010), Zhang và cộng sự (2006) đã xác định
được thành phần flavonoid trong lá của loài A. nitida chiếm hàm lượng lớn > 20%
và camellianin A được xác định là thành phần chính [17], [25]. Theo Liu và cộng
sự (2010), hàm lượng camellianin A, camellianin B và phần aglycon apigenin
trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ lần lượt là 41,98; 2,67 và 1,73% [17]. Hàm
lượng flavonoid chiếm hơn 45% trong dịch chiết EtOH.

Arjunetin (7)

Sericoside (8)

Nigaichigoside F1 (9)

Glucosyl torenzymetate (10)

Arjunglucoside I (11)
Hình 1.4. Các hợp chất saponin thuộc lồi A.nitida
12


Một nghiên cứu khác từ Liu năm 2008 về phân tích thành phần hóa học bằng
phương pháp GCMS của dịch chiết siêu tới hạn CO2 từ lá của cây A. nitida và phát
hiện được 16 hợp chất với γ-sitosterol là thành phần chính (chiếm 47,56%). Một số
hợp chất khác như 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, nonacosane, 9, 12octadecadienal, vitamin E, γ-tocopherol, stigmasterol có hàm lượng từ
2,16-16,98%. Tuy nhiên dịch chiết MeOH thì tương tự như các nghiên cứu khác,
chủ yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14) và aglycon
apigenin (1) [16].

Camellianin A (2)

Rhoifolin (13)

Camellianin B (14)

Epicatechin (12)

Hình 1.5. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida
Bằng phương pháp sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân
tích thành phần hóa học đã chỉ ra hơn 57 chất trong dịch chiết MeOH từ lá của
loài A. nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin

(13), camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu,
khối lượng phân tử và phổ MS/MS (Hình 1.5) [25].
Như vậy, chưa có cơng bố nào nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học từ loài A. bockiana.

13


CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu và mơi trường ni cấy
Lồi Adinandra bockiana sử dụng trong nghiên cứu được thu tại xã Liêm
Phú, huyện Văn Bàn, tỉnh Lào Cai, Việt Nam.
Các loài vi khuẩn kiểm định: Bacillus subtilis, Serratia macescens,
Escherichia coli, Sarcina lutea, Lactobacillus plantanum do Khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cung cấp để nghiên cứu hoạt tính
kháng khuẩn từ cao chiết của lồi A. bockiana.
Các dịng tế bào ung thư gồm: ung thư vú (MDA-MB-231), ung thư dạ dày
(AGS) và ung thư phổi (A549) do GS. Pezzuto, Trường Đại học Long Island, Mỹ và
GS. Jeanette Maier, Trường Đại học Milan, Italia cung cấp để xác định hoạt tính gây

độc tế bào từ cao chiết của lồi A. bockiana.
Mơi trường LB được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn kiểm định có thành phần
gồm cao nấm men 0,5%; NaCl 1,0%; pepton 1,0%. Môi trường LB đặc bổ sung
2,0% thạch agar.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết và được cung cấp
bởi
các hãng khác nhau được liệt kê ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
H
D Đã
ip
Et ức
Tr
ha
Si uĐ
li
M
et
C

ức
Đ
ức
Si

ao
T
h
u

gTr
u
ng

14

2.1.2.2. Thiết bị
Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ chính xác cao
thuộc các phịng thí nghiệm thuộc Khoa Sinh học và Khoa Hóa học, Trường Đại
học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên (Bảng 2.2 và Hình 2.1).
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
H
C Tã
ân
M hụ
Đ
áy
C ức
V
ột
B iệt
Đ
ản
C ức
Tr
ột
M uN
áy
M hậ
A
áy
T nh
Đ
ủM an
M
áy

L ỹTr
a u
m ng

B

A

C
Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng trong các thí nghiệm

D

A. Máy chiết hồi lưu và hệ thống sinh hàn; B. Máy cất quay chân không; C. Cột
sắc ký sắt; D. Máy nuôi cấy lắc ổn nhiệt

15


2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Luận văn được thực hiện tại Trường Đại học Sư Phạm
- Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2019 đến tháng 9/2020.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân loại hình thái
Mẫu tiêu bản (cành mang lá và hoa) của loài A. bockiana được thu thập,
mang về phịng thí nghiệm để ép khơ xác định tên khoa học, nghiên cứu sự phân
bố và sinh thái.
Tên khoa học của loài A. bockiana được xác định bằng phương pháp hình
thái so sánh theo các tài liệu chuyên khảo: Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ

(1999) [2] và Thực vật chí Trung Quốc của Min & Bruce (2015)[26].
2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật
Cấu tạo giải phẫu loài A. bockiana được thực hiện theo hướng dẫn của Hoàng
Thị Sản và Nguyễn Phương Nga (2008) [9].
- Mẫu thân và lá sau khi thu về được cắt thành những lát mỏng bằng dao lam.
Các lát cắt được ngâm vào nước cất trong đĩa petri. Sau đó tiến hành nhuộm lát cắt
bằng phương pháp nhuộm kép với các bước như sau:
Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch javen trong thời gian từ 15-30 phút
để tẩy sạch nội chất của tế bào.
Bước 2: Rửa sạch lát cắt đã được ngâm trong javen bằng nước cất.
Bước 3: Tẩy sạch hết javen còn dính trên lát cắt bằng cách ngâm vào dung
dịch axit axetic.
Bước 4: Rửa sạch mẫu bằng nước cất (2 lần).
Bước 5: Nhuộm mẫu bằng dung dịch carmine trong khoảng 25-30 phút.
Bước 6: Rửa mẫu trong nước cất.
Bước 7: Mẫu được nhuộm trong dung dịch xanh methylen loãng khoảng 20
giây.
Bước 8: Rửa sạch mẫu bằng nước cất.
Bước 9: Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật và đậy la men. Quan sát
lát cắt trên kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 4-10 lần để thu kết quả.
16