Quy trình tinh sạch protein huỳnh quang (GFP)

QUY TRÌNH TINH
CHẾ PROTEIN GFP
Bộ mơn: Quy trình thiết bị CNSH
GVBM: PhD. Trần Thái Hà
Tên: Võ Lê Thanh Thuý

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2021


Giới thiệu
+ Quá trình tinh chế giúp thu được protein mục tiêu trong canh trường sinh học. Trong quá trình
tinh chế GFP sẽ sử dụng nhiều loại sắc ký cột (sắc ký trao đổi ion & sắc ký tương tác kỵ
nước).
+ Cột (colum) là một hình trụ chứa đầy gốm thủy tinh hoặc các hạt cao phân tử được thiết kế để
tương tác hoặc liên kết với các phân tử dựa trên một hoặc nhiều tính chất vật lý sắc ký dựa
trên sự khác biệt mỗi phân tử có một tập hợp các đặc tính vật lý riêng biệt như: kích thước,
điện tích hoặc mức độ tương tác.
+ Quy trình protein huỳnh quang xanh (GFP) là quy trình khá điển hình của quy trình sản xuất
dược phẩm sinh học: Lysate được sàn lọc sẽ được lọc trước và chuyển qua Sắc ký trao đổi
ion. 


Chuẩn bị quy trình
+Yêu cầu: * Kiểm tra hệ thống trượt sắc ký, TFF, các ống xử lý được gắn và kiểm tra rò rỉ.

* Sử dụng đúng loại nhựa (resin) và được đóng gói đúng cách.
* Đường dẫn khơng được có khơng khí bên trong.
+Ngun liệu: lysate được sàn lọc từ quá trình Phục hồi, dung dịch đệm (Amoni Sulfate – hàm lượng
muối cao).
+Ghi chép Bản ghi riêng biệt cho mỗi hoạt động xử lí – tài liệu hướng dẫn vận hành quy trình từng
bước.

+Bản ghi Batch bao gồm các khoảng trống để ghi lại thời gian, hoạt động, các bước vận hành và kết
quả đọc thiết bị.
+Khử trùng khu vực thí nghiệm, thiết bị và loại bỏ những thứ khơng cần thiết theo u cầu của Quy
trình vận hành tiêu chuẩn.


QUY TRÌNH TINH CHẾ
Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography)

Rửa giải (elution)
Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC - Hydrophobic Interaction
Chromatography)
Lọc tiếp tuyến (TFF - Tangential-Flow Filtration)


1. Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange
chromatography)
+ Tại giai đoạn này, lysate có độ pH=8, nghĩa là protein GFP mang điện tích âm. Do đó
GFP sẽ liên kết với anion tích điện dương.

Trao đổi ion giữa lysate (+) và GFP (-)


+ Sau đó,máy bơm hút lysate từ bình đi qua cảm biến độ dẫn đầu tiên và cảm biến áp suất
và chuyển đến bộ lọc sơ bộ 0,45 micron.

Lọc sơ bộ 0,45 micron - giúp loại bỏ tất cả mảnh vụn của tế bào cịn sót lại hoặc các hạt khác có thể
làm ơ nhiễm dung dịch. Nếu bộ lọc sơ bộ bắt đầu bị tắt thì cảm biến áp suất (b) ở đầu vào của bộ lọc
sẽ ghi nhận áp suất tăng lên và bộ điều khiển sẽ báo hiệu cần thay bộ lọc.

Bộ cảm biến độ dẫn

Cảm biến áp suất

Lọc sơ bộ 0,45 micron


+Tiếp theo, lysate đi qua thông qua đồng hồ đo lưu lượng và cảm biến khơng khí.
+Sau đó, lypast đi qua các hạt nhựa (resin beads), protein tích điện âm liên kết
với các hạt mang điện tích dương.

Đồng hồ đo lưu lượng

Cảm biến khơng khí (air sensor)

Resin beads


+ Dung dịch ra khỏi cột sẽ đi qua cảm biến mật độ quang UV, cảm biến độ dẫn điện và
cảm biến pH. Các chỉ số thấp của cảm biến quang học UV xác nhận rằng GFP khơng
có trong dung dịch vì vậy van đầu ra sẽ đưa dung dịch đi thải.


2. Rửa giải - Elution
(Khi tất cả các lysate đã vào cột hoặc khả năng liên kết protein của các hạt đã đạt đến mức nhất định thì chuyển sang giai đoạn rửa giải)

Rửa giải là sự giải phóng protein huỳnh quang (GFP) khỏi các hạt bằng cách sử dụng dung
dịch đệm NaCl.
Dung dịch đệm bơm vào  giúp giải phóng GFP khỏi điện tích (+)  thu được sản phẩm (dịch rửa giải).

Dịch rửa giải chuyển đến bình thu gom

+ Cảm biến mật độ quang UV đo nồng độ
protein cho biết thời điểm sản phẩm bắt đầu
rửa giải khỏi cột. Tại thời điểm này, các van
đầu ra được chuyển đổi để cho phép dịng
chảy của dịch rửa giải chuyển đến một bình
thu gom.
+ Khi cảm biến UV đã chỉ ra rằng tất cả GFP đã
thoát ra khỏi nhựa sắc ký, các van đầu ra sẽ
được chuyển thành chất thải.

Chất thải đi ra khỏi van


3. Sắc ký tương
tác kỵ nước HIC
+ Sắc ký tương tác kỵ nước dựa trên nguyên
tắc là các chất hoá kỵ nước trên bề mặt nhựa
(resin) sẽ liên kết với các mảng kỵ nước trên
protein GFP. 
+ Nhựa và protein rửa giải trong mơi trường có
nồng độ muối amoni sunfat cao để loại bỏ lớp
chắn nước.
+ Sau đó, giảm nồng độ muối xuống để tách
GFP khỏi cột HIC  thu được dịch rửa giàu
protein.
* Dịch rửa giải giàu protein nhưng loãng và nhiều
muối nên cần lọc dòng tiếp tuyến TFF.

4. Lọc dòng tiếp tuyến – TFF
(Tangential-Flow Filtration)
+ Lọc dòng tiếp tuyến (TFF) để tập trung và lọc dòng sản phẩm GFP.

Dòng di chuyển dung dịch trong TFF:
Bể cung cấp (supply tank)  máy bơm (pump)  cảm biến áp suất (pressure sensor)  màng lọc (filter
membrane). 


+ Tất cả mọi thứ được đi qua màng, bao gồm cả dung dịch đệm - được gọi là chất thấm
(permeate) và bị thải ra ngoài. Protein GFP lớn hơn các lỗ xốp của màng nên được giữ
lại, vật liệu được giữ lại (retentate) được tuần hoàn lại vào bể cung cấp.

Quy trình được lặp lại tuần hồn cho đến khi đạt được nồng độ GFP mong muốn. Đồng thời dung
dịch đệm được cho thêm vào để làm thức ăn, giúp protein được rửa sạch và thay thế cho dung dịch
đệm ban đầu khi bước lọc này tiếp tục - giúp loại bỏ hiệu quả mọi muối còn lại.


+ Khi q trình hồn tất, dung dịch GFP được
chuyển qua bộ lọc cuối cùng 0,22 micron.

+ Quá trình lọc hồn tất, GFP cơ đặc
được chuyển đi đổ đầy và đem đi
đơng khơ, đóng gói.

+ Sau đó được thu thập trong các vật
chứa thích hợp, thường là chai hoặc túi.

The end.