TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG

BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN
B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG

Giảng viên hƣớng dẫn : THS. NGUYỄN THANH NAM
Lớp : 01DHTP1
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Khóa học : 2010-2014
Năm học : 2012-2013







TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2012

BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN

B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG
Giảng viên hƣớng dẫn : THS. NGUYỄN THANH NAM
Sinh viên thực hiện : HUỲNH TẤN ĐẠT 2005100054
NGUYỄN HOÀNG PHÚC 2005100031
NGUYỄN HỮU NHÂN 2005100262
NGUYỄN TẤN PHÚC 2005100040
BIỆN THỊ HỒNG THẮM 2005100062
VÕ MINH TRÍ 2008100088
PHẠM QUỐC HUY 2005100171
NGUYỄN VŨ M.CƢỜNG 2005100150
PHAN HƢNG THỊNH 2005100286
TRẦN VĂN TOÀN 2005100428
Lớp : 01DHTP1
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Khóa học : 2010-2014
Năm học : 2012-2013

TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2012

MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 1
1.1. Tổng quan về độc tố aflatoxin 1
1.2. Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin 1
1.3. Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng 4
CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ
ĐẬU PHỘNG 5
2.1. Đặt vấn đề 5

2.2. Các phương pháp xác định aflatoxin B1 5
2.3. Tổng quan phương pháp sắc ký bản mỏng 6
2.3.1. Chuẩn bị sắc ký 7
2.3.2. Kỹ thuật 7
2.3.3. Phân tích 8
2.4. Áp dụng phân tích aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng 9
2.4.1. Nguyên liệu 9
2.4.2. Thiết bị và hóa chất 9
2.4.3. Tiến trình 9
2.4.4. Kết quả và bàn luận 10
2.4.4.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B
1
trên các mẫu phân tích 10
2.4.4.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel 11
2.4.5. Kết luận và khuyến nghị 12
TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

LỜI MỞ ĐẦU
Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của
người tiêu dùng đã được nâng cao đáng kể thông qua các phương tiện truyền thông,
sách báo, báo đài,…Do đó, ý thức về thói quen sử dụng thực phẩm sạch và an toàn
đang ngày càng được quan tâm và chú trọng hơn. Các bằng chứng rõ ràng là hiện nay
các nhà hàng, dịch vụ ăn uống, siêu thị đang ngày càng trở nên gần gũi và quen thuộc
với người tiêu dùng. Bên cạnh đó, cũng còn những cơ sở sản xuất thực phẩm nhỏ, lẻ,
quán ăn lề đường,…vẫn còn nhiều bất cập và vấn đề an toàn thực phẩm vẫn chưa được
quan tâm đúng cách. Cùng với sự lo lắng đó, hiện nay “Phân tích thực phẩm” hiện nay
là một công cụ rất hữu dụng, giúp chúng ta phân tích, đánh giá được các mối nguy
cũng như các nguy cơ tiềm ẩn trong thực phẩm được phát hiện và ngăn chặn kịp thời.
Trong tương lai không xa, ngành “Phân tích thực phẩm” sẽ trở thành một phần không
thể thiếu, giúp con người tự tin hơn khi dùng thực phẩm và mang lại cảm giác an toàn

cho người tiêu dùng hơn.
Đề tài: Phân tích hàm lượng aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng” được nhóm
chúng tôi triển khai nhằm mục đích xem xét độc tố của loại nấm mốc này trong các sản
phẩm có dầu như đậu, vừng, bắp,…Nhằm có một cái nhìn tổng quát và hạn chế được
chúng trong thực phẩm hằng ngày.
Dù đã cố gắng rất nhiều nhưng cũng khó tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được
sự góp ý từ Thầy (Cô) và các bạn để bài tiểu luận sau đầy đủ hơn.

TẬP THỂ NHÓM
i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)
ML Maximum Level (giới hạn tối đa)
RIA Radioimmunoassay (miễn dịch phóng xạ)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (miễn dịch enzyme)
FDA Food and Drug Amination (Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ)
TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng)
IAC Immuno Affinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch)
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lƣợng aflatoxin trong một số loại thức ăn chăn nuôi ở VN 2
Bảng 1.2. Các giới hạn tối đa hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm 3
Bảng 1.3. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam 3
Bảng 2.1. Hàm lƣợng Aflatoxin B
1
trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn
Nhất 11
Bảng 2.2. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B
1
của cột IAC và Silicagel 12

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô,
khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế việc
nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là một vấn đề được các tổ chức quốc tế
cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới đặc biệt quan
tâm. Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kĩ thuật bảo quản gìn giữ các giá
trị dinh dưỡng của chúng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó đồng
thời chế biến chúng thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho nấm
mốc phát triển. Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật có hại đã gây ra
tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổn thất gây nên do nấm
mốc chiếm một phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về lượng cho nông sản nấm mốc
còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và động vật kinh tế.
Nấm mốc phát triển trên lương thực không những sử dụng các chất dinh dưỡng của
hạt: Protein, glucid, lipit và các vitamin, chúng còn tiết ra các độc tố. Độc tố aflatoxin
do Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus moninus tạo ra là độc tố
nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây
tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến,
…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong.
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm
trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và
các động vật kinh tế. Do vậy, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm
nấm mốc và các độc tố mốc, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc trên lương thực, thực
phẩm. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn
vệ sinh thực phẩm.
Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
1.1. Tổng quan về độc tố aflatoxin
Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus, là một
loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillu flavus vàAspergillus parasiticus.
Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư. Sau khi thâm nhập vào cơ thể, các
aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được
thuỷ phân và trở thành M
1
ít độc hơn.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của aflatoxin
1.2. Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin
Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên.
Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá
trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài
trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán.
Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và
ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu
cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó. Điều kiện thuận lợi
bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao.
Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa
miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị
Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 2

(ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa…
Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức
ăn nhiễm aflatoxin.
Bảng 1.1. Hàm lƣợng aflatoxin trong một số loại thức ăn chăn nuôi ở VN
Tên thực phẩm
n

Hàm lƣợng AF
trung bình (ppb)
Bắp hạt
25
205
Gạo và tấm gạo
2
22
Đậu nành hạt
1
50
Cám gạo
3
29
Khô dầu mè
3
8
Khô dầu dừa
7
17
Khô dầu đậu nành
4
12
Khô dầu đậu phộng
29
1200
Bột khoai mì lát
1
40
Thức ăn hỗn hợp

28
105

Hầu như tất cả các nguồn của bơ lạc thương mại tại Hoa Kỳ có hàm lượng
aflatoxin từ 0 ppb đến 20 ppb cho tiêu dùng trực tiếp, mặc dù thức ăn dùng để vỗ béo
cho bò thịt/lợn/gia cầm trong giai đoạn cuối có thể chấp nhận mức 300 ppb nhưng
trong thực tế thường thấp hơn nhiều mức khuyến cáo an toàn của Cục Dược phẩm và
Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA).
FDA đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức khoẻ động vật.

Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 3

Bảng 1.2. Các giới hạn tối đa hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm
Hàm lƣợng
(ppb)
Tiêu chí
20
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng thành (kể cả
gia cầm chưa trưởng thành) và các vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các
mục đích khác không được công bố; và đối với thức ăn chăn nuôi ngoại
trừ ngô và bột từ hạt bông
100
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi (bò, lợn) hoặc gia
cầm đã trưởng thành
200
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100 pound trở lên
300
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (ví dụ vỗ béo) và

đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm

Bảng 1.3. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam
ML (microgam/kg)
Tiêu chí
5
Đối với Aflatoxin B
1
trong thực phẩm nói chung
15
Đối với Aflatoxin B
1
, B
2
, G
1
, G
2
trong thực phẩm nói chung
Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 4

0,5
Đối với Aflatoxin M
1
trong sữa và các sản phẩm sữa

1.3. Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng
Có ít nhất 13 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên. Aflatoxin B
1

được coi
là dạng độc nhất và được sản sinh bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
Aflatoxin G
1
và G
2
chỉ được sinh ra từ A. parasiticus. Sự có mặt của Aspergillus trong
các sản phẩm thực phẩm không phải lúc nào cũng là chỉ thị về mức aflatoxin có hại mà
nó biểu thị cho rủi ro đáng kể khi sử dụng thực phẩm.
Aflatoxin M
1
, M
2
thường được phát hiện trong sữa của bò được cho ăn bởi các
loại hạt bị nhiễm nấm mốc. Các độc tố này là sản phẩm của một quá trình chuyển hóa
trong gan động vật. Tuy nhiên, aflatoxin M
1
cũng có mặt trong sản phẩm lên men
bởi Aspergillus parasiticus.
 Aflatoxin B
1
& B
2
: được sinh ra bởi Aspergillus flavus và A. parasiticus.
 Aflatoxin G
1
& G
2
: được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus.
 Aflatoxin M

1
: chất chuyển hóa của aflatoxin B
1
trên người và động vật
 Aflatoxin M
2
: chất chuyển hóa của aflatoxin B
2
trong sữa của bò được cho ăn
thức ăn nhiễm aflatoxin
 Aflatoxicol
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 5

CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP
VÀ ĐẬU PHỘNG
2.1. Đặt vấn đề
Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả năng
nhiễm độc tố nguy hiểm aflatoxin B
1
do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus
và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong
một số dung môi hữu cơ (clorofoc, methanol, acetone,…) và độc tính cao, rất bền vững
với tác nhân hóa lí , chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên 120
0
C trong môi trường kiềm.
Do cấu trúng hóa học có vòng dihydrofuran (hình 2) nên aflatoxin B
1
liên kết
với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, aflatoxin B1 còn

tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) gây tổn thương gan và gây
ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến di tật thai nhi
hoặc quái thai, nặng có thể chết non. Do đó, việc kiểm tra thực phẩm có nguy cơ nhiễm
aflatoxin B
1
là rất cần thiết
Hình 2.1. Aspergillus flavus
2.2. Các phƣơng pháp xác định aflatoxin B1
Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người lượng aflatoxin không
vượt quá 10ppb. Để phát hiện và định lượng aflatoxin, hiện nay 2 nhóm phương pháp
chính sau:
 Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 6

 Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch
enzym (ELISA) và cột sắc kí ái lực miễn dịch.
Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, trước khi phát hiện phải trải qua rất
nhiều thao tác phức tạp như chiết lấy aflatoxin từ vật liệu, sau đó phải cô đặc trước khi
định lượng nên tốn nhiều thời gian thao tác kĩ thuật, hơn nữa thiết bị đầu tư rất đắt tiền.
Với phương pháp ELISA, lại có nhiều hạn chế vì aflatoxin thường không bám
đặc hiệu vào các giếng polystirene, khoảng phát hiện hẹp, và cần phải có aflatoxin
đánh dấu hoặc kháng thể đánh dấu, sai số lớn mặc dù có độ nhạy cao.
Vì những lí do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng độc tố
aflatoxin B1 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng sử dụng cột ái lực miễn dịch và cột
silicagel” trong mẫu hay nhiễm nhất là đậu phộng và bắp với những ưu điểm sau:
 Cô đặc trên cột với nồng độ thấp và loại bỏ được tạp chất ảnh hưởng đến qui
trình định lượng.
 Thời gian tiến hành nhanh, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản và hóa chất ít
2.3. Tổng quan phƣơng pháp sắc ký bản mỏng

Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc
kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm
pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide,
hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần
phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí
bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần
trong dung dịch.
Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
 Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa
 Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật
 Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 7

 Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn
 Giám sát các phản ứng hữu cơ
Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài
bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương
pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC -
HPTLC).
2.3.1. Chuẩn bị sắc ký
Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng
nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được
trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa.
Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30
phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học
phân tích, và khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều
bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh.
2.3.2. Kỹ thuật
Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn

hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản
và nhanh, sắc kí lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và
phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng 1 cm từ
dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp,
như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di
chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản
sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác
nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung
môi.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 8

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có
được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được
xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính
phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy
pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di
chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu R
f
sẽ lớn hơn). Nếu pha động
được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ
có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp
chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một
hỗn hợp ethyl acetate và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số
lưu R
f
cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha
động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí. Nếu
muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử

dụng, như là C18-chức năng hóa silicagel.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính
phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu
thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt
khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu,
dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một
phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.
2.3.3. Phân tích
Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương
pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:
 Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được
những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV
254
). Lớp hấp phụ vì thế sẽ tự
phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
 Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 9

 Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào, hoặc
phun lên bản sắc kí.
 Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn,
chẳng hạn như khối phổ.
Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu R
f
của mỗi vệt mẫu sẽ được xác
định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di
chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được

sử dụng và các loại bản sắc kí, và không phải là hằng số.
2.4. Áp dụng phân tích aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng
2.4.1. Nguyên liệu
Bắp hạt và đậu phộng lấy từ chợ Bà Chiểu, Chợ Tân Sơn Nhất.
2.4.2. Thiết bị và hóa chất
Thiết bị:
+ Bột thiết bị chạy sắc kí TLC
+ Dụng cụ làm khô gia nhiệt, bình thổi khí, đèn soi
+ Các tấm silicagel 10 x 10 cm mua từ Merk
+ Microsylinge Halmilton 10µ
+ Các dụng cụ thủy tinh cần thiết
Hóa chất:
Acetonlintril, methanol, benzen (tinh khiết) và nước cất
+ Dung dịch triển khai:
2
18

Acetone
Chloroform
; dung dịch hòa cặn:
2
98
ln

itrilAceto
Benzen

+ Aflatoxin B1 chuẩn 0,5ppm trong dung dịch hòa cặn.
2.4.3. Tiến trình
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam

Phân tích thực phẩm Trang 10

Cột IAC Kết quả IAC
Bắp hạt+đậu phộng Sắc ký bản mỏng TLC
Cột silicagel Kết quả silicagel
Sơ đồ phân tích hàm lƣợng Aflatoxin B
1
bằng cột IAC:
Mẫu phân tích (25gam)

chiết xuất (5g NaCl, 37,5ml nước cất, methanol
87,5ml, thời gian 30 phút)

lọc thường (thu 15 ml và cho thêm 15ml nước cất)

lọc giấy thủy tinh (thu 45ml dịch lọc)

qua cột IAC (2 giọt/phút)

làm
khô dịch chiết (trong N
2
/40 – 50
0
C)

định lượng bằng TLC.
Sơ đồ phân tích hàm lƣợng Aflatoxin B
1
bằng cột Silicagel:

 Chuẩn bị cột Silicagel
Sắc ký cột

cho 5gam Na
2
SO
4
khan

cho CHCl
3
tới ½ ống

cho
10g silicagel

rửa thành ống 20ml CHCl
3


cho từ từ 15gam Na
2
SO
4
khan

cho CHCl
3
chảy tới đỉnh Na
2

SO
4
.
 Tiến hành
Mẫu phân tích (50gam)

chiết xuất (25ml nước cất, 250ml CHCl
3
, đậy kín
và lắc mạnh trong 30 phút)

lọc thường (thu 50 ml)

cột silicagel (đã chuẩn
bị)

rửa giải tạp (lần 1: 150ml C
6
H
6
, lần 2: 150ml (C
2
H
5
)
2
O)

rửa giải
Aflatoxin B

1
(150ml CH
3
OH : CHCl
3
= 3:97)

thu dịch Aflatoxin B
1
vào bình
cầu

làm khô với máy cô quay chân không

hòa cặn (2ml CHCl
3
)

làm
khô (trong N
2
/40 – 50
0
C hoặc chân không/40
0
C)

định lượng Aflatoxin B
1
.

2.4.4. Kết quả và bàn luận
2.4.4.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B
1
trên các mẫu phân tích


Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 11

Bảng 2.1. Hàm lƣợng Aflatoxin B
1
trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn
Nhất
STT
Tên mẫu
Cột IAC
Cột Silicagel
Hàm lƣợng Aflatoxin B
1
(ppb)
1
Bắp
không phát hiện
không phát hiện
2
Bắp
7
5
3
Bắp

2
không phát hiện
4
Bắp
1
không phát hiện
5
Bắp
không phát hiện
không phát hiện
6
Đậu phộng
4
2,5
7
Đậu phộng
1
không phát hiện
8
Đậu phộng
không phát hiện
không phát hiện
9
Đậu phộng
30
25
10
Đậu phộng
2
không phát hiện

Nhận xét: theo bảng 3.2, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC
phát hiện được 7 mẫu/10 mẫu và cột silicagel phát hiện được 3 mẫu/10 mẫu. Nhìn
chung, mức độ nhiễm trên bắp và đậu phộng ≤ 10ppb. Như vậy, độ nhạy của cột
IAC cao hơn so với cột silicagel.
2.4.4.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel


Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 12

Bảng 2.2. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B
1
của cột IAC và Silicagel
Mẫu
Tổng số
mẫu
Cột IAC
Cột Silicagel
Số mẫu nhiễm
Tỉ lệ nhiễm
(%)
Số mẫu
nhiễm
Tỉ lệ
nhiễm (%)
Khách hàng
16
3
18,75

2
12,50
Mua chợ
10
7
70,0
3
30,0
Ủ ẩm
4
4
100
4
100
Tổng
30
14
46,67
9
30,0

Nhận xét: theo bảng 3.3, cột có IAC độ nhạy phát hiện tốt hơn cột Silicagel
2.4.5. Kết luận và khuyến nghị
Kết luận:
Trong tổng số 34 mẫu thu nhận và phân tích tại phòng Sinh hóa, Công ty FCC
có 30,77% mẫu nhiễm Aflatoxin B
1
với mức độ nhiễm ≤ 20ppb và có 10 mẫu nhiễm
với mức độ < 50ppb.
Độ nhạy phát hiện Aflatoxin B

1
của cột IAC cao hơn so với cột Silicagel.
Trong 30 mẫu, cột IAC phát hiện 14 mẫu (chiếm 46,67%) và cột silicagel phát hiện
được 9 mẫu (chiếm 30%).
Cột silicagel không phát hiện được mẫu nhiễm Aflatoxin B
1
dưới hàm
lượng 2ppb.
Khuyến nghị:
Với phương pháp đơn giản, ít tốn kém và phổ phát hiện nhạy và rộng nên
phương pháp dùng cột IAC để phát hiện Aflatoxin B
1
trong các sản phẩm và
nguyên liệu có dầu là phương pháp tối ưu hiện nay. Hi vọng phương pháp này sớm
được áp dụng rộng đặc biệt tại các chợ, các nguồn thu mua nguyên liệu.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 13

Phương pháp này chỉ thử nghiệm một số mẫu giới hạn, đề tài này cần được
nghiêu cứu thêm các nội dung sau:
 Khảo sát thêm một số mẫu thuộc các nguồn nguyên liệu khác nhau
 Khảo sát thêm một số khu vực khác nhau
 Khảo sát thêm một số mẫu trong các thời điểm khác nhau.
Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam
Phân tích thực phẩm Trang 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt (tham khảo chỉnh)
[1]. Huỳnh Minh Duy, Nguyễn Văn Phú, Xác định hàm lượng độc tố
Aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng bằng phương pháp sắc ký bản

mỏng, Khoa công nghệ sau thu hoạch-Đại học Nông lâm TP.HCM, 2010
Tài liệu internet
[2]. />20120522042524660.chn.
[3].