Các cơ sở và ứng dụng của công nghệ hỗ trợ sinh sản động vật ở việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LƯƠNG THẾ VINH
KHOA XÂY DỰNG VÀ CÔNG NGHỆ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NAM ĐỊNH, THÁNG 10 NĂM 2021


TRƯỜNG ĐẠI HỌC LƯƠNG THẾ VINH
KHOA XÂY DỰNG VÀ CÔNG NGHỆ

TIỂU LUẬN THAY THẾ KHI KẾT THÚC HỌC PHẦN

CÁC CƠ SỞ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ
SINH SẢN ĐỘNG VẬT Ở VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện:
Khóa học: 2019 - 2022
Giảng viên hướng dẫn: THẠC SĨ HOÀNG XUÂN THẾ


MỤC LỤC
TRANG
Trang phụ bìa
MỤC LỤC................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC HÌNH...................................................................................... iii
Chương 1 MỞ ĐẦU................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề...........................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu............................................................................................1
Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN.................................................................................2
2.1. Lịch sử phát triển cơng nghệ sinh sản trên bị............................................................. 2

2.1.1. Thế hệ thứ nhất của công nghệ sinh sản................................................................... 2
2.1.2. Thế hệ thứ hai của công nghệ sinh sản..................................................................... 3
2.1.3. Thế hệ thứ ba của công nghệ sinh sản...................................................................... 4
2.1.4. Thế hệ thứ tư của công nghệ sinh sản...................................................................... 5
2.2. Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF: In vitro Fertilizaton).............................. 6
2.2.1. Các phương pháp thụ tinh in vitro.................................................................... 6
2.2.2. Sơ lược lịch sử phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)...............................9
2.2.3 Các phân đoạn thực hiện kỹ thuật IVF đối với phơi bị..........................................10
2.2.3.1. Kỹ thuật ni trứng trưởng thành (in vitro maturity)....................................... 10
2.2.3.2. Kỹ thuật thụ tinh trong vi giọt (in vitro fertilization)....................................... 13
2.2.3.3. Kỹ thuật ni phơi (ìn vitro culture)............................................................... 14
2.3. Kỹ thuật chuyển phôi động vật..........................................................................16
2.3.1 Cấy chuyển phôi............................................................................................. 16
2.3.2. Lịch sử phương pháp chuyển phơi......................................................................... 18
2.3.3. Quy trình của kỹ thuật chuyển phơi trên bị........................................................... 19
2.3.4. Hướng dẫn thực hiện cấy truyền phôi.................................................................... 19

i


2.4. Ứng dụng IVF và chuyển phôi động vật trong chăn nuôi và thú y ở Việt
Nam......................................................................................................................... 25
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................... 28
3.1. Kết luận..................................................................................................................... 28
3.2. Đề nghị...................................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 30

ii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Các thiết bị dùng trong kỹ thuật IVF...............................................................8
Hình 2.2 Các bước chính trong sản xuất phơi in vitro.................................................10
Hình 2.3 Thu mẫu buồng trứng bị.................................................................................11
Hình 2.4 Cách đưa súng cấy phôi vào trong sừng tử cung..........................................25


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sự ra đời và sử dụng những công nghệ sinh học hiện đại đã mở ra những
hướng nghiên cứu, can thiệp và điều khiển những hiện tượng sinh sản giúp cải thiện
năng suất cho nhiều loài gia súc. Phần lớn các kỹ thuật sinh sản có liên quan đến di
truyền, đã phát triển vững chắc trong nửa thế kỷ qua, đều thuộc trong ba thế hệ đầu
tiên của công nghệ sinh sản, bao gồm gieo tinh nhân tạo, đông lạnh giao tử và phôi,
chuyển phôi và thụ tinh trong ong nghiệm. Thế hệ công nghệ sinh sản thứ ba và thứ
tư gồm tinh và phôi (xác định) giới tính, nhân bản, sinh học tế bào gốc, và chấn
đốn phân tử có tiềm năng đế nâng cao tầm ảnh hưởng của những gia súc ưu tú
trong chăn nuôi.
Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) và kỹ thuật cấy phôi đã phát huy tác
dụng tốt ở nước ta, hứa hẹn trong một tương lai không xa, sản lượng thịt và sữa của
Việt Nam sẽ tăng trưởng một cách bền vững.
Trước tình hình đó, được sự đồng ý của Khoa Xây dựng - Công nghệ, Trường
Đại Học Lương Thế Vinh, chúng tôi thực hiện tiểu luận “Các cơ sở và ứng dụng của
công nghệ hỗ trợ sinh sản động vật ở Việt Nam”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
Mục đích
Tìm hiểu về nội dung các cơ sở và ứng dụng của công nghệ hỗ trợ sinh sản
động vật ở Việt Nam nhằm nâng cao sự hiểu biết về ứng dụng công nghệ sinh học

trong chăn nuôi thú y.
Yêu cầu
- Kỹ thuật IVF.
- Kỹ thuật chuyển phôi động vật.
- Ứng dụng IVF và chuyển phôi động vật trong chăn nuôi và thú y ở Việt Nam.
1


Chương 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
Nội dung chính của tiểu luận tập trung giải quyết vấn đề trọng tâm: “Các cơ sở
và ứng dụng của công nghệ hỗ trợ sinh sản động vật ở Việt Nam”. Chúng ta sẽ cùng
tìm hiểu các vấn đề trong nội dung của tiểu luận.
2.1. Lịch sử phát triển cơng nghệ sinh sản trên bị
Sự tiến bộ của sinh học và công nghệ trong suốt sáu thập kỷ qua đã mang lại
sự phát triển cho bốn thế hệ công nghệ hỗ trợ sinh sản (Assisted Reproductive
Technology-ART). Ngày nay, không thể phân biệt giữa công nghệ sinh sản và cơng
nghệ di truyền trong một chương trình quản lý di truyền thành cơng. Do đó, ứng
dụng của cơng nghệ sinh học trong chăn nuôi thường nằm trong bốn lĩnh vực sau:
(a) chăn nuôi và quản lý, (b) sức khỏe gia súc, (c) dinh dưỡng và phát triển và (d)
sinh sản và di truyền.
Sự phát triển của bốn thế hệ cơng nghệ sinh sản có thể được khái qt như sau:
2.1.1. Thế hệ thứ nhất của công nghệ sinh sản
a. Gieo tinh nhân tạo (GTNT):
Là kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đầu tiên, đã được sử dụng hơn 200 năm. Là một
công nghệ hiện đại, GTNT với tinh dịch tươi hoặc đông lạnh đã là kỹ thuật thành
công nhất và công nghệ sinh sản hiệu quả trong chăn nuôi trong sáu thập kỷ qua. Sử
dụng GTNT có một tác động lớn đến các chương trình cải thiện di truyền ở các
nước phát triển, góp phần tăng 1,0 đến 1,5% tỷ lệ hàng năm của tiến bộ di truyền ở
bò sữa (Lohuis, 1995).

Với sự ra đời của sản phẩm prostaglandin F2α thương mại và sản phẩm tương
tự của nó trong thập niên 1970, hệ thống động dục đồng loạt được phát triển để trợ
giúp nhà sản xuất, nhằm kết hợp GTNT trong hoạt động kinh doanh bằng cách giảm
thời gian và lao động trong việc phát hiện động dục. Gần đây, nhờ hiếu rõ hơn về


động thái của các nội tiết tố ở con cái trong suốt chu kỳ động dục, hệ thống kinh tế
và hiệu quả hơn đã phát triển đế gây rụng trứng đồng loạt, cho phép người chăn
nuôi tiến hành GTNT cho đàn gia súc cùng một thời điểm cố định, không cần phát
hiện động dục.
b. Bảo quản đông lạnh giao tử và phơi:
Kỹ thuật này cũng đạt những quy trình thành công nhằm đông lạnh tinh trùng,
nhằm phục vụ công tác GTNT để nhân rộng tiềm năng di truyền của những đực
giống tốt (Gordon, 1994).
Tương tự như GTNT, đông lạnh phôi đã cho phép thương mại hóa tồn cầu
những gia súc có phẩm chất di truyền cao. Đơng lạnh phơi là một tiến trình rất
thành cơng trên bị trong ba thập kỷ qua, tuy nhiên phôi in vitro nhạy cảm hơn với
đông lạnh so với phôi in vivo (Enright và cs, 2000).
Kỹ thuật cọng rạ OPS (Open Pulled Straw) đã cải thiện hiệu quả thành công
không những của đông lạnh nhanh trứng và phơi in vitro mà cịn kết hợp với
phương pháp làm ấm trong cọng rạ và phương pháp hòa tan chất bảo quản đông
lạnh trong kỹ thuật cấy phôi trực tiếp (Vieira và cs, 2007).
2.1.2. Thế hệ thứ hai của cơng nghệ sinh sản
a. Kỹ thuật đa xuất nỗn và cấy truyền phôi (MOET):
Cấy truyền phôi bắt đầu cách đây khoảng 4 thập kỷ, là một công nghệ sinh sản
tiến bộ hơn hẳn so với GTNT. Kỹ thuật này đạt thành tựu trong 25 năm qua và đã
đánh dấu cơng nghệ chuyến phơi bị thương mại như là lĩnh vực kinh doanh quốc tế
lớn nhất (Mapletoft và Hasler, 2005; Lonergan, 2007). Những đóng góp có ỷ nghĩa
của kỹ thuật này vào sự gia tăng tính thương mại tồn cầu của phôi là sự phát triển
thành công bảo quản đông lạnh và quy trình rửa phơi để thu được những phôi sạch

bệnh, chất lượng cao (Mapletoft và Hasler, 2005).
Sự kết hợp giữa đa xuất nỗn, cấy truyền phơi trên con cái và GTNT từ con
đực đã cho phép việc nhân nhanh thế hệ sau từ những con bò ưu tú về di truyền.
Tuy nhiên, ET và GTNT chỉ thể hiện hữu ích khi đặt trong điều kiện tốt về chăn
ni, dinh dưỡng và quản lý. Một trong những yếu tố hạn chế của MOET là sự biến


động và khó dự đốn số nang nỗn phát triển sau khi xử lý bằng kích dục tố
(Mapletoft và Hasler, 2005).
b. Kỹ thuật siêu âm:
Là một trong những kỹ thuật hình ảnh quan trọng nhất được ứng dụng rộng rãi
trong sinh sản trên bị, từ mục đích nghiên cứu đến thương mại. Kỹ thuật siêu âm là
kỹ thuật không xâm lấn, cho phép nghiên cứu trên bò sống trong giai đoạn mang
thai mà không làm tổn thương bào thai. Bằng cách sử dụng siêu âm, hiện tượng
nang noãn phát triển trên bị đã được khám phả và mơ tả rõ ràng, điều này cho phép
chúng ta hiểu rõ và điều khiển chu kỳ động dục cũng như sinh sản gia súc.
Để tối ưu hóa sinh sản gia súc, siêu âm hình ảnh được sử dụng để mơ tả chính
xác tình trạng sinh sản của từng cá thể. Nhờ vậy, quyết định của người chăn nuôi
hay biện pháp xử lý sẽ chính xác và hiệu quả hơn nhằm rút ngắn khoảng cách hai
lứa đẻ và giúp bò sớm lên giống trở lại sau khi sinh.
2.1.3. Thế hệ thứ ba của công nghệ sinh sản
a. Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF):
Kỹ thuật IVF nhằm phát triển một hệ thống sản xuất phôi hồn chỉnh trong
phịng thí nghiệm. Những thành tựu đạt được của kỹ thuật này thực sự ấn tượng
trong thời gian gần đây. Sản xuất phôi in vitro (IVP) bao gồm ba bước chính: Ni
trứng thành thục (IVM), thụ tinh trong vi giọt (IVF) và nuôi phôi (IVC). Ngày nay,
sản xuất phơi bị in vitro đã được sử dụng phổ biến trong các mục đích nghiên cứu
khoa học, bảo tồn và thương mại. Kỹ thuật IVP đã gia tăng hiệu quả đáng kể trong
vài năm qua, cả vế số lượng lẫn chất lượng, đã được chứng minh tỷ lệ thụ thai tăng
lên sau khi chuyên phôi in vitro cho bỏ nhận. Rất nhiều lợi ích của kỹ thuật này đã

được xác định khi so sánh với hệ thống sản xuất phôi truyền thống, đặc biệt khi chú
ý đến giá thành sản xuất phôi như là yếu tố quan trọng nhất.
Do nhu cầu thương mại về phôi trên thế giới, kỹ thuật ET được phát triển
mạnh vào cuối những năm 1970 và đến những năm đầu thập kỷ 1990 đã vượt mức
150.000 phơi/năm. Tính đến 2008, số phơi in vitro được sản xuất ra là 330.953 phôi
so với so lượng phôi in vivo là 746.250 phôi, bằng khoảng 44,3%, đã chứng minh


sự phát triển mạnh mẽ của IVP. Châu Á, trong đó chủ yếu là Nhật, đã sản xuất gần
80.000 phơi in vitro, nhưng chủ yếu để phục vụ bảo quản đơng lạnh và mới chỉ có
15,6% (tương đương 12.655 phơi) được sử dụng cho cấy phôi (IETS, 09/2009).
b. Thu trứng:
Kỹ thuật thu trứng trên buồng trứng (Ovum Pick Up - OPU) bị sống là một kỹ
thuật khơng phẫu thuật, được thực hiện trên người vào cuối thập niên 1980, bằng
cách sử dụng một kim chuyên dụng với sự hướng dẫn của siêu âm để chọc hút trứng
từ trong nang noãn trong nhiều giai đoạn tuổi khác nhau (Van Wagtendonk-de
Leeuw, 2005). Thơng qua OPU, tiềm năng sử dụng của một bị cái cho phơi có thể
đạt năng suất 15-20 trứng/tuần.
c. Xác định giới tính của tinh trùng và phơi:
Phương pháp xác định giới tính của phơi và tinh trùng đã được phát triển để có
thể kiểm sốt giới tính của thế hệ sau. Vì tinh trùng mang nhiễm sắc thể X có nhiều
hơn 3,8% DNA so với tinh trùng mang NST Y, nên tinh trùng trong tinh dịch có thể
phân tách ra riêng dựa vào hàm lượng DNA của chúng thông qua thiết bị phân loại
tế bào (Flow cytometer).
Ngoài ra, một số kỹ thuật khác cũng được xếp trong thế hệ thứ ba của công
nghệ sinh sản như chuyển giao tử vào trong vòi fallop (Gamete Intrafallopian
Transfer - GIFT), chuyển hợp tử vào trong vòi fallop (Zygote Intrafallopian
Transfer - GIFT), tiêm tinh trùng vào trong tế bào chất của trứng (intracytoptasmỉc
sperm Injection-ICSI) nhưng các kỹ thuật này vẫn còn đang ứng dụng hạn chế trong
thực tiễn chăn nuôi.

2.1.4. Thế hệ thứ tư của công nghệ sinh sản
a. Nhân bản bằng chuyển nhân (Cloning by Nuclear Transfer):
Gia súc được nhân bản thành công đầu tiên là cừu vào năm 1986 sử dụng kỹ
thuật nhân bản từ chuyển nhân tế bào từ phôi sớm (Willadsen, 1986). Sau đó, cừu
Dolly được sinh ra vào năm 1996 bằng việc chuyển nhân của tế bào sinh dưỡng thu
từ cừu trưởng thành (Wilmut, 1997), đã chứng minh rằng có thể biệt hóa một tế bào


sinh dưỡng về giai đoạn toàn năng để phát triển thành một cá thế mới. Đến nay, kỹ
thuật này tiếp tục được thực hiện thành cơng trên nhiều lồi.
b. Sinh học tế bào gốc (Stem Cell Biology):
Bao gồm tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell - ESC) và tế bào mầm phôi
(Embryonic Germ Cell - EGC). Tế bào gốc phôi được mô tả bởi khả năng tự làm
mới của chủng cho q trình biệt hóa bất định in vitro trong một tình trạng đa năng
(pluripotency). Tế bào gốc đa năng có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào đặc
biệt khác nhau, từ việc thành lập các phần khác nhau trong phơi in vitro cho đến các
dịng tế bào sinh dục và sinh dưỡng (Choi, 1998).
c. Động vật chuyển gien (Transgienic animals):
Được định nghĩa là trường hợp một chất liệu di truyền từ một loài khác thêm
vào trong bộ gien của nó. Cơng nghệ di truyền cho phép chúng ta bỏ qua sự giới hạn
giữa các loài để cũng sản xuất những động vật thay đổi di truyền với các tính trạng
hữu ích và truyền được cho thế hệ sau theo kiểu của Mendel (Hansel và Godke, 1992).
Một ứng dụng khác của động vật biến đổi gien là nó sẽ cung cấp các cơ quan
nội tạng tương thích miễn dịch đế phục vụ cho việc ghép tạng trên người, trong đó
heo là lồi được chọn cho định hướng này (Auchincloss và Sachs, 1998).
2.2. Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF: In vitro Fertilizaton)
Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với trứng để
tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thế mẹ, tại phịng thí nghiệm (trong hộp
lồng, đĩa petri, ống nghiệm). Tuy xảy ra bên ngoài, nhưng các điều kiện cho q
trình thụ tinh trong ống nghiệm như mơi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố

dinh dưỡng... cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình thường giống
như trong cơ thể mẹ.
2.2.1. Các phương pháp thụ tinh in vitro
a. Thụ tinh trong ống nghiệm 5ml
Thích hợp hơn cả cho việc thụ tinh in vitro là ống ly tâm nhựa 5ml với nắp mở
được vặn lỏng, điều này giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Thông thường
tỷ lệ thụ tinh IVF tối ưu với một trứng/ống nghiệm trong 0,5ml môi trường và


50.000 tinh trùng di động. Khó khăn duy nhất của kỹ thuật này là muốn kiểm tra sự
thụ tinh cần phải chuyển mẫu sang một đĩa khác (một giếng hay bốn giếng).
b. Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng
Thêm một thể tích huyền phù tinh trùng đã đo trước vào mỗi giếng của đĩa
bốn giếng (hay đĩa một giếng) với nồng độ tinh trùng là 100.000 tinh trùng di động
tiến thẳng trên một giếng. Theo truyền thống, các trứng đã thụ tinh sẽ được ủ qua
đêm cùng với tinh trùng đã được hoạt hóa, tuy nhiên sự gắn tinh trùng vào màng
zona xảy ra từ một đến ba giờ khi bắt đầu ủ và do đó trứng có thể được rửa để loại
bỏ tinh trùng thừa sau ba giờ ủ.
Hạn chế của hệ thống này là không thể cho nhiều hơn 0,5 ml môi trường trong
mỗi giếng, trong khi đó nồng độ tinh trùng sử dụng cho một trứng ít nhất phải là
50.000 tinh trùng/trứng, nên khó thực hiện được đối với mẫu có số lượng tinh trùng
ít.
c. Thụ tinh trong mao quản và cọng rạ
Phương pháp này có ưu điểm tiết kiệm được trứng cũng như tinh trùng, đặc
biệt trong trường hợp vô sinh do yếu tố tinh trùng, bởi tinh trùng và trứng được ủ
trong thể tích nhỏ. Lần đầu tiên, Ranoux và Seibel đã sử dụng một cọng rạ có thể
tích nhỏ để đồng ủ tinh trùng và trứng, sau đó ủ cọng rạ trong âm đạo. Do vậy kỹ
thuật này cịn gọi là ni cấy trong âm đạo.
Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt được trong các ống mao quản (và cọng rạ sử dụng
trong đơng lạnh) với thể tích 5-10 µl có thể chứa 2.000 đến 4.000 tinh trùng di

động. Sau đó, Hammitt và cộng sự cũng đạt được tỷ lệ thụ tinh tốt với thể tích từ 10
– 150 µl. Nội dung của phương pháp này là huyền phù trứng và tinh trùng được hút
vào cọng rạ (hay ống mao quản) bằng syringe có sẵn một adaptor. Các ống mao
quản được làm bằng thủy tinh nên có thế dùng parafin lỏng để kiểm soát sự dao
động làm thay đổi áp suất thẩm thấu.
Huyền phù trứng và tinh trùng trong cọng rạ được bảo vệ bởi các khoảng môi
trường, ngăn cách xen kẽ với các bóng khơng khí. Cả ống mao quản và cọng rạ


được ủ trong điêu kiện nhiệt độ 37°C, 5% CO2. Sau khi thụ tinh dùng pipette đẩy
hết dung dịch chứa trong ống mao quản (hay cọng rạ) vào trong đĩa một hay bốn


giếng để kiểm tra. Rửa nhiều lần cọng rạ (hay các ống mao quản) nếu không thấy
trứng nằm trong đĩa.
d. Thụ tinh trong vi giọt
Phương pháp IVF phố biến nhất là đưa các phức hợp trứng vào một vi giọt đã
được chuẩn bị sẵn từ 20 - 50 µl huyền phù tinh trùng dưới lớp dầu khống. Điều
này có nhiều thuận lợi: Kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu mơi trường bởi thể
tích nhỏ và số lượng tinh trùng ít (2.000 - 5.000), rất hữu ích cho những trường hợp
mẫu ít tinh trùng. Khó khăn chính yếu là yêu câu người thao tác phải có kinh
nghiệm.
Các vi giọt có thế được chuẩn bị trong đĩa petri nhỏ, các đĩa một hay bốn
giếng vơ trùng. Dầu khống hay paraffin lỏng đều có thể được sử dụng, tuy nhiên
phải kiểm tra kỹ về tính gây độc và gây sốc. Dầu khống phải được cân bằng hóa lý
trong 24 giờ ở 37°C và 5% CO2 trước khi sử dụng.
Các tinh trùng được chuẩn bị bằng phương pháp swim up hay ly tâm trên
percoll, sau đó ly tâm tiếp tục và chỉnh về nồng độ 5.000 tinh trùng di động trong
50µl. Các đĩa sau đó được đặt trong tủ ấm 37°C, 5% CO2.

Hình 2.1 Các thiết bị dùng trong kỹ thuật IVF


2.2.2. Sơ lược lịch sử phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)
Kết quả IVF thành công lần đầu tiên trên các đối tượng khác nhau:
Tác giả nghiên cứu

Đối tượng đưọc nghiên cứu

Chang (1959)

Thỏ

Whittingham (1968) Toyoda &

Chuột (thai 17 ngày tuổi)

Chang (1974) Steptoe & Edwards

Chuột rattus

(1978)

Người

Bracket

và

cs

(1982)

Hanada(1985)

Bò cái

Hanada(1985)

Dê

Cheng và cs (1986) Palmer và

Cừu

Năm 1959, Chans là người đầu tiên thu nhận được con thỏ bằng phương pháp
thụ tinh trong ống nghiệm (IVF). Ớ người hơn 1.000 đứa trẻ đã ra đời bằng phương
pháp thụ tinh trong ống nghiệm kể từ khi thí nghiệm thành cơng của Steptoe và
Edwards's vào năm 1978. Ớ nước Nhật, nhóm nghiên cứu tại bệnh viện đại học
Tohoku đã thành công kỹ thuật IVF vào năm 1983. Phương pháp thụ tinh trong ống
nghiệm ứng đụng trên bò thành công bởi Bracket vào năm 1982. Ngày nay phương
pháp này đã được áp dụng rộng rãi trên khắp thế giới
2.2.3. Lịch sử phát triển kỹ thuật sản xuất phôi bò in vitro


2.2.4. Các bước chính trong kỹ thuật IVF

Hình 2.2 Các bước chính trong sản xuất phơi in vitro
2.2.3 Các phân đoạn thực hiện kỹ thuật IVF đối với phơi bị
2.2.3.1. Kỹ thuật ni trứng trưởng thành (in vitro maturity)

Trứng bị dùng cho kỹ thuật thụ tinh trong vi giọt có thể lấy từ buồng trứng thu
tại lò mổ hoặc thu từ kỹ thuật OPU.
Bước 1. Thu mẫu buồng trứng bò tai lò mổ
Ngay sau khi bò cái được siết mổ, dùng kéo cắt bỏ buồng trứng tại vị trí mạc
treo bng trứng phía sừng tử cung, cắt bỏ phần mỡ bao quanh buồng trứng.
Rửa buồng trứng 2 đến 3 lần bằng dung dịch thu mẫu cho đến khi sạch máu.
Buồng trứng được chứa trong chai schot 250ml có chứa sẵn dung dịch nước
muối sinh lý 0,9% có bố sung kháng sinh penecilin và streptomycin. Sau đó buồng
trứng được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau: 37°C, nhiệt độ môi trường (khoảng
25°C) trong vòng 5 giờ và ở nhiệt độ 10°C trong vòng 16 giờ.


Hình 2.3 Thu mẫu buồng trứng bị
Sau thời gian bảo quản mẫu ở nhiệt độ nhất định, mẫu được tiến hành như sau:
- Rửa lại buồng trứng 2 đến 3 lần bằng dung dịch thu mẫu buồng trứng và lau
khô buồng trứng bàng gạc y tế vô trùng trước khi thu dịch nang trứng.
- Chuẩn bị kéo pipette pasteur với kích thước phù hợp dưới ngọn đèn cồn
trong tủ cấy vô trùng.
- Dùng ống tiêm 5cc gắn kim 18G và môi,trường thu dịch nang trứng (DPBS) đế thu dịch nang trứng trong các nang nỗn có kích thước 2-8mm. Theo
Anne-Sophie Lequarre và cộng sự (2004), noãn được thu nhận từ nang nỗn có
đường kính lớn hơn 6mm ln cho tỉ lệ phôi phát triến đến giai đoạn blastocyt cao
hơn các nỗn được thu nhận từ nans nỗn có đường kính nhỏ hơn 4mm. Không thu
dịch nang trứng trong các nang nỗn có đường kính lớn hơn 8mm vì các sợi huyết
kết họp với các chất cặn khác gây khó cho việc tìm các nỗn bào.
- Tất cả dịch nang trứng thu được cho vào đĩa petri đường kính 90mm đã
được kẻ ơ vng (kích thước 10mm) ở phía dưới đáy để việc tìm trứng được thuận
lợi và tránh tìm sót trứng.
Bước 3. Tìm trứng và phân loại trứng dưới kính hiên vi soi nổi

- Đặt đĩa petri có dịch nang trứng lên kính hiến vi soi nổi và bát đầu tìm trứng
trong từng ơ vng, dùng pipette pasteur có đường kính ở phía đầu phù hợp (180200 micron) để nhặt trứng trong đĩa ra, tránh làm tổn hại lớp tế bào cumulus xung
quanh trứng.
- Phân loại trứng: Dựa vào lớp tế bào cumulus bao quanh trứng người ta phân
loại trứng thành 4 mức độ là: Mức độ 1- Trứng được bao quanh bởi hơn 3 lớp tế bào
cumulus với noãn bào chất đồng nhất; Mức độ 2- Trứng được bao quanh bởi 1 đến
2 lớp tế bào cumulus đơi khi có những cho khơng có tế bào cumulus bao quanh.
Mức độ 3- Trứng được bao quanh bởi ít tế bào cumulus, đơi khi khơng có tế bào
cumulus bao quanh trứng. Mức độ 4- Trứng không được bao quanh bởi tế bào
cumulus, đôi khi được bao quanh bởi những sợi fibrin có hình dạng giống như
mạng nhện.

Phân loại trứng dựa trên lớp tế bào cumulus (Kerry w. Kendrick, 1997).
- Chỉ sử dụng trứng loại A và B.
- Dùng mouth pipette chuyển trứng vào đĩa rửa và tiến hành rửa trứng với
dung dịch D-PBS và dung dịch TCM-199.
Bước 4. Nuôi trứng trưởng thành (hay nuôi chín trứng)
- Chuấn bị đĩa petri nhựa Ф35 mm. Trong mỗi đĩa chứa 4 vi giọt môi trường
nuôi cấy với thể tích 100µl được phủ bằng dầu khống. Đĩa này được chuẩn bị và
cân bằng trong tủ âm CO2 ở nhiệt độ 38,5°C, 5% CO2 ít nhất 2 giờ trước khi sử
dụng.
- Sau khi đã rửa noãn bào xong, đưa nỗn bào vào bên trong giọt mơi trường
ni của đĩa nuôi cấy. Chuyển khoảng 20 - 25 trứng vào mỗi giọt mơi trường ni
cấy với thể tích 100 µl.


- Sau đó giữ nỗn bào trong tủ ấm ở 38,5°c và 2% CO 2, độ ẩm 90 - 100%
trong 20 - 24 giờ
- Sau 20-24 giờ nuôi cấy trứng được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược đế
xem xét tỷ lệ trứng trưởng thảnh dựa trên sự giản nở của tế bào cumulus.

2.2.3.2. Kỹ thuật thụ tinh trong vi giọt (in vitro fertilization)
Bước 1. Chuẩn bi tinh dich (hoạt hóa tinh dịch)
- Giải đơng 1 -2 cọng rạ 0,25 ml (phụ thuộc vào lượng tinh trùng) tại 37°C
trong bể ổn nhiệt trong khoảng thời gian 1 phút.
-Trộn với 6 ml dung dịch rửa tỉnh vào ống ly tâm và ly tâm tại 1.800
vòng/phút trong 5 phút.
- Sau khi ly tâm xong, hút lấy dung dịch phía trên cùng bằng pipette đã được
khử trùng đầu tuýp. Và lặp lại quy trình đó 2 lần.
Thêm 0,5 - 0,8 ml dung dịch rửa tinh dịch vào chất cặn lắng còn lại bằng
pipette có xác định thể tích. Để thuận tiện cho việc tính tốn, đây là thể tích ban đầu
(xấp xỉ khoảng 0,6 - 0,8 ml).
- Thêm 50 µl dung dịch tinh trùng vào 4,95 ml dung dịch nước muối 3%
NaCl và xác định số lượng bằng máy đếm mật độ tinh trùng.


Điều chỉnh nồng độ tinh trùng khoảng 25 X 106/ml bằng cách thêm vào dung
dịch pha loãng tinh (pha loãng lần 1). Sau đó thêm dung dịch trên để nồng độ tinh
trùng cuối cùng đạt khoảng 12 X 106/ml (pha loãng lần 2).
- Sau khi điều chỉnh nồng độ tinh trùng đạt mức cần thiết, chuẩn bị 4 vi giọt
(mỗi giọt có thế tích 100 µl) trong đĩa petri nhỏ, cho vào một lớp dầu khoáng và giữ
trong tủ ấm.
Bước 2. Thụ tinh trong vi giọt
- Chuẩn bị 3 đĩa petri nhỏ đường kính 35mm với dung dịch rửa nỗn bào được
phủ bằng một lớp dầu khoáng. Các đĩa này được chuẩn bị và được cân bằng trong tủ
ấm CO2 ít nhất 2 giờ trước khi sử dụng.
- Thực hiện kéo pipette pasteur có kích thước thích hợp trong buồng cấy vô
trùng dưới ngọn lửa đèn cồn.
- Quan sát dưới kính hiến vi soi nổi và tiến hành rửa nỗn bào 3 lần bằng dung
dịch rửa noãn bào.

- Chuyến 20 - 25 nỗn bào (với thế tích rất nhỏ của môi trường) vào giọt tinh
trùng đã chuẩn bị sẵn.
- Ủ ấm trong 5 giờ trong tủ ấm ở 38,5oC và nồng độ CO2 2%.
2.2.3.3. Kỹ thuật ni phơi (ìn vitro culture)
Bước 1. Ni hợp tử trong mơi trường Crlaa có bố sung 5% FBS (fetal bovine
serum).


- Sau khi ủ với tinh trùng xong, trứng được rửa sạch trong môi trường Crlaa +
5% FBS từ hai đến ba lần bằng mouth pipette với kích thước kéo phù hợp sao cho
có thể loại bỏ được các tế bào cumulus ra khỏi trứng. Nếu lần này ta chưa loại bỏ
hết được các tế bào cumulus ra khỏi trứng thì ta có thế loại bỏ sau 24 giờ ni cấy
sau đó.
- Chuyển tất cả các trứng sau khi rửa vào trong đĩa petri đường kính 35 mm
có chứa những vi giọt môi trường nuôi cấy Crlaa + 5% FBS đã được ủ ít nhất 2 giờ
ờ trong tủ ấm.
- Sau khi chuyển xong, đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 38,5°C, 5% CO 2 ẩm
độ 90%.
Bước 2. Kiểm tra giai đoạn phát triển đầu tiên (48 giờ sau khi thụ tinh)
Việc kiểm tra này được tiến hành như là một trong những tiêu chuẩn đánh giá
hiệu quả của phương pháp. Tỷ lệ phân chia của trứng được quan sát và xếp lớp theo
những tính chất như sau:
Hơn 4 tế bào

2 - 4 tế bào

Khơng thụ tinh

Thối hóa

Bước 3. Kiểm tra sự phát triển đến phôi nang
Từ ngày 7 - 8, những trứng được thụ tinh tốt sẽ phát triển đến giai đoạn phôi
nang. Sau 7 ngày, nên kiểm tra sự phát triển của phôi một lần một ngày và phơi ở
giai đoạn này có thể được sử dụng cho việc chuyển phơi, đơng lạnh hay bất kì mục
đích nào khác. Ngồi ra ta cũng có thể đơng lạnh phơi dâu ở ngày thử 5 hay thứ 6.
Quy trình sản xuất phơi bị in-vitro (tóm lược)


2.3. Kỹ thuật chuyển phôi động vật
2.3.1 Cấy chuyển phôi:
Cấy phôi là biện pháp quan trọng nhằm cải thiện đàn gia súc với tốc độ nhanh,
đồng thời tạo cơ hội tận dụng sự đóng góp về di truyền của cả con đực và con cái.
Công nghệ này bao gồm gây rụng nhiều trứng, một khâu quan trọng để nâng cao số
lượng tế bào trứng từ những con cho siêu đẳng. Năm 1890, lần đầu tiên Walter
Heape đã cấy phôi thành công cho thỏ. Về sau, việc cấy phôi cho các lồi có vú
khác tiếp tục ra đời. Năm 1987 hình thành khái niệm rụng nhiều trứng và cấy phôi
(MOET – multiple ovulation and embryo transfer). MOET đã tăng cường độ chọn
lọc, rút ngắn khoảng cách di truyền và tăng tiến bộ di truyền. Gây rụng trứng nhiều
được thực hiện trên những con cho bằng các hormone, chủ yếu là những hormone
được tinh chế từ tuyến yên lợn (FSH-P) hoặc gonadotrophin huyết thanh ngựa chửa
(PMSG) [sau này, người ta gọi lại cho đúng hơn, đó là gonodotrophin màng đệm
nhau thai ngựa chửa – eCG]. eCG có đáp ứng tốt nhưng cũng có tác động khơng tốt
lên phơi, do đó, FSH được ưa chuộng hơn. Trong gây rụng trứng nhiều, người ta
dẫn tinh hai lần bằng tinh dịch của những đực giống thượng hạng. Việc thu phôi
được thực hiện vào ngày thứ 6/7 (với bò) hoặc ngày thứ 5/6 (với trâu) để cấy phôi
tươi hoặc bảo tồn đông lạnh rồi sử dụng về sau. Tỉ lệ thụ thai ở bò và trâu cấy phôi
đạt khoảng 35 - 45% (Choudhary


cs, 2016).

Chuyển phơi ở bị nhằm tạo ra một số lượng bê con tốt bằng cách chọn một bò
cái (bò cho) có tính trạng di truyền tốt, cơ thể khỏe mạnh, sau đó gây siêu bài nỗn,
gieo tinh nhân tạo và cuối cùng là chuyển các noãn đã thụ tinh sang tử cung của
những bò cái khác (bò nhận). Điều này giúp cải thiện di truyền cũng như tăng lợi
nhuận. Trong điều kiện tự nhiên, một bò cái chỉ sinh được 7 hoặc 8 bê con trong
cuộc đời dù cho nó có đến 10.000 nang nỗn ngun thủy. Một lần tiến hành chuyển
phơi có thể tạo được số lượng bê con bằng một bò cái sinh sản trong 10 năm nên kỹ
thuật này cực kì hữu dụng với những lồi đơn thai như bị.
Q trình chuyển phơi sẽ giúp tạo ra đồng thời hàng loạt bê con bằng cách thu
phôi từ đường sinh sản của một bò cái và chuyển sang những bị cái khác.
Cơng nghệ cấy truyền phơi có những ứng dụng sau đây:
- Tăng số bê con của những bị cái có tiêm năng sản xuất vượt trội.
- Tăng tốc độ kiểm tra đời sau.
- Giảm khoảng cách thế hệ bàng cách gây rụng nhiều trứng của những bị cái hậu bị
trước lúc thành thục về tính và cấy phôi cho những con nhận đã trưởng thành. Điều
này có thể làm tăng tốc độ di truyền.
- Vận chuyển phơi từ nước này sang nước khác do đó có thể giảm được các vấn đề
lây truyền bệnh tật và giảm thời gian kiểm dịch. Điều này cũng loại bỏ stress và
giảm giá vận chuyển gia súc sống.
- Tạo bê sinh đơi.
- Có thể thu phơi từ những bị cái cao sản nhưng vơ sinh hoặc những bị cái đó
khơng có khả năng duy trì q trình có chửa bình thường.
- Cấy truyền phôi là một công cụ nghiên cứu trong một số ngành khoa học như sinh
lý, phôi thai học, miễn dịch sinh sản, di truyền học, thú y...
Thuận lợi

Khó khăn

- Tăng số thai (có thể tạo ra sinh đơi và sinh

- Địi hỏi kỹ thuật cao, phức tạp.

ba).

- Cần nghiên cứu ở nhiều lĩnh vực.

- Tăng chất lượng.

- Đắt tiền.


Thuận lợi

Khó khăn

- Giảm thời gian nhân giống.

- Nhũng phản ứng bất lợi của hormone do

- Áp dụng trong việc tạo dòng.

kháng thể gây nên.

- Lưu trữ được vật liệu di truyền chất lượng

- Chấn thương do quá trình phẫu thuật (sẹo,

cao (bằng cách đơng lạnh phơi).

dính nội tạng hoặc chết do gây mê).

- Chi phí vận chuyển thấp (chỉ chuyển phơi

- Nguy hiểm nếu chuyển phơi của bị to con

thay vì cả con thú sống).

vào bị nhỏ con.

- Đóng góp cho nghiên cứu việc giảm hoặc

- Bị tạp dịng.

ngưng sinh sản.

- Thủ tục phức tạp (kiểm tra nhóm máu).

- Đóng góp cho sinh học và y học (phơi bảo
học, miễn dịch học).
- Hợp tác quốc tế về giống vật nuôi (thị
trường mua bán phôi).

2.3.2. Lịch sử phương pháp chuyển phôi
Heape (1890) ở Anh là người đầu tiên chuyển phôi thành công và cho ra đời 4
con thỏ non. Sau đó Biedl và cs (1922), Nicholas (1933), Pincus và Enznann
(1934), Chang (1948) và Dowling (1949) đã thành công trên thỏ. Ở Nhật, Kurosaki
và Nakabachi (1953), Sakuma và cs (1954) cũng thành cơng bước đầu trên thỏ.
Sau đó nhiều thử nghiệm thành công trên các động vật khác đã được công bố: Cừu
và dê (Warwick và Berry, 1949), cừu (Lopyrin và cs, 1950), heo (Kvansnickii,
1951). Ở Nhật, Nishikawa và Onuma (1957), Otsuki và cs (1960) và Sugie (1973)

đã thành công trên cừu và dê.
Lần chuyển phôi thành công đầu tiên trên một số lồi:
Năm
1890
1932
1933
1934
1942
1949
1951
1951

Lồi
Thỏ
Dê*
Cht
Cừu
Cht
Dê
Heo
Bị

Tác giả
Heape
Warwick và cs (1934)
Nicholas
Warwick và cs
Fekete và Little
Warwick và Berry
Kvansnickii

Willett và cs

Năm
1964
1968
1974
1975
1976
1978
1978
1979

Lồi
Chuột
Chơn sương
Ngựa
Chơn
Khỉ
Mèo
Người
Chó

Tác giả
Blaha
Chang
Oguri và Tsutsumi
Adams
Kraemer và cs
Schriver và Kraemer
Steptoe và Edwards

Kinney và cs


2.3.3. Quy trình của kỹ thuật chuyển phơi trên bị
1 Chọn bị cho và nhận (khơng có bệnh truyền nhiễm...)
2 Kiểm tra đường sinh sản của bò cho và nhận (khám qua trực tràng)
3 Ghi nhận chu kì động dục ở bị cho và nhận
4 Gây đa xuất nỗn ở bò cho (bằng hormone gonadotropin)
5 Gây động dục ở bò cho (bằng prostaglandin)
6 Gây động dục đồng pha ở bò nhận (bằng prostaglandin)
7 Kiểm tra sự động dục ở bò cho và nhận (dấu hiệu động dục đứng)
8 Thụ tinh bị cho bằng tinh đơng lạnh
9 Chuẩn bị cho thu phơi ở bị cho (kiểm tra trực tràng, cho nhịn ăn)
10 Chuẩn bị cho chuyển phơi ở bị nhận (kiểm tra trực tràng, cho nhịn
ăn) 11 Thu phơi từ bị cho (bằng phẫu thuật hoặc súc rửa tử cung)
12 Kiểm tra dịch súc rửa và phôi, phân loại và bảo quản phơi
13 Chuyển phơi vào bị nhận (gây mê, phẫu thuật)
14 Theo dõi bị cho sau khi thu phơi (kiểm tra động dục, gieo tinh nhân tạo)
15 Theo dõi bò cho sau khi chuyển phơi (chăm sóc sức khỏe)
16 Xác nhận tình trạng mang thai ở bị nhận (qua trực tràng)
17 Chăm sóc bị nhận mang thai
18 Loại thải hoặc sử dụng tiếp bị nhận khơng mang thai (kiểm tra động
dục) 19 Cho bị nhận sinh con (có thể phải mồ để lấy bê)
20 Kiếm tra sức khỏe cho bê mới sinh (kiểm tra nhóm máu)
* Một số cơng đoạn chính của kỹ thuật chuyển phơi trên bị
1 Gây siêu bài nỗn
2 Gây động dục đồng pha
3 Thu phơi
4 Xử lý phôi
5 Chuyển phôi

2.3.4. Hướng dẫn thực hiện cấy truyền phôi
a.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của kỹ thuật cấy truyền phôi