Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR part 4 pptx

31












Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR

Có 3 loại primer chính thường dùng trong giai đoạn tổng hợp cDNA
*

Primer là các oligo T
Tất cả các loại mRNA đều có đuôi poly A ở đầu 3' nên với primer là một
đoạn oligo T (ví dụ: TTTTTT) thì nó sẽ bắt cặp với sợi mRNA ở đoạn poly A và
phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài ứng với toàn bộ sợi mRNA khuôn.
Phương pháp này rất thuận lợi cho những nghiên cứu tổng quát về mRNA.
*

Primer random hexamer
Là những đoạn oligo nucleotide gồm 6 nucleotide với trình tự ngẫu nhiên.
Chúng bám lên nhiều điểm khác nhau dọc theo suốt sợi mRNA và tổng hợp nên
những đoạn cDNA ngắn phủ khắp sợi mRNA khuôn mẫu. Random hexamer thích
hợp cho những sợi mRNA đích quá dài hoặc có nhiều cấu trúc thứ cấp gây cản trở

cho oligo T hoạt động hiệu quả.

32
*

Primer chuyên biệt
Primer được thiết kế với một trình tự chuyên biệt cho một đoạn trình tự nhất
định trên sợi mRNA. Primer sẽ bắt cặp ở trước đầu 3' của đoạn gene mong muốn và
phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài từ điểm bắt cặp kéo dài đến hết sợi
mRNA khuôn. Do primer chỉ bắt cặp tại một điểm chuyên biệt nên cDNA tạo ra sẽ
chứa đoạn trình tự mong muốn với xác suất rất cao, vì vậy, loại primer này đặc biệt
hữu hiệu trong việc khuếch đại các mRNA có số lượng bản sao thấp. (O'Connell J.,
2002).
Phản ứng RT-PCR có thể được thực hiện theo 2 bước (two steps) hay diễn ra
liên tục (one step).
*

Phản ứng qua 2 bước
Trước tiên, thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với mRNA khuôn, primer và
enzyme reverse transcriptase trong khoảng 45 phút ở 42 - 45
o
C (là nhiệt độ thích
hợp cho hoạt động của enzyme reverse transcriptase). Sau đó, bổ sung primer cho
PCR, Taq - polymerase để thực hiện tiếp phản ứng khuếch đại. Phương pháp này
thường được sử dụng với các primer tổng hợp cDNA là oligo T hay hexamer, giúp
người thực hiện có thể khống chế được từng qui trình. Tuy nhiên dễ xảy ra nhiễm
các DNA lạ khi bổ sung hóa chất giữa 2 giai đoạn.
*

Phản ứng liên tục

Cho tất cả các yếu tố cần thiết cho cả phản ứng tổng hợp cDNA và phản ứng
khuếch đại vào một lần rồi thực hiện cả 2 qui trình liên tục. Phương pháp này
thường được thực hiện với các primer được thiết kế chuyên biệt chung cho cả phản
ứng tạo cDNA lẫn phản ứng khuếch đại và ít gây nhiễm DNA lạ trong quá trình thao
tác.





33
2.10

Kỹ thuật giải trình tự DNA (Sequencing)
Để xác định trình tự của một đoạn DNA mong muốn, phương pháp Sanger là
phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay. Phương pháp này dựa trên nguyên
tắc: thực hiện sự tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi cần xác định trình tự (thực hiện
phản ứng PCR), nhưng ngoài 4 loại dNTP thông thường còn bổ sung thêm các
dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP). Các ddNTP này không có nhóm -OH ở
đầu 3' nên khi chúng gia nhập vào chuỗi sẽ làm cho sự kéo dài chuỗi bị dừng lại (do
không thể tạo được liên kết giữa nhóm -OH 3' của nucleotide trước với nhóm
phosphate 5' của nucleotide sau).
Sự gia nhập của các ddNTP vào chuỗi là hoàn toàn ngẫu nhiên nên phản ứng
kéo dài sẽ ngừng lại ở một vị trí bất kỳ. Do đó, nếu cung cấp một lượng DNA mẫu
đủ lớn thì các phản ứng tổng hợp sẽ cho hàng loạt các sản phẩm có độ dài tăng dần:
1, 2, 3, 4… nucleotide. Như vậy, chỉ cần biết được ở mỗi đoạn kết thúc bằng loại
ddNTP nào thì sẽ có thể tìm ra được trình tự của đoạn DNA mong muốn. Để làm
được điều đó, người ta thực hiện 4 phản ứng PCR cho mẫu DNA muốn giải trình tự
cùng lúc, ở mỗi phản ứng chỉ cho thêm một loại ddNTP (A, T, G hoặc C). Sau phản
ứng, kết quả điện di sản phẩm của cả 4 trên cùng một gel acrylamide sẽ giúp xác

định được trình tự của đoạn DNA (Bùi Trang Việt, 2002).
Hiện nay, với các thế hệ máy đọc trình tự mới, các ddNTP được gắn thêm các
chất phát màu huỳnh quang, mỗi loại ddNTP gắn với 1 màu khác nhau thay vì gắn
với đồng vị phóng xạ như phương pháp kinh điển. Kết thúc phản ứng, các đoạn
DNA sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản (capillary
electrophoresis). Cuối cùng, từ kết quả điện di, máy sẽ đọc các màu huỳnh quang
phát ra trên capillary và phân tích với các phần mềm chuyên dụng để cho ra trình tự
các nucleotide của đoạn DNA quan tâm.





34
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


3.1


Vật liệu nghiên cứu
3.1.1

Mẫu
Mẫu nghiên cứu gồm chồi giống thương phẩm và các mẫu lá bệnh được lấy
ngẫu nhiên từ 3 giống dứa Cayenne:
-

Giống Thái Lan và giống Lâm Đồng do nông trường Phạm Văn Hai cung cấp.
-

Giống Trung Quốc do nông trường Thọ Vực cung cấp.








Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm

3.1.2

Dụng cụ và thiết bị
-

Máy ly tâm Mikro 22R
-

Máy vortex
-

Máy luân nhiệt iCycle (BioRad)
-

Bộ nguồn và bồn điện di (BioRad)
-

Bình đựng Nitơ lỏng

-

Pipetman, đầu tube và eppendorf các loại.


35
3.1.3

Hóa chất
3.1.3.1

Hóa chất dùng cho tách chiết RNA
Sử dụng kit ly trích Aurum
TM
Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio
Rad cung cấp:
-

Lysis solution.
-

Low stringency wash solution (X5).
-

High stringency wash solution.
-

DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trước khi sử dụng).
-

DNase dilution solution.
-

Elution solution.

Ngoài ra, còn có các hóa chất khác cần cung cấp riêng:
-

β- mercaptoethanol, 14.2 M.
-

Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP), 2%.
-

Ethanol 100% và 70%.
-

Tris-base (pH 7.5, 10 mM).
-

Nitơ lỏng.
-

NaOH 0.1M.
-

EDTA 1mM.
-

DEPC (Diethyl pyrocarbonate).

3.1.3.2

Hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR
-

Primer cho phản ứng RT-PCR:
Primer 225: 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3'
Primer 226: 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3'
(Theo thiết kế của Sether D.M và ctv, 2001)
Cặp primer này sẽ khuếch đại từ vị trí nucleotide thứ 118 đến nucleotide 707
trên gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 cho ra sản phẩm có kích thước 589bp.

36
118 707
Đoạn khuếch đại
589bp
Gene mã hóa
HSP70

Primer 226 Primer 225
5’
3’






Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của

PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226.

Các hóa chất khác thuộc bộ kit Access RT-PCR System (Promega) gồm:
-

AMV /
Tfl
Buffer (5X)
-

dNTP (10mM)
-

MgSO
4
(25 mM)
-

Enzyme reverse transcriptase AMV (5 Unit/
µ
l)
-

Enzyme Taq polymerase
Tfl
(5 Unit/
µ
l)

3.1.3.3

Hóa chất dùng cho điện di DNA
-

Agarose (BioRad).
-

Ethidium bromide.
-

Loading dye 6X (Promega).
-

Nước cất 2 lần.
-

Dung dịch TAE 1X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8).
-

Thang DNA (100bp DNA ladder – Promega).





37

Hình 3.3: Thang DNA

3.1.3.4

Hóa chất dùng cho điện di RNA
-

MOPS buffer 5X (MOPS 10 mM, sodium acetat 2,5 mM, EDTA 0,5 mM,
pH 7,0).
-

Formaldehyde 37%.
-

Formamide.
-

Nước cất khử ion, khử RNase.
-

Dung dịch đặt mẫu biến tính (loading dye biến tính).

3.2

Phương pháp nghiên cứu
3.2.1

Tách chiết RNA
Mẫu chồi dứa được lột hết các lá ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong cắt thành
từng mảnh nhỏ (<5mm), nghiền thành bột mịn trong Nitơ lỏng rồi đem ly trích RNA
với bộ kit Aurum Total RNA Mini Kit theo các bước:
1.

Cho 60 mg mẫu vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy. Hòa tan mẫu bằngvới
700
µ
l dung dịch ly giải (lysis solution).
2.

Ly tâm dịch ly giải ở 14 000 vòng trong 3 phút, chuyển dịch nổi vào tube
ly tâm 2 ml mới.
1500 bp
1000 bp
500 bp
100 bp

38
3.

Thêm 700
µ
l ethanol 70% vào mỗi tube, hòa tan bằng pipet cho đến khi

dung dịch không còn phân lớp.
4.

Ủ ấm dịch hòa tan trong water bath 70
0
C (chuẩn bị cho bước 12). Đặt
RNA binding column vào tube ly tâm 2 ml không nắp.
5.

Cho 700
µ
l dung dịch ở bước 3 vào RNA binding column, ly tâm 60 giây,
loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho hết phần dịch còn lại.
6.

Cho 700
µ
l dịch rửa low stringency vào RNA binding column, ly tâm 30
giây, loại bỏ dịch lọc.
7.

Trộn 5
µ
l DNase với 75
µ
l dung dịch DNase delution (trong tube 1.5 ml),
cho vào RNA binding column. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm
30 giây, loại bỏ dịch lọc.
8.

Cho 700
µ
l dung dịch high stringency vào RNA binding column, ly tâm
30 giây, loại bỏ dịch lọc
9.

Thực hiện tương tự bước 12 với dung dịch low stringency
10.

Ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
11.

Chuyển RNA binding column vào tube 1.5 ml có nắp đậy, cho 80
µ
l dịch
hòa tan (elution solution) đã ủ ở 70
o
C ở bước 5 vào, ủ 1 phút, ly tâm 2
phút để thu RNA tổng số. Dung dịch RNA được bảo quản ở 4
0
C.

3.2.2

Điện di sản phẩm ly trích RNA
Nấu 16 ml gel 1,8%, chờ nguội đến khoảng 65
o
C, cho thêm 4 ml MOPS 5X và
400 µl formaldehyde. Khi gel nguội, ngâm trong dung dịch MOPS 1X khoảng 30 phút
trước khi điện di.

Mẫu sản phẩm RNA trước khi điện di được làm biến tính ở 65
o
C trong 30 phút
rồi làm lạnh nhanh trong nước đá khoảng 1 phút. Sau đó, trộn với dung dịch nạp mẫu
biến tính rồi đem điện di ở 30V trong 150 phút.
Sản phẩm điện di được quan sát dưới đèn cực tím.



39
3.2.3

Xây dựng quy trình RT-PCR
3.2.3.1

Kiểm tra độ đặc hiệu của primer
Trước khi được dùng làm mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phát hiện
PMWaV-1, cặp primer 225, 226 được kiểm tra các cấu trúc thứ cấp bằng
phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT
( />) và được
kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI
( />).
3.2.3.2

Xác định chu trình nhiệt tối ưu
Quy trình RT-PCR được thực hiện theo theo kiểu one step. Primer 226 sẽ
thực hiện phản ứng reverse với tác động của enzyme reverse transcriptase, tổng hợp
sợi cDNA từ RNA của PMWaV-1. Sau đó dưới tác động của Taq – polymerase, cả
hai primer 225 và 226 sẽ hoạt động, khuếch đại các cDNA vừa tạo. Với nguyên tắc
trên, phản ứng RT-PCR tối ưu sẽ được khảo sát dựa trên 5 chu trình sau

Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát
Chu trình nhiệt

Giai đoạn

1 2 3 4 5
Tạo cDNA 45
o
C/45’
94
o
C/2’
45
o
C/45’
94
o
C/2’
45
o
C/45’
94
o
C/2’
45
o
C/45’
94
o
C/2’

45
o
C/45’
94
o
C/2’
Khuếch đại
cDNA

92
o
C/30’’
52
o
C/1’
68
o
C/1’30’’
(
45 chu kỳ
)
92
o
C/30’’
54
o
C/1’
68
o
C/1’30’’

(
45 chu kỳ
)
92
o
C/30’’
56
o
C/1’
68
o
C/1’30’’
(
45 chu kỳ
)

92
o
C/30’’
58
o
C/1’
68
o
C/1’30’’
(
45 chu kỳ
)
92
o

C/30’’
58
o
C/1’
68
o
C/1’30’’
(
10 chu kỳ
)
92
o
C/30’’
54
o
C/1’
68
o
C/1’30’’
(
35 chu kỳ
)
Kéo dài 68
o
C/8’ 68
o
C/8’ 68
o
C/8’ 68
o

C/8’ 68
o
C/8’
Trong đó chu trình 2 được thực hiện theo Sether (2001), các chu trình 1, 3, 4
chỉ thay đổi nhiệt độ bắt cặp ở giai đoạn khuếch đại cDNA của chu trình 2.

40
3.2.3.3

Xác định nồng độ primer thích hợp
Hỗn hợp hóa chất cần thiết cho một sản phẩm PCR (50
µ
l) được pha như sau:

Hóa chất

Thể tích

Nồng độ cuối

AMV /
Tfl
Buffer (5X) 10
µ
l 1X
dNTP (10mM) 1
µ
l 0.2 mM
MgSO4 (25 mM) 2
µ

l 1 mM
Enzyme reverse AMV (5 Unit/
µ
l) 1
µ
l 0.1 Unit/
µ
l
Enzyme Taq polymerase
Tfl
(5 Unit/
µ
l) 1
µ
l 0.1 Unit/
µ
l
Primer 225 (25 mM)
Primer 226 (25 mM)
RNA khuôn mẫu 2
µ
l
Nước cất 2 lần 29
µ
l

Trong đó, nồng độ primer cho phản ứng được khảo sát ở 3 mức nồng độ cuối
là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM.

3.2.3.4

Xác định số chu kỳ phản ứng tối ưu.
Phản ứng RT-PCR được thực hiện ở 5 mức 41, 42, 43, 44, 45 chu kỳ để xác
định số chu kỳ cho hiệu quả khuếch đại tối ưu.

3.3.4

Điện di sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1.5% với hiệu điện thế 50V
trong 90 phút. Quan sát kết quả điện di dưới đèn cực tím. Kích thước các sản phẩm
PCR được ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder
(Promega). Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 600 bp, tương
đương với đoạn 589 bp trên lý thuyết, sẽ là những mẫu dương tính - bị nhiễm
PMWaV-1.