Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH
TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY
TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO




Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003-2007
Sinh viên thực hiện: CAO THỊ THANH LOAN

Thành phố Hồ Chí Minh
2007



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************************





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH
TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY
TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO





Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH CAO THỊ THANH LOAN
ThS. NGUYỄN VĂN CƢỜNG







Thành phố Hồ Chí Minh
2007



iii


LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực
tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
- TS. Trần Thị Lệ Minh và Th.S Nguyễn Văn Cƣờng đã tận tình hƣớng
dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Phan Phƣớc Hiền và các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc
Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
- KS. Trần Ngọc Hùng cùng các anh chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh
học Đại học Nông Lâm Tp.HCM.

- Bạn Hoàng Thị Thu cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp
đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo
điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Tháng 08 năm 2007
Cao Thị Thanh Loan













iv

TÓM TẮT

CAO THỊ THANH LOAN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007.
“KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA HORMONE TĂNG TRƢỞNG AUXIN
LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY
TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO”
Hội đồng hướng dẫn:
TS. Trần Thị Lệ Minh
Th.S Nguyễn Văn Cường

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm phân tích
thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Tp.HCM trên đối tượng cây Trường xuân hoa.
Tiến hành tạo cây Trường xuân hoa in vitro từ chồi cây Trường xuân hoa trồng
trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học.
Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS
có bổ sung NAA được theo dõi ở các giai đoạn 7, 14, 21, 28, 35 ngày. Bên cạnh đó
thay đổi nồng độ NAA, IAA sử dụng nhằm chọn loại chất kích thích tăng trưởng
thích hợp thông qua các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ;
xác định sự tạo thành indol alkaloid trong cây in vitro bằng thuốc thử Wagner qua
hiện tượng tạo kết tủa với thuốc thử. Bằng hệ thống điện di mao quản, thực hiện
phân tích và định lượng các alkaloid đặc trưng của cây Trường xuân hoa in vitro
như catharanthine, vindoline…
Những kết quả thu được:
Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro: sử dụng NAA 0,5
mg/l và IAA 1 mg/l có tác động tốt lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ
của cây.
Định tính indol alkaloid bằng thuốc thử Wagner: các kết quả định tính cho
thấy có sự hiện diện của indol alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân



v
hoa in vitro. Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28
ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l.
Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro
bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây
Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline
của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày
nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA
0,5 mg/l.

vi
SUMMARY

“STUDY ON IMPACT OF AUXIN ON THE GROWTH AND THE
SYNTHEIS ALKALOID IN Catharanthus roseus IN VITRO”
The effect of different growth regulator on growth and production of indol
alkaloid were studied in Catharanthus roseus. Shoots were grown in MS solid
medium containing different concentrations of growth regulators. Extracted
alkaloids were qualitative with Wagner reagent and analyzed by CE for
determination of indol alkaloid quantities. The growth regulators on the experiment
were NAA, IAA and the data were viewed for 7, 14, 21, 28, 35 days.
The experiment result showed that NAA at concentration of 0,5 mg/l and
IAA 1 mg/l resulted in elongation of roots and higher number of roots. The
qualitative results of all in vitro plants have appeared precipitates which the 28 - day
plant sample on the medium containing NAA 0,5 mg/l had the most. Analyses by
CE showed that the concentration of indol alkaloid (catharanthine and vindoline) in
the in vitro plant is more than in vivo plant, and these plants produce the highest
catharanthine after 28 days and vindoline after 7 days cultured in MS medium
adding NAA 0,5 mg/l.



vii
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG

Trang tựa ............................................................................................................. i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt ................................................................................................................. iv
Summary .............................................................................................................. vi
Mục lục ................................................................................................................. vii
Danh sách các bảng ............................................................................................. xi
Danh sách các hình và sơ đồ............................................................................... xiii
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. xv
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây ....................................................................... 3
2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp ......................................................... 3
2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ..................................................................... 4
2.2. Alkaloid ......................................................................................................... 4
2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus ............ 7
2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa ......................................................... 7
2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa ................... 8
2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa .......................................... 9
2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................. 13
2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa............................................... 13
2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh .............. 14
2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp ............................. 15
2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 15



viii

2.4.2. Nguồn đạm .................................................................................................. 16
2.4.3. Nguồn cacbon .............................................................................................. 16
2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen .............................................................. 16
2.4.5. Các chất khác .............................................................................................. 16
2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid ........................................................ 17
2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất ...................................................................... 17
2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ .............................................. 17
2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước ..................... 18
2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid ............................ 18
2.6.1. Phản ứng tạo tủa .......................................................................................... 19
2.6.2. Phản ứng tạo màu ........................................................................................ 19
2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid....................................................... 20
2.7.1. Phương pháp cân ......................................................................................... 20
2.7.2. Phương pháp trung hòa .............................................................................. 20
2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan ............................................... 21
2.7.4. Phương pháp so màu ................................................................................... 21
2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại .......................................... 22
2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp ..................................................................... 22
2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản ...................................................................... 22
2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp ............... 23
2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao .................................................. 24
2.8.2. Xử lý với Elicitor ........................................................................................ 24
2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học .............................................. 24
2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất .................................................................................. 24
2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học ................................................................................. 25
CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26

ix
3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự
sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro ................................................. 26
3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 26
3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 26
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 26
3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ............................................................... 26
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 27
3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ......................... 27
3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA
đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .......................................... 27
3.3.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 29
3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng
xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA .......................................................... 29
3.4.1. Vật liệu ....................................................................................................... 29
3.4.1.1. Mẫu kiểm tra ............................................................................................ 29
3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 29
3.4.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 30
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây
Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ................................................ 30
3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây
Trường xuân hoa .................................................................................................. 31
3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây
Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo ................................... 31
3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây
Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE ......................................... 32

3.4.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 32
3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa ................................ 32



x
3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa ........................................ 32
3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE ................................ 34
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 35
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 56
5.1. Kết luận ......................................................................................................... 56
5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 58
PHỤ LỤC





xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây .................. 13
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 27
Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh
trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .............................................................. 28
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 28
Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35

ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l..................................... 35
Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36
Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 37
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 38
Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa
in vitro bằng thuốc thử Wagner ............................................................................ 41
Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 43
Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 46
Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và
mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE ................................... 50

N2
N3
N1
I2



xii
Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE .................. 53
Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy ........................................... 54

xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid .................... 7
Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa ............................................................................................ 7
Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa ........................................................................... 8
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine ................................................... 10
Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline .......................................................... 10
Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine ................................. 11
Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây
Trường xuân hoa từ tiền chất ................................................................................ 12
Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung
NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy ....................................... 39
Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây
Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày .............................................. 42
Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường
xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ..................................... 42
Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân
lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ............................. 44
Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá
của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .................................. 45
Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ........................................................ 46
Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .......................................................... 47
Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l ............................ 48

Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo tươi ................................................................................ 49
Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo khô ................................................................................ 50



xiv
Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây
Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. ................................................................... 52
Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây
Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi ..................................................................... 52
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi ................................ 33
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô ................................ 34
Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích
cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 ......................................................... 51
Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa
cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo ......................................................... 53




xv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TDC : Tryptophan decarboxylase
STR : Strictosidine synthase
TIA : Terpenoid indole alkaloid
EOF : electroosmosis flow
CE : Capillary electrophoresis

HPLC : High – performance liquid chromatography
DNA : Deoxy nucleic acid
MS : Murashiga & Skoog
IAA : Indole-3-acetic acid
NAA : 1-Naphthalene acetic acid
BA : Benzyladenine
CRD : Completely Randomized Design


















1
Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Thực vật bậc cao được coi là nguồn nguyên liệu quý giá để cung cấp các
hợp chất thứ cấp đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan trọng
đối với ngành công nghiệp dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có
giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Hiện nay,
trên toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang phải sống chung với căn bệnh này và
mỗi năm có thêm khoảng 11 triệu trường hợp mắc bệnh mới. Trong khi đó các loại
thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hướng của
thế giới hiện nay là nghiên cứu nhằm tìm phương pháp gia tăng lượng alkaloid ở
các cây thảo dược để làm hạ giá thành của thuốc.
Cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) là một trong các loại thực vật
có khả năng sản xuất các indol alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo
thuốc chống ung thư như vinblastine và vincristine. Nhưng các chất này lại có hàm
lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật và không thể tổng hợp được bằng con đường
hóa học, do có cấu trúc phức tạp. Vì vậy, phương pháp bán tổng hợp vinblastine từ
sự kết hợp tiền chất vindoline với catharanthine là hết sức hữu hiệu, vì vindoline là
một nguồn dồi dào trong cây Trường xuân hoa và catharanthine có thể đạt nồng độ
cao trong cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô. Điều này có thể thực hiện được thông
qua việc sử dụng các tác nhân kích thích như nấm và chất hóa học. Hiện nay, việc
sản xuất catharanthine nhờ nuôi cấy mô vẫn còn quá thấp để tiến tới sản xuất công
nghiệp. Bên cạnh đó, các alkaloid chỉ được tổng hợp trong những loại tế bào đặc
trưng và vào những giai đoạn phát triển đặc biệt, điều này làm cho việc chiết xuất
chúng gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn lọc các phương pháp và thời gian nuôi
cấy hiệu quả là một trong những con đường quan trọng và thiết thực để gia tăng sức
sản xuất các tiền chất như catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro.



2
Chính vì tầm quan trọng của các indol alkaloid trong việc điều trị bệnh và tính cấp
thiết của việc gia tăng các hợp chất thứ cấp có giá trị này nên chúng tôi thực hiện đề tài

“Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp
alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro” nhằm kích
thích khả năng sản xuất các indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro nhờ
chất kích thích sinh trưởng (IAA. NAA).
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định giai đoạn nuôi cấy mô cây Trường xuân hoa sinh tổng hợp nhiều
alkaloid nhất, từ đó chọn quy trình nuôi cấy cây Trường xuân hoa có khả năng sản
xuất được nhiều catharanthine và vindoline thông qua việc sử dụng chất kích thích
sinh trưởng IAA (indole - 3 - acetic acid) hay NAA (1- Naphthalene acetic acid).
1.3. Yêu cầu
- Tạo được cây Trường xuân hoa in vitro có hàm lượng alkaloid cao .
- Định tính sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa bằng thốc thử Wagner.
- Phân tích định lượng được lượng alkaloid trong từng giai đoạn nuôi cấy mô bằng
hệ thống điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE).



3
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây [7, 9]
Sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển luôn tiến hành quá trình
trao đổi chất, kết quả là tạo nên các sản phẩm của trao đổi chất. Trong thực vật các
sản phẩm này được chia làm hai nhóm:
- Chất trao đổi bậc một hay hợp chất sơ cấp: là các chất cơ bản cần cho sự
sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng, bao gồm các hydrat cacbon, lipit và
acid amin. Đó là những thành phần không thể thiếu trong cây.
- Chất trao đổi bậc hai hay hợp chất thứ cấp: là những hợp chất đặc trưng cho
loài cây trồng và chúng đóng vai trò quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực

vật. Các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ
cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật [7].
2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp không có chức năng rõ ràng như các hợp chất sơ cấp nhưng
thường có vai trò sinh thái học: góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho
quá trình thụ phấn của cây, giúp cho cây thích nghi được với những điều kiện khắc
nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng, các loại vi sinh vật
và những động vật ăn mồi khác, như là cỏ ba lá hay cỏ đinh lăng có tác dụng như
estrogen làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của động vật ăn cỏ [17]. Thậm chí là
chúng còn ức chế sự phát triển của các thực vật khác bởi vì nhiều hợp chất thứ cấp
có độc tính đối với thực vật. Vì vậy so với các chất sơ cấp, hợp chất thứ cấp được
xem là nguồn nguyên liệu đặc biệt quý giá từ thực vật [14].
Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau: chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị và màu sắc cho các
món ăn, đặc biệt hiện nay vấn đề sức khỏe rất được quan tâm do đó ngày càng nhiều
các chất có nguồn gốc tự nhiên đang có xu hướng thay thế các chất tổng hợp làm



4
phụ gia trong thực phẩm. Bên cạnh đó các tinh dầu thơm của thực vật còn tham gia
vào thành phần quan trọng của nước hoa. Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong
lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật
có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virút…, vì có nguồn gốc từ tự nhiên
nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái. Bởi vì
có hoạt tính sinh học dồi dào, nên các hợp chất thứ cấp từ lâu đã được sử dụng làm
thuốc trong y học cổ truyền, và ngày nay chúng vẫn là nguồn nguyên liệu có giá trị
trong bào chế dược phẩm. Một số chất thứ cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc
có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để bào chế thuốc chống ung thư,
hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin, quinidin được dùng làm thuốc

chữa loạn nhịp tim…
Hiện nay trên thế giới nhiều loại thuốc tổng hợp đã được sử dụng nhưng
chúng vẫn không thay thế được các loại thuốc có nguồn gốc từ thực vật. Vì có một
số hoạt chất thứ cấp chưa tổng hợp được bằng con đường hóa học hoặc nếu tổng
hợp được thì giá thành của các loại thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn mà tác
dụng lại không bằng các chất chiết xuất từ cây. Ví dụ như ajmalin, morphin,
scopolamin, quinin, strychmin…. [5]
2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp
Các hợp chất thứ cấp ở thực vật được phân loại theo con đường sinh tổng
hợp của chúng. Gồm có ba nhóm chủ yếu: phenolic, terpene và steroid, alkaloid.
Phenolic là nhóm hợp chất phổ biến ở thực vật bậc cao vì những phân tử này liên
quan đến quá trình tổng hợp lignin, còn các hợp chất khác như alkaloid thì phân bố
rải rác, nó đặc trưng cho giống, loài thực vật [17].
2.2. Alkaloid [27]
Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh
học rất đa dạng
* Đặc điểm chung: Trên 10.000 loại alkaloid đã được biết, khoảng 10 – 15 %
alkaloid ở trong mạch nhựa cây có hoa, loại hai lá mầm nhưng đôi khi cũng được
tìm thấy ở nấm, sinh vật biển, ở một số loài động vật và côn trùng…



5
* Thuật ngữ: Alkaloid thường có tên tận cùng bằng “ine”. Chúng được đặt tên theo
một phần tên La tinh của loài sinh vật tạo ra nó. Ví dụ atropine từ Atropa
belladonna (cây cà dược). Một vài hợp chất được đặt tên dựa trên hoạt tính sinh học
của chúng ví dụ như emetine (thuốc gây nôn - emetic).
* Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn và độ nóng
chảy cao. Tuy nhiên một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở
dạng lỏng như nicotine hay có màu như berberine.

* Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi
hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong
nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Ở pH thấp alkaloid sẽ
thêm vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ.
Tính tan của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây,
trong phân tích các loại alkaloid, và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng
thuốc phù hợp.
* Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện tử.
Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính
acid yếu. Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối.
Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng:
alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa
với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff (potassium bismuth iodide
solution).
Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền; tuy vậy, một số hợp chất thuộc
loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác nhân
oxi hóa [27].
* Phân loại: do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng
được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi các alkaloid được
chia thành 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (pseudoalkaloid).
Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ,
thường chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ



6
amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối
của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicine, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các
alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của
chúng (ornithine, lysin, phenilalanine, tryptophan, histidine, acid antranilic…) hơn

là theo vòng dị hoàn.
Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả
mescaline và N,N - dimetiltryptamine. Chúng là những amin đơn giản, được tổng
hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn.
Các giả - alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid.
Bao gồm hai hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (như conesine)
và purine (cafeine) [8].
Vài họ thực vật rất giàu alkaloid, ví dụ như họ Apocynaceae Lindl., Juss. Họ
này phân bố trên toàn thế giới đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong
số đó các terpenoid indol alkaloid nổi lên với vai trò là các chất có hoạt tính sinh
học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học.
Terpenoid indole alkaloid (TIA) bao gồm hơn 3000 hợp chất trong đó có các
chất chống ung thư như vinblastine, vincristine từ loài Catharanthus roseus và
Vinca spp., camptothecin từ Camptotheca acuminata, chống sốt rét như quinine từ
Cinchona officinalis [15].
Xét về vai trò sinh thái học các terpenoid indole alkaloid đóng vai trò quan
trọng trong cơ chế bảo vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh. Trường hợp các
chất indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa là một ví dụ: năm 1989,
Chockalingam và các cộng sự tìm thấy cao chiết Trường xuân hoa có hoạt tính
chống lại sự ăn của ấu trùng Spodoptera. Theo Frischknecht (1987) sau khi gây vết
thương vừa phải trên cây Trường xuân hoa, thì có sự gia tăng tổng hợp các alkaloid
này như một cơ chế phòng vệ. Ngoài ra các alkaloid từ cây Trường xuân hoa còn có
khả năng chống lại các loài vi sinh vật, ví dụ như ajmalicine, catharanthine và
vindoline được tạo ra để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (Hemandez,
1979) [16]. Hiện nay ngƣời ta đang dựa trên những đặc tính này của thực vật



7
Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa

để tìm ra phƣơng thức tăng cƣờng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp.
TIA gồm có hai thành phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một
nhóm terpenoid có nguồn gốc từ iridoid glucoside secologanin [10].

















Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid với sự tham gia
của các enzym TDC: tryptophan decarboxylase, STR: strictosidine synthase [32].
2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus
2.3.1. Nguồn gốc của cây Trƣờng xuân hoa [23, 33]
Nguồn gốc phân loại [33]
Giới : Thực vật
Giới phụ : Tracheobionta
Ngành : Magnoliophyta
Ngành phụ : Spermatophyta
Lớp : Magnoliopsida

Lớp phụ : Asteridae
Bộ : Gentianales
Họ : Apocynaceae
Tên khoa học : Catharanthus roseus



8
Tên thông thường: Bông dừa, hoa hải đằng, phjắc pót đông (Tày), dừa cạn,
trường xuân hoa, Madagascar periwinkle…
Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagasca, cây Trường xuân hoa
được du nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó
có Việt nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào đầu khoảng giữa thế kỷ 18, Trường
xuân hoa được trồng ở Paris, sau đó có mặt tại nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu.
2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trƣờng xuân hoa [23]
Cây Trường xuân hoa là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân
nhiều cành. Thân mọc thẳng, hình trụ nhẵn, màu xanh lục nhạt hay nâu đỏ. Lá mọc
đối, hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 – 3 cm, hai
mặt nhẳn, mặt trên sẩm bóng, mặt dưới nhạt (Hình 2.3).
Hoa màu hồng hoặc trắng (trắng hiếm hơn). Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần
ngọn, dài 5 thùy, hình ống ngắn, tràng có 5 cánh, ống tràng hẹp phình ra ở dưới các
cánh hoa, nhị 5 đính vào họng của ống tràng (Hình 2.2). Quả dài 2,5 – 3 cm, mọc
thẳng hơi choãi ra, hạt nhỏ, hình trứng màu nâu nhạt hoặc nâu đen. Mùa hoa quả,
tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10.

Ở Việt Nam, Trường xuân hoa là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên
tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển,
Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa




9
tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng
Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển,
Trường xuân hoa có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao,
trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát
ven biển. Trường xuân hoa còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm
thuốc. Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình,
Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa.
Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Môi trường ven biển cũng là nơi
mọc tập trung của Trường xuân hoa ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin,
Malaysia, Thái Lan. Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây
bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1.500m. Trường xuân hoa là loại cây ưa
sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt (ở Hà Nội -
vườn hoa, nông trường Đồng Gia - Ninh Bình, 1972) và ở Tuy Hòa hiện nay. Cây
sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây
mọc từ thiên nhiên. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả sau
4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe.
Nguồn Trường xuân hoa mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm
1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần
đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng
chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [23].

2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trƣờng xuân hoa [22]
Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, Trường xuân hoa có chứa một số
alkaloid có tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana
Benth). Ngoài ra còn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin
và hoạt chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol
có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở lá. Năm 1958,
Noble và cộng sự đã chiết được một alkaloid từ lá Trường xuân hoa
vincaleucoblastine (còn gọi là Vinblastine) [29]. Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự
cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristine) [30].



10
Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline

Hàm lượng các alkaloid này trong Trường xuân hoa rất nhỏ khoảng 1 phần vạn
trong lá Trường xuân hoa khô đối với Vinblastine còn đối với vincristine thì ít hơn
10 lần nữa.
Tùy theo nơi thu hái hàm lượng các alkaloid này thay đổi từ 0,2% đến 1% và
khi dùng cũng dùng với liều rất thấp.
Căn cứ vào cấu tạo hóa học người ta chia alkaloid trong cây Trường xuân
hoa làm ba nhóm chính:
Nhóm alkaloid có nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine,
cavicine, ajmalicine…

Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine

Nhóm alkaloid có nhân indoline: lochnericine, lochneridin, lochrovine,
vindoline, ajmaline …

Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline
như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng
chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005% - 0,015%
trong lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá.