Khóa luận nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine o và rhodamine b trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ
MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh
MSSV:

40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn
Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ
MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh
MSSV:

40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn
Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô
Huỳnh Thị Nhàn vì đã giao cho em đề tài nghiên cứu này. Cảm ơn cơ vì đã tận tình
hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt thời gian nghiên cứu.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng, thầy Nguyễn
Thành Lộc, thầy Trần Bữu Đăng, cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, cô Phạm Thị Thảo Uyên
và cô Văn Thị Cẩm Duyên đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận.
Và em cũng khơng qn gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Hồng Vân, thầy
Huỳnh Lời, thầy Lê Văn Huấn và Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Dược Sài Gịn
(Sapharcen) – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được sử dụng
trang thiết bị, máy móc cần thiết phục vụ đề tài này và cũng hết lòng hướng dẫn, giúp
đỡ em.
Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần,
nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn. Đặc biệt, cảm ơn bạn Nguyễn Thanh
Thơi đã đồng hành cùng em trong quá trình thực hiện đề tài.
Một lần nữa em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – trường Đại học Sư
phạm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy em trong bốn năm qua.

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả mọi người. Kính chúc thầy cơ, tất cả bạn bè và gia
đình thật nhiều sức khỏe.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Phan Thị Ngọc Trinh


XÁC NHẬN CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
Chủ tịch Hội đồng


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Auramine O .........................................................................................................3
1.1.1. Khái quát chung ..............................................................................................3
1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học ................................................................3

1.1.3. Độc tính...........................................................................................................4
1.2. Rhodamine B .......................................................................................................4
1.2.1. Khái quát chung ..............................................................................................4
1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học ................................................................4
1.2.3. Độc tính...........................................................................................................5
1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước ..5
1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............8
1.4.1. Định nghĩa.......................................................................................................8
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký ...............................................................8
1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ ................................................................................9
1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký ....................................................10
1.4.5. Hệ thống HPLC ............................................................................................ 15
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................................18
2.1. Hóa chất và dụng cụ..........................................................................................18
2.1.1. Hóa chất ........................................................................................................18
2.1.2. Dụng cụ - thiết bị ..........................................................................................19
2.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................20
2.3. Các bước tiến hành sắc ký ................................................................................20
2.3.1. Chuẩn bị dung môi........................................................................................20


2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo ...........................................................................................20
2.3.3. Cách vận hành thiết bị ..................................................................................21
2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký ..........................................................22
2.4.1. Khoảng bước sóng của detector....................................................................22
2.4.2. Tối ưu hóa pha động .....................................................................................22
2.5. Thẩm định phương pháp ..................................................................................26
2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn ..............................................26
2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).............27
2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo....................................................................28

2.6. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu.....................................................................................29
2.6.1. Lấy mẫu ........................................................................................................29
2.6.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích ............................................................................30
2.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị ................................................................ 30
2.7.1. Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE) ........................................................30
2.7.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết ..................................................................32
2.7.3. Xác định hệ số thu hồi của quy trình ............................................................ 33
2.7.4. Tính chọn lọc của quy trình ..........................................................................33
2.8. Phân tích một số mẫu gia vị ..............................................................................33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 34
3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký ................................................................ 34
3.1.1. Chọn khoảng bước sóng cho detector...........................................................34
3.1.2. Tối ưu hóa pha động .....................................................................................34
3.2. Thẩm định phương pháp ..................................................................................46
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn .................................................................................46
3.2.3. Xác định LOD, LOQ ....................................................................................48
3.2.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp ...........................................................50


3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị ................................................................ 50
3.3.1. Khảo sát giai đoạn SPE.................................................................................50
3.3.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết ..................................................................53
3.3.3. Tính chọn lọc của quy trình ..........................................................................54
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................56
4.1. Kết luận ..............................................................................................................56
4.2. Đề xuất................................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................58
PHỤ LỤC .....................................................................................................................60

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB ...................................................... 5
Bảng 2.1. Danh mục dung môi ..................................................................................... 18
Bảng 2.2. Danh mục hóa chất ....................................................................................... 18
Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu .......................... 19
Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB .. 27
Bảng 2.5. Thông tin về các mẫu gia vị phân tích .......................................................... 29
Bảng 3.1. Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong
MeOH và ACN .............................................................................................................. 34
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB ................................ 37
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB .................................... 38
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB ........................................ 39
Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng................................. 40
Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu .................................................................. 41
Bảng 3.7. Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2) ................................... 42
Bảng 3.8. So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN .......... 43
Bảng 3.9. Chương trình pha động tối ưu ...................................................................... 45
Bảng 3.10. Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân
tích HPLC ...................................................................................................................... 46
Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD ................................................................................ 48
Bảng 3.12. Kết quả xác định LOQ ................................................................................ 49
Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak ............................... 50
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE ........................................................... 51
Bảng 3.15. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát ...................................................... 52
Bảng 3.16. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE ............ 52
Bảng 3.17. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ
vị hương lần 1 ................................................................................................................ 53
Bảng 3.18. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ
vị hương lần 2 ................................................................................................................ 54

Bảng 4.1. Thành phần pha động ................................................................................... 56
Bảng 4.2. Phương trình đường chuẩn của AO và RB ................................................... 56


DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của AO .............................................................................. 3
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của RB .............................................................................. 4
Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong cột sắc ký ................................................................ 9
Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6] ...................................................................... 10
Hình 1.5. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] ............................................. 14
Hình 1.6. Các thiết bị trong hệ thống HPLC ............................................................... 15
Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) ................ 23
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) .................. 24
Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 ................ 25
Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 ....................... 25
Hình 2.5. Cách xác định S/N [4] ................................................................................... 27
Hình 2.6. Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn ................................................................. 30
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị ................................................................... 32
Hình 3.1. Sắc đồ của chương trình 5 ............................................................................ 35
Hình 3.2. Sắc đồ của chương trình 6 ............................................................................ 35
Hình 3.3. Sắc đồ của chương trình 7 ............................................................................ 36
Hình 3.4. Sắc đồ của chương trình 8 ............................................................................ 36
Hình 3.5. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0) ............................ 37
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH ........... 38
Hình 3.7. Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) ................ 38
Hình 3.8. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03% .......................... 39
Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dịng 0,6 mL/phút ......................... 40
Hình 3.10. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút ....................... 40
Hình 3.11. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dịng 0,85 mL/phút ..................... 40

Hình 3.12. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút ....................... 41
Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO .................. 47
Hình 3.14. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB................... 47
Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ......................................................... 48
Hình 3.16. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ......................................................... 49
Hình 3.17. Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm ......................... 55


Hình 3.18. Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương
....................................................................................................................................... 55
Hình 4.1. Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu ........................................................................... 57


KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ Tiếng Việt (Tiếng Anh)

ACN

Acetonitrile

AO

Auramine O

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association
Official Analytical Chemists)

C

Nồng độ (Concentration)

CPT

Chất phân tích

EtOH

Ethanol

H

Chiều cao peak sắc ký

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

IARC

Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency
for Research on Cancer)

LC

Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography)

LC50

Nồng độ hóa chất cho các thí nghiệm hít phải trong khơng khí
có thể tiêu diệt 50% các động vật thử nghiệm trong một thời
gian nhất định (Lethal Concentration, 50%)

LD50

Lượng chất độc hoặc phóng xạ cần thiết để tiêu diệt 50% số
lượng sinh vật thử nghiệm sau một khoảng thời gian nhất định
(Lethal Dose, 50%)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MeOH

Methanol

MP

Pha động (Mobile Phase)

MS

Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

PAD, DAD

Detector mảng diot quang (Photo Array Diode Detector)

PDA

Mảng diot quang (Photo Diode Array)

ppm

Một phần triệu (Parts Per Milion)

RB

Rhodamine B


RP

Pha đảo (Reversed Phase)

Speak

Diện tích peak sắc ký

SP

Pha tĩnh (Stationary Phase)

SPE

Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

STT

Số thứ tự

tR

Thời gian lưu (Retention Time)

v:v

Tỷ lệ về thể tích

UV/Vis

Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)


MỞ ĐẦU

Nhằm đáp ứng nhu cầu đời sống ngày càng cao của con người thì cơng nghiệp thực
phẩm ngày càng phát triển nhanh. Trong những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm
là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất và bảo
quản gia vị đang ngày càng được coi trọng.
Để tạo màu sắc đẹp và bắt mắt cho gia vị thì trong quá trình sản xuất, một số cơ sở

sản xuất sử dụng thêm các phẩm màu công nghiệp cho vào gia vị. Điều này khiến người
tiêu dùng đang bị đánh lừa bởi vẻ ngoài của các sản phẩm gia vị đang được bày bán trên
thị trường. Trong số các phẩm màu công nghiệp này, phải kể đến Auramine O (AO) và
Rhodamine B (RB), hai phẩm màu công nghiệp bị cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị
và được xếp vào nhóm chất có khả năng gây ung thư. Hiện nay, AO và RB chỉ còn sản
xuất ở các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ,…).
Trong một vài năm trở lại đây, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam nổi
cộm với vấn đề bột gia vị, thực phẩm nhiễm phẩm màu độc hại. Cụ thể, AO từng bị phát
hiện trong một số loại thực phẩm như thịt gà, măng chua, dưa cải chua; RB cũng bị phát
hiện trong hạt dưa, ớt bột,… Mặc dù, AO và RB là hai chất cấm sử dụng trong thực
phẩm, gia vị nhưng vẫn được thêm vào, điều này thật đáng lo ngại.
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các phòng kiểm nghiệm
đã được trang bị các kỹ thuật hiện đại để phân tích và xác định hàm lượng của các phẩm
màu công nghiệp đã sử dụng trái phép trong sản xuất, nhằm kiểm soát chất lượng thực
phẩm. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong số những phương pháp được sử
dụng nhiều hiện nay. HPLC có nhiều ưu điểm như: phân tích nhanh chóng, xác định
đồng thời được nhiều chất, ít tốn mẫu, thao tác đơn giản… Tại Việt Nam, trong những
năm gần đây, đã có những cơng trình nghiên cứu xác định RB trong thực phẩm, gia vị
bằng phương pháp HPLC [1],[8]; xác định AO trong thức ăn chăn nuôi bằng phương
pháp HPLC [5]. Qua đó, chúng tơi thấy rằng chưa có những nghiên cứu về quy trình xác
định đồng thời AO và RB trong bột gia vị.

1


Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu quy
trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị
bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến” với mong muốn
đề xuất quy trình phân tích hiệu quả, phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phịng thí
nghiệm với hai mục tiêu:

- Xây dựng được quy trình xác định đồng thời AO và RB bằng phương pháp HPLC
kết nối detector tử ngoại khả kiến.
- Áp dụng quy trình này để xác định đồng thời AO và RB trong mẫu gia vị.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Auramine O
1.1.1. Khái quát chung
Auramine

O

(dạng

muối

hydrochloride)

thuộc

nhóm

thuốc

nhuộm

diphenylmethane [22]. AO được sử dụng làm chất nhuộm màu cho giấy và mực, ở mức
độ thấp hơn đối với hàng dệt và da. AO đã được phát hiện trong các mẫu thực phẩm từ

Ấn Độ, bao gồm cả đậu Hà Lan tươi và các sản phẩm đậu ở Trung Quốc. Việc sản xuất
AO bị cấm ở Châu Âu và Hoa Kỳ, hiện nay chủ yếu sản xuất ở Ấn Độ và Trung Quốc
[19]. Bên cạnh đó, AO khơng có trong danh sách phụ gia thực phẩm trong quy chuẩn
Việt Nam.
AO thường chứa dextrin hoặc các chất pha loãng khác được thêm vào để chuẩn
hóa hàm lượng thuốc nhuộm. AO được sử dụng như là nguyên liệu tạo màu vàng, kết
hợp với các thuốc nhuộm khác, nó tạo ra hoặc tăng cường màu xanh hoặc đỏ. Năng suất
lượng tử của thuốc nhuộm huỳnh quang này phụ thuộc vào độ nhớt của dung mơi; trong
ethanol 95% hoặc saccarose 60% thì cao gấp 87 và 10 lần so với trong nước. Ngồi ra
AO cịn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang, khi kết hợp với thuốc nhuộm RB
làm cho các vi sinh vật kháng acid phát huỳnh quang [23].
1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học
NH.HCl

N

N

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của AO
- Công thức phân tử: C17H21N3 HCl. Khối lượng mol phân tử: 303,834 g/mol
- Danh pháp: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid
- Tên gọi khác: Auramine O, Basic Yellow 2, Vàng ô
- AO dạng tinh khiết là chất bột màu vàng. Tan trong nước và EtOH, tan rất ít trong
xylene [22] (10 mg/mL trong nước; 20 mg/mL trong EtOH; 60 mg/mL trong ethylene
glycol methyl ether [19]). AO nóng chảy ở trên 250 °C. Bước sóng hấp thụ cực đại là
370 nm, 432 nm. Bước sóng phát xạ cực đại là 550 nm. pKa: 9,8 ; 10,7 [22]
3


1.1.3. Độc tính

Một nghiên cứu ở Anh đã báo cáo ca lâm sàng ung thư bàng quang ở công nhân
làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất AO [19]. Các nhà khoa học cũng đã tiến
hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của AO trên động vật. Kết quả cho thấy, AO
làm tổn thương ADN trên gan, thận, tuỷ xương của chuột nhắt và chuột cống với liều
LD50 là 135 mg/kg, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột. Tổ chức
nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp AO vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn
hợp có thể gây ung thư cho người [19].
1.2. Rhodamine B
1.2.1. Khái quát chung
Rhodamine B thuộc nhóm thuốc nhuộm xanthene. RB được sử dụng làm thuốc
nhuộm cho giấy, len, lụa và mỹ phẩm [24]. Ngoài ra RB còn được sử dụng trong sinh
học như là chất nhuộm phát huỳnh quang, thường được kết hợp với AO trong phép
nhuộm Auramine - Rhodamine để phát hiện trực khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis
(MTB) [13].
1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của RB
- Cơng thức phân tử: C28H31ClN2O3. Khối lượng mol phân tử: 479,02 g/mol
- Danh pháp:
9-(2-carboxyphenyl)-6-(diethylamino)-N,N-diethyl-3H-xanthen-3-iminium
- Tên gọi khác: Rhodamine B; Brilliant Pink B; Basic Violet 10; Tetraethylrhodamine
- RB là tinh thể màu tối có ánh xanh, ở dạng bột màu nâu đỏ. Tan tốt trong MeOH,
EtOH, nước (khoảng 50 g/L). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 199°C đến 201°C. Bước
sóng hấp thụ cực đại:  = 542 – 554 nm [3]. pKa: 3,1; 3,25 [4]
4


1.2.3. Độc tính
RB gây độc tính cấp theo đường miệng, số liệu thống kê cho biết LD50 ở chuột là
lớn hơn 2000 mg/kg. Kích thích và gây tổn thương mắt nghiêm trọng khi thử nghiệm

với thỏ. Khi RB kết hợp với hemoglobin trong máu hình thành methemoglobin sẽ gây
các triệu chứng như: đau đầu, loạn nhịp tim, giảm huyết áp, khó thở và co thắt. Nếu tích
tụ trong thời gian dài còn gây hại cho thủy sinh vật. Chẳng hạn, LC50 thử nghiệm với
Gambusia affinis (cá muỗi) là 10 – 100 mg/L trong 96 giờ [2].
1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước
Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB
CPT, nền
mẫu

Phương pháp

Xử lý mẫu

Đánh giá
phương pháp

Trong nước
AO

trong - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS

thức ăn chăn MeOH

- Khoảng tuyến

- Cột Agilent C18 (1,8 µm x 2,1 tính: 0,5 – 50

- Giai đoạn SPE: mm x 50 mm) và tiền cột tương ng/mL

ni [5]

cột C18

ứng

- LOD: 8 µg/kg

 Rửa tạp bằng - Pha động: gradient hai kênh, - LOQ: 20 µg/kg
dung mơi MeOH : ACN (A) và HCOOH 0,1% (B)

- Hệ số thu hồi:

H2O (20:80, v:v)

82,4 – 109,2%

 Rửa giải bằng
dung môi MeOH
AO

trong - Dung môi chiết: LC – MS/MS

- LOD: 3,0 µg/kg

mẫu thịt và ACN

- Cột sắc ký pha đảo C18 (1,8 µm (mẫu

các mẫu thực

x 2,1 mm x 100 mm)

phẩm

- Pha động: gradient hai kênh, phẩm khác)

[10]

khác

dung dịch ammonium acetate
0,005 M (A) và MeOH (B)

5

thịt);

5,0

µg/kg (mẫu thực


RB trong bột - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis
gia vị [1]

- LOD: 0,2 ppm

hỗn hợp ACN : - Cột sắc ký: Symmetry C18 (5 - LOQ: 0,6 ppm
acetone (90:10, v:v) m x 4,6 mm x 150 mm)

- Hệ số thu hồi:

- Pha động: ACN : ammonium 84,8 – 87,2 %
acetate (60:40, v:v)
RB trong gia - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis hoặc HPLC –
vị và hạt dưa MeOH

DAD

[12]

- Cột phân tích HPLC C18 (5 µm

_

x 4,6 mm x 250 mm)
- Pha động: đẳng dòng, ACN:
H2O (75:25, v:v)
RB trong hạt - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis

Theo

phương

dưa, bánh xu hỗn hợp MeOH : - Pha tĩnh: RP – C8 (5 m x 4,6 pháp phân tích
xê, sirơ dâu, H2O (40:60, v:v)

mm

nước

- Pha động: đẳng dòng, 85% - LOD: 1,00 ppb

ngọt

hương dâu [8]

x

150

mm) trực tiếp:

ACN – 15% đệm (HCOOH – - LOQ: 3,33 ppb
0,007

mM

sodium

1

– Theo

phương

pháp

đường

heptansunfonate), pH = 3,0

chuẩn:
- LOD: 15,0 ppb
- LOQ: 50,2 ppb

Ngồi nước
RB trong bột - Dung mơi chiết: HPLC – UV/Vis
ớt [18]

- Khoảng tuyến

hỗn hợp ACN : - Cột: Waters Novapark ODS (4 tính: 0,2 – 50 ppm
acetone (90:10, v:v) μm x 3,9 mm x 150 mm) với cột - Hệ số thu hồi: 84
– 92%

bảo vệ
- Pha động: gradient hai kênh, 10
mM ammonium acetate, pH = 3,6
(A) và ACN (B)
Auramine và - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis
RB

- Khoảng tuyến

trong 10 mL 5% amonia - Cơt: µ-Bondapak C18 (3,9 mm tính: 0,2 – 25 ppm

bánh quy, kẹo trong 75% MeOH
ngọt [15]

x 300 mm) với tiền cột 90 mm

- Giai đoạn SPE:

(Auramine); 0,2 –
50 ppm (RB)

cột Polyamide
6


- Pha động: ACN – sodium

 Rửa tạp: H2O
 Rửa
acetic

3% acetate (20 mM, pH = 4,0; 80:20, - LOD:

giải:
acid

- v:v)

–

0,107

0,754

mg/L

MeOH (1:1, v:v)

- LOQ: 0,371 –
2,27 mg/L
- Hệ số thu hồi: 75
– 96,5%
AO và RB - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS

- LOD: 0,05 μg/kg

trong bột ớt, hỗn hợp ACN : H2O - Cột XTerra C18 RP (5 µm x 2,1 - LOQ: 0,3 μg/kg
tương ớt, xúc (90:10, v:v)

mm x 150 mm)

xích [16]

- Pha động: gradient hai kênh, 5
mM ammonium acetate, pH = 3,0
(A), MeOH (B)

AO và RB - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS

- LOD: 0,03 –

trong các sản ACN

- Cột: Waters XTerra C18 (5 µm 0,75 ppm

phẩm từ đậu - Giai đoạn SPE:

x 2,1 mm × 150 mm)

và thịt [17]

- LOQ: 0,1 – 2,0

 Pha loãng dịch - Pha động: gradient hai, 5 mM ppm
chiết bằng nước ammonium acetate, pH = 3,0 (A) - Hệ số thu hồi:
đến còn không và MeOH (B)

71,2 – 116,9%

quá 5% ACN
 Rửa giải: MeOH
 Cơ
bằng

dịch

chiết

khí

nitơ.

Phần cịn lại tái
tạo với ACN

AO, RB trong - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis

- Hệ số thu hồi:

gia vị và thực hỗn hợp ACN : - Cột Waters C18 (5 µm x 4,6 mm 73,1
phẩm [21]

acetone (90:10, v:v) x 250 mm)
- Pha động: gradient hai kênh, 10
mM ammonium acetate, pH = 3,0
(A) và ACN, pH = 3,0 (B)

7

(AO)

–

103,3%


1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng
cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời năm 1967 –
1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển.
Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự
phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích cũng là phương pháp được ứng
dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm [7].
1.4.1. Định nghĩa

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử CPT lên hai
pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu CPT gọi là pha tĩnh, một pha di
chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử CPT có ái lực khác nhau với pha
tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách và phân tích các
chất với pha động là chất lỏng, làm việc với áp suất từ 150 – 250 bar. Trong đó, pha tĩnh
có thể là chất lỏng (nó được giữ trong cột tách như một lớp màng nhờ một chất mang
trơ) hoặc là chất rắn. Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, pha động có thể chỉ là
một dung mơi nước hay dung môi hữu cơ; hỗn hợp của dung môi hữu cơ và nước…
hoặc cũng có thể là dung mơi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức, …[6]
Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký cột
lỏng hiệu năng cao [6].
Trong kỹ thuật phân tích HPLC, tùy theo cơ chế của quá trình sắc ký trong cột tách
mà người ta chia thành: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây
phân tử [6].
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất
thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm,
dược phẩm, mơi trường…
1.4.2. Ngun tắc của các q trình sắc ký
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại
sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất trao
đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố

8


hay sắc ký chiết. Nếu pha tĩnh là rây phân tử thì ta có sắc ký rây phân tử. Để rửa giải
CPT ra khỏi cột tách, cần một dung môi rửa giải, đó là pha động [6].
Với ba thành phần chính của hệ sắc ký: pha tĩnh, pha động, CPT; hiệu quả của sự
tách sắc ký được quyết định bởi tổng của các mối tương tác: giữa CPT và pha tĩnh (F1),

giữa CPT và pha động (F2), giữa pha tĩnh và pha động (F3) [6].

Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong hệ sắc ký
Tổng của ba lực tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột
trước. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được xác định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và
F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng. Ở đây, F1 là lực giữ CPT trên cột,
F2 là lực kéo của pha động đối với CPT ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì
F1 và F2 là khác nhau. Cịn thành phần F3 trong một hệ sắc ký có thành phần pha động
và các điều kiện khác là khơng đổi thì F3 của các chất hầu như khơng khác nhau. Vì vậy,
trong một hệ sắc ký, nếu các CPT có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh thì có
khả năng các CPT sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ có sự tách các CPT
khỏi nhau khi đi qua cột [6].
1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ
Trong sắc ký hấp phụ, quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau
của pha tĩnh đối với các CPT và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo CPT ra
khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Có
hai kiểu hấp phụ:
- Sắc ký hấp phụ pha thường (Normal Phase): pha tĩnh phân cực, pha động không
phân cực;
- Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reversed Phase): pha tĩnh ít hay khơng phân cực, pha
động phân cực.
9


Sắc ký hấp phụ được áp dụng rộng rãi, thành cơng để tách hỗn hợp các chất có
tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình.
Hiện nay, chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo là chủ yếu.
1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký
1.4.4.1. Thời gian lưu tR, thời gian lưu thực t 'R
Các CPT trong hỗn hợp mẫu, khi được nạp vào cột sắc ký sẽ bị lưu giữ ở trong cột

tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc
bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi peak đạt giá trị cực đại. Như vậy nếu gọi tRi là thời
gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta ln có:
tRi = to + t 'Ri

(1.1)

Trong đó:
to là thời gian khơng lưu giữ (thời gian CPT nằm trong pha động)

t 'Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký (thời gian lưu hiệu chỉnh).
Nếu to = 0 thì ta sẽ có tRi = t Ri : trường hợp này chỉ có khi tRi là rất nhỏ (thường là khi tRi
'

nhỏ hơn 4 phút) [6].

Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6]
'

Giá trị t Ri của một CPT trong quá trình sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ
như:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp;
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động;
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế;
10


- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất
tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc
ký. Trong sắc ký, các chất ion thì yếu tố này thể hiện rõ nét.

Giá trị thời gian lưu t 'Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký. Vì nó
cho biết các CPT trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện
thí nghiệm và một hệ pha đã chọn. Đồng thời, đó cũng là đại lượng để chúng ta phát
hiện định tính một chất.
Trong một phép phân tích, nếu t 'R nhỏ quá thì sự tách kém, ngược lại nếu t 'R quá
lớn thì peak bị dỗng và độ lặp lại thấp, thời gian phân tích dài. Điều này kéo theo nhiều
vấn đề khác như hao tốn dung mơi, hố chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để
thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên.
Mặt khác, trong một hệ sắc ký còn có:

t Ri =

L
ui

(1.2)

to =

L
uo

(1.3)

tRi = to ( 1 + k 'i )

(1.4)

Trong đó ui và uo là tốc độ tuyến tính của CPT i và của pha động (cm/s); k 'i là hệ
số dung lượng của CPT i; L là chiều dài của cột sắc ký [6].

1.4.4.2. Hệ số phân bố Ki và hệ số dung lượng k i
'

Quá trình tách sắc ký của các chất dựa trên cơ sở sự phân bố của CPT giữa pha
động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong hệ sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một
đại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ
của CPT i ở trong pha tĩnh và pha động:

Ki =

Ci(SP)
Ci(MP)

(1.5)

Trong đó, Ci(SP) và Ci(MP) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động. Hệ
số Ki cho biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha
tĩnh).

11


Hệ số phân bố Ki chưa nói lên được sức chứa của cột tách vì thế, người ta phải đưa
thêm vào hệ số dung lượng k 'i . Hệ số dung lượng k 'i cho ta biết tỷ số khối lượng của
CPT i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu, ta có:

k i' =

mi(SP)
mi(MP)

(1.6)

Trong đó, mi(SP) và mi(MP) là khối lượng CPT i trong pha tĩnh và trong pha động.
Mối quan hệ giữa hệ số dung lượng k 'i và hệ số phân bố Ki thể hiện qua phương
trình sau:

k i' = K i

Vi(SP)
Vi(MP)

(1.7)

Với Vi(SP) và Vi(MP) là thể tích của CPT i trong pha tĩnh và trong pha động.
1.4.4.3. Hệ số tách
Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại
lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ
số phân bố và là tỷ số của hệ số phân bố của hai chất [6].
'
K A k 'A t R(A)
α


K B k 'B t 'R(B)

(1.8)

Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1.
1.4.4.4. Số đĩa lý thuyết

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm
số đĩa lý thuyết N. Đây là một đại lượng hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký
như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) đĩa lý thuyết là H. Tất nhiên đây là lớp
có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:
- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt trịn hay mảnh;
- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh;
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (CPT);
- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký;
- Độ nhớt của pha động.
Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn, thì chiều cao
đĩa lý thuyết H có những giá trị xác định ứng với các CPT khác nhau. Chiều cao đĩa lý
thuyết H và số đĩa lý thuyết N được xác định theo công thức:
12


L  Wi 
H=


16  t Ri 

2

t 
L
N = = 16  Ri 
H
 Wi 

(1.9)

2

(1.10)

Trong đó, Wi là chiều rộng đáy peak sắc ký của CPT i.
Trong thực tế, số đĩa lý thuyết hiệu dụng Nef và chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng
Hef của một cột sắc ký mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng khả năng của một cột tách
và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể.

L  Wi 
H ef = 

16  t Ri - t o 

2

t - t 
N ef = 16  Ri o 
 Wi 

2

(1.11)

(1.12)

Nếu giá trị Nef q nhỏ thì khơng có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách khơng
hồn tồn. Nếu Nef q lớn thì cũng khơng cần thiết, vì khi đó peak sắc ký của các chất
tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động. Trong thực tế, Nef nằm trong
khoảng 5000 đến 8000 là vừa đủ [6].

1.4.4.5. Độ phân giải R
Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký. Hai
cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải
của hai peak cạnh nhau được tính theo công thức sau:

2(t 'RB - t 'RA )
R=
WB + WA

(1.13)

Trong đó, WA và WB là bề rộng đáy của peak sắc ký của hai chất A và B.
Nếu R càng lớn, hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có
một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký. Song nếu đoạn
đường nền này dài quá thì cũng khơng cần thiết, vì như thế ta tốn nhiều dung mơi (pha
động) để rửa giải các chất hơn. Do đó, giá trị R chỉ vừa đủ để hai chất tách khỏi nhau là
được.

13