Tài liệu TÁCH CHIẾT ADN ppt

TÁCH CHIẾT ADN
GS.TS Nguyễn Quang Thạch
Viện Sinh hoc Nông nghiệp
1.Nguyên tắc và yêu cầu
- Tách chiết ADN là cần thiết bởi các thực nghiệm của
công nghệ gen đều tiến hành với ADN (hay ARN)
- ADN tách chiết được cần đảm bảo về độ tinh khiết và
độ nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện được các khâu nghiên
cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật.
* Có rất nhiều phương pháp tách chiết AND, tuỳ thuộc mục
đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp tách ADN cho
phù hợp
2.Các bước chính trong tách chiết ADN
1. Phá vỡ vật liệu ban đầu (tế bào, mô) để mở tế bào và giải
phóng axit nucleic (ADN và ARN) (nghiền trong ni tơ lỏng
và hòa trong đệm chiết)
2. Bổ sung các chất chống các chất hoạt hoá enzyme
ADNase và làm biến tính các phân tử protein, dịch hữu
cơ.v.v.
3.Tách ADN khỏi các tạp chất khác (bằng máy ly tâm).
4.Kết tủa , rửa và hòa tan ADN (rửa bằng dung dịch cồn,
hòa tan trong TE hoặc nước cất)
3.Một số hoá chất thông dụng dùng trong
tách chiết axít nucleic
- Ni tơ lỏng: Thông thường để phá màng/vỏ tế bào chúng ta phải
dùng nitơ lỏng, vì nitơ lỏng có 2 tác dụng chính đó là:
+ Làm cho màng bị cứng giòn, dễ bị vỡ khi nghiền
+ Và ni tơ lỏng giữ cho mẫu ở trạng thái lạnh, trạng thái mà các enzym
phá huỷ axít nucleic không hoạt động cho tới khi chúng bị ức chế
bằng hoá chất.
Một số qui trình sử dụng vật liệu đông khô, bởi vật liệu đông khô dễ

phá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữ mẫu
ở trạng thái lạnh, vì trong môi trường khô tuyệt đối các ezim phá huỷ axít
nucleic cũng vô tác dụng.
- EDTA: Khi màng bị phá vỡ, một loạt các chất đựơc giải phóng ra
dung dịch, trong số chúng có các loại emzim thuỷ phân axít nucleic thành
những mảnh vụn, bởi vậy cần phải ức chế sự hoạt động của enzym này
bằng EDTA. Các ion hoá trị hai như: Mg
2+
và Ca
2+
.v.v. rất cần thiết cho sự
hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic. Nếu trong dung dịch có
EDTA, chất này sẽ liên kết với các ion hoá trị hai nói trên, liên kết này dẫn
tới sự ức chế hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic, do vậy mà axít
nucleic sẽ không bị phân huỷ.
Tris: Axít nucleic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi độ axít và kiềm của
dung dịch sử dụng trong tách chiết, axít có thể làm cho axít nucleic bị gãy,
chẳng hạn axít clohydric (HCl) làm cho ADN bị đứt ở những vị trí purin,
trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao thì ADN sẽ bị tách thành sợi đơn. Để
loại trừ ảnh hưởng của axít và kiềm người ta đã sử dụng Tris để điều chỉnh
pH của dung dịch.
CTAB (Cetryl Ammonium Bromide): Là hoá chất dùng trong chiết
suất axít nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay.
CTAB dung dịch là một dung môi có khả năng hoà tan cao axít nucleic, vì
vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết axít
nucleic. Để tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, mẫu đựơc xử lý với nhiệt
khoảng từ 55
O
C đến 65
O

C. Ở nhiệt độ như vậy, nó còn có tác dụng làm
rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng axít
nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệt là enzym
thuỷ phân axít nucleic.
Chloroform: Trong dung dịch tách chiết, ADN tạo thành liên kết với
CTAB, để loại bỏ CTAB và đồng thời làm biến tính protein trong dung
dịch cần sử dụng chloroform. Sau đó dung dịch tách chiết được ly tâm,
loại bỏ các tạp chất (bị kéo xuống phần phía dưới ống nghiệm) còn lại axít
nucleic hoà tan trong lớp dung dịch nằm phía trên và được chuyển sang
một ống nghiệm mới.
Ethanol hoặc isopropanol:
- Ethanol thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực
ion, hay nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy axít nucleic dễ
dàng bị kết tủa, sự kết tủa của axít nucleic sẽ đạt hiệu quả cao hơn
nếu như được xử lý trong môi trường lạnh.
- Isopropanol được dùng để kết tủa axít nucleic trong môi trường
không cần có muối, tỷ lệ lượng isopropanol/mẫu theo thể tich là: 1/1.
Sử dụng isopropanol có ưu việt là các axít nucleic có trọng lượng
phân tử thấp như: những mảnh gãy ADN hoặc ARN.v.v. sẽ không bị
kết tủa và chúng dễ dàng bị loại bỏ cùng dung dịch.
Enzym RNnase và enzym Dnase: Khi kết tủa sẽ thu được axít
nucleic gồm: ADN và ARN:
- Nếu mục tiêu là thu ADN, chúng cần phải loại bỏ ARN. Để loại
bỏ ARN, ta dùng enzym RNase. Enzym RNase sẽ cắt ARN thành
những mảnh vụn, do vậy sau khi ly tâm ADN lắng tủa và được giữ ở
đáy ống nghiệm, còn những mảnh vụn ARN vẫn nằm trong dung
dịch, bởi vậy khi loại bỏ dung dịch thì ARN cũng bị loại bỏ theo.
- Ngược lại nếu cần loại bỏ ADN, chúng ta dùng enzym DNase,
cũng tương tự như việc loại bỏ ARN, ADN sẽ bị cắt vụn bởi DNase
và chúng cũng bị loại bỏ cùng dung dịch

- Nước cất và TE: Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cất
khử trùng hoặc dung dịch TE. Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn, nếu
nó được hoà tan trong dung dịch TE, vì dung dịch này chứa Tris và
EDTA.
3. Quy trình tách chiết ADN sử dụng
CTAB
1. Nghiền mẫu trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn
2. Xử lý mẫu trong dung dịch CTAB (có bổ sung các chất khác) ở 65 0C để tiếp tục phá
vỡ màng sinh chất, màng nhân để giải phóng ADN và các chất khác.
3. Ly tâm lạnh, thu lấy dịch nổi và xử lý dịch này với chlorofomr/isoamyl
alcohol để biến tính protein
4. Tiếp tục ly tâm lạnh, thu lấy dịch nổi và xử lý dịch thu được với
ARNaza để có ADN tinh khiết
5. Tách ADN khỏi dung dịch bằng cách kết tủa ADN nhờ isopropanol. Rửa lại
ADN bằng dung dịch cồn /axetat natri và làm khô. Hoà tan ADN trong nước
hoặc dung dịch TE (Tris/HCl và EDTA), bảo quản ở 40C để sử dụng hoặc lâu
dài ở (-200C đến -80 0C)
4. Xác định độ nguyên vẹn, độ tinh
sạch và nồng độ ADN
1. Xác định độ nguyên vẹn
Trong qui trình tách chiết, đã sử dụng các tác nhân lý, hoá học; vì thế
mà ít nhiều ảnh hưởng đến độ nguyên vẹn của axít nucleic. Bởi vậy chúng
ta phải kiểm tra mức độ nguyên vẹn của chúng. Để kiểm tra độ nguyên
vẹn của ADN, mẫu được điện di trong gel agarose (0,8%), sau đó nhuộm
gel bằng dung dịch ethidium bromide và soi qua tia cực tím để phát hiện
các băng ADN. Mẫu được xem là có độ nguyên vẹn cao khi các băng
ADN gọn, tập trung và rõ nét. Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của ADN cũng
xác định được ADN còn lẫn ẢN hay không
2. Xác định độ tinh sạch của axít nucleic

Để xác định độ tinh sạch của ADN, tiến hành tính chỉ số OD của ADN
ở bước sóng 260nm và 280nm, sau đó tính tỷ số giữa hai chỉ số OD đó.
ADN được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD
260
/OD
280
trong phạm vi từ 1,8 đến
2, nếu tỷ số này nhỏ hơn 1,8 thì mẫu ADN còn lẫn protein và những chất
khác như phenol, nếu tỷ số > 2 mẫu có thể vẫn còn lẫn ARN.
Đối với ARN, nếu tỷ số OD
260
/OD
280
sấp xỉ bằng 2 thì mẫu ARN tách
được coi là tinh sạch.
3. Xác định nồng độ axít nucleic
Nồng độ axít nucleic có thể được xác định bằng hai cách:
- Cách thứ nhất: điện di axít nucleic trong gel agarose cùng với những
mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ. Sau đó nhuộm gel bằng dung dịch
ethidium bromide, soi qua tia cực tím và chụp ảnh. So sánh mẫu axít
nucleic tách chiết với những mẫu chuẩn đã biết nồng độ, từ đó suy ra nồng
độ của axít nucleic tách chiết được. Cách này không đạt độ chính xác cao
mà chỉ ước lượng ở mức độ tương đối.
- Cách thứ hai: đo chỉ số OD của axít nucleic bằng máy quang phổ ở
bước sóng 260 nm. Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm của ADN sợi đôi
có nồng độ sấp xỉ 50µg/ml. ADN sợi đơn, ARN và các oligonucleotide có
nồng độ tương ứng là 33µg/ml, 40µg/ml và 30µg/ml.