Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 1 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

9/18/2020

CƠNG NGHỆ PROTEIN-ENZYME
PROTEIN-ENZYME TECHNOLOGY
•

Giảng viên:

TS. Nguyễn Xn Cảnh

•

Email:



TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH
•

Hóa sinh học. Phạm Thị Chân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản Giáo dục.

2005.
•

Hóa sinh cơng nghiệp. Lê Ngọc Tú. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
2004.

•

Enzyme ứng dụng. Phạm Thị Chân Châu, Phan Tuấn Nghĩa. Nhà xuất bản
Đại học Quốc gia Hà Nội. 2007.

•

Biochemistry (Fifth edition). Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert
Stryer. W. H. Freeman and Company. 2001

•

Biochemistry : The chemical reaction of living cells (Fifth edition). David
E. Metzler. ELSEVIER. 2003

•

Enzyme in Industry: Production and Applications. Wolfgang Aehle.
WILLEY-BLACKWELL. 2004.

1


9/18/2020

NỘI DUNG CHÍNH
• Protein
• Enzyme
• Các phương pháp nghiên cứu protein và enzyme

• Ứng dụng của protein và enzyme
• Cơng nghệ trong nghiên cứu và sản xuất protein/
enzyme
• Cơng nghệ AND tái tổ hợp trong sản xuất và cải

biến protein/ enzyme
• Enzyme cố định

Chương 1.Protein

1.1. Khái niệm protein
1.2. Phân loại protein
1.3. Cấu trúc phân tử protein
1.4. Các liên kết hóa học trong phân tử protein
1.5. Tính chất của protein
1.6. Phương pháp định tính và định lượng protein

2


9/18/2020

1.1. Khái niệm chung
•

Protein là những đại phân tử sinh học, được tìm thấy trong tất cả
các tế bào sống

•

Protein tham gia vào tất các các quá trình và chức năng sống của
cơ thể

•

Protein được tạo bởi các amino acid (chuỗi polypeptide), chúng liên
kết với nhau bởi liên kết peptide –CO-NH-

•

Chỉ có 20 amino acid tiêu chuẩn tồn tại trong các sinh vật sống.

•

20 amino acid  vơ vàn các protein khác nhau dựa vào các tổ hợp
sắp xếp của các amino acid  số lượng vô cùng lớn các cấu trúc
khác nhau.

•

Trình tự các amino acid được xác định bởi ADN

Đơn vị Dalton ?
Nhà hóa học, vật lý học, thiên văn học
người Anh
Tiên phong trong thuyết nguyên tử hiện đại
Nghiên cứu bệnh mù màu

Da là đơn vị khối lượng được định nghĩa là
1/12 khối lượng của một nguyên tử C (ở trạng
thái cơ bản).
1 Da có giá trị =1.660538782(83)×10−27 kg
1 Da xấp xỉ bằng khối lượng của 1 proton hoặc
1 neutron.
John Dalton (1766-1844)

3


9/18/2020

Thành phần cấu tạo
Tất cả các protein đều chứa các ngun tố:
C:

50-55%

O:

21-24%

H:

6,5-7,3%

N:

15-18%

S:

0-0,24% (chỉ có mặt ở một số protein)

Ngồi các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất nhỏ
các nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca

Lịch sử nghiên cứu protein
• PROTEIN, tiếng Hy Lạp (prota) có nghĩa là “quan trọng trước tiên”.
• Năm 1838, Jons Jakob Berzelius đã sử dụng để mô tả những phân
tử hữu cơ có khối lượng phân tử lớn. Protein được sử dụng để
mô tả những hợp chất hữu cơ có tầm quan trọng trong dinh
dưỡng động vật
• 1926, James B. Sumner chứng minh các enzyme có thể được
phân lập và kết tinh.
• 1955, Sir Frederick Sanger xác định trình tự insulin. Đây là bằng
chứng chứng tỏ rằng các protein có cấu trúc đặc thù.
• 1958, cấu trúc 3 chiều của haemoglobin và myoglobin được làm
sáng tỏ bởi Max Perutz và Sir John Cowdery Kendrew bằng
phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X.

4


9/18/2020

Thành tựu nghiên cứu Protein
Đến nay hơn 10.000 cấu trúc protein đã được làm sáng tỏ ở mức
độ nguyên tử.
Hàng triệu đột biến cho phép nghiên cứu phương thức các
protein thay đổi các đặc điểm.
Mơ phỏng bằng máy tính cho phép mơ hình hóa các đặc điểm
của protein.

 Vấn đề tồn đọng?

Protein problems !!!
1. Protein structure or folding of protein
Amino acid sequence  folding  3 D structure
 Dự đoán cấu trúc dựa vào trình tự amino acid?
2. Protein evolution
Bao nhiêu protein được hình thành trong suốt q trình tiến
hóa?

3. Protein crystallisation
Dự đoán cấu trúc trong các điều kiện khi mà protein được kết
tinh?

5


9/18/2020

1.2. Phân loại Protein

•

Vi khuẩn E.coli nhỏ bé, mỗi tế bào cũng có khoảng 3000 protein khác

nhau.
•

Cho đến nay khơng thể dự đốn được tổng số các protein khác nhau
có mặt trong tự nhiên

•

Phân loại protein?

Phân loại protein dựa vào chức năng
•

Enzymes:

•

Hormones: insulin, lipotropin, prolactin, nọc độc rắn

•

Protein vận chuyển: cytochrome C, haemoglobin và myoglobin, albumin vận
chuyển axit béo trong máu, các protein đóng vai trị vận chuyển ion (bơm, kênh)

•

Immunoglobulin hoặc kháng thể

•

Điều hịa hoạt động gen (transcription factor)

•

Protein cấu trúc: duy trì cấu trúc của các thành phần sinh học: Collagen, elastin, αkeratin, sklerotin, fibroin, peptidoglican (vi khuẩn)

•

Protein vận động: Chuyển năng lượng hóa học thành năng lượng cơ học (Actin và
myosin), tubulin.

•

Thụ thể (receptors): Nhận tín hiệu và truyền tín hiệu (glycoprotein,
transmembrane protein)

•

Protein tín hiệu: Các protein này thay đơi cấu hình khi có mặt của các phân tử tín
hiệu (GTPases)

•

Protein dự trữ: ovalbumin trứng, casein sữa

6


9/18/2020

Phân loại protein dựa vào sự cải biến sau dịch mã
•

Native proteins: Khơng có sự thay đổi sau dịch mã

•

Glico-proteins: gắn với các oligosaccharide mạch thẳng hay mạch nhánh

•

Cleaved proteins: sau dịch mã sẽ bị cắt thành 2 hay nhiều mảnh

•

Proteins with disulphide bonds: các cặp amino acid cysteins được nối với nhau
qua cầu S-S

•

Protein complexes: tồn tại ở dạng homo hoặc hetero

•

Chemically modified proteins: gốc amino acid bị cải biến hóa học (gắn cộng hóa trị
với các hợp chất hóa học)

•

Prions: bị cuộn gấp nếp theo một cách khác thường hoặc thay đổi cấu hình ngay
khi được dịch mã

Phân loại protein dựa vào cấu trúc và khả năng hòa tan

Dựa vào hình dạng và khả năng hịa tan

Protein dạng sợi (fibrous protein)

Protein hình cầu (Globular proteins)

Dựa vào tính phức tạp và khả năng kết hợp với các thành phần khác
Protein phức hợp (protein kết hợp với các thành phần khác)

7


9/18/2020

Protein dạng sợi và dạng cầu
Protein khung tế bào (Cytoskeletal proteins)
Actin
Arp2/3 (Actin related protein 2, 3)
Coronin
Dystrophin
FtsZ % (Filamenting temperature-sensitive mutant Z)
Keratin
Myosin
Spectrin
Tau (protein)
Tubulin

1.3. Cấu trúc của protein

Cấu trúc 3-D của phân tử Myoglobin

8

9/18/2020

Các bậc cấu trúc của protein

Bậc I

Bậc II

Bậc III

Bậc IV

9


9/18/2020

Tên Acid Amin

Ký hiệu

Ký hiệu

03 ký tự

01 ký tự

Tên Acid Amin

Ký hiệu

Ký hiệu

Alanine

Ala

A

Leucine

Leu

L

Arginine

Arg

R

Lysine

Lys

K

Asparagine

Asn

N

Methionine

Met

M

Aspartic acid

Asp

D

Phenylalanine

Phe

F

Cysteine

Cys

C

Proline

Pro

P

Glutamine

Gln

Q

Serine

Ser

S

Glutamic Acid

Glu

E

Threonine

Thr

T

Glycine

Gly

G

Tryptophan

Trp

W

Histidine

His

H

Tyrosine

Tyr

Y

Isoleucine

Ile

I

Valine

Val

V

03 ký tự 01 ký tự

Đặc điểm cấu tạo và phân loại amino acid

L-isomer là dạng axit amin phổ biến tìm thấy trong các protein

10


9/18/2020

Các amino acid dạng Nonionic và Zwitterion

Zwitterion = Lưỡng tính

Axit yếu

Base yếu

Các amino acid không phân cực (Nonpolar)/ kỵ nước (Hydrophobic)
Glycine (Gly)

Methionine (Met)

Alanine (Ala)
Phenylalanine (Phe)

Valine (Val)
Proline (Pro)

Leucine (Leu)
Tryptophan (Trp)

Isoleucine (Ile)

11


9/18/2020

Các amino acid phân cực (Polar)/ ưa nước (Hydrophilic)
Cysteine
(cys)

Serine (Ser)

Threonine (Thr)

Asparagine (Asn)

Glutamine (Gln)

Tyrosine (Tyr)

Các amino acid mang điện âm
Aspartic acid (Asp)

Glutamic acid (Glu)

Các amino acid mang điện dương
Lysine (Lys)

Arginine (Arg)

Histidine (His)

His đóng vai trị quan trọng trong chức năng xúc tác của enzyme, thường thấy ở trung
tâm hoạt động

12


9/18/2020

Các amino acid cần thiết ở người
Essential Amino Acids in Humans
Trong số 20 axit amin thường gặp trong phân tử protein có một số axit
amin mà cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được mà phải
đưa từ ngoài vào qua thức ăn được gọi là axit amin cần thiết hoặc axit

amin không thay thế.

Arginine*
Histidine*
Isoleucine
Leucine
Valine

Lysine
Methionine
Threonine
Phenylalanine
Tryptophan

* Cần thiết ở trẻ em, nhưng không cần thiết ở cơ thể trưởng thành

Đồng phân của các amino acid

Tồn tại ở dạng đồng phân lập thể (dạng D hay dạng L)
L: quay trái (levorotatory); D: quay phải (dextrorotatory)

13


9/18/2020

Một số amino acid khơng phổ biến tìm thấy trong protein

Cấu trúc bậc I
1. Là thành phần và trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong mạch
polypeptide. Cấu trúc này được giữ bền vững dựa vào liên kết cộng
hóa trị.
2. Liên kết peptide được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm
alpha carboxyl của một amino acid này và một nhóm alpha amine
của một amino acid khác. Phản ứng loại đi một phân tử nước.
3. Sản phẩm của phản ứng giữa 2 amino acid gọi là dipeptide...nhiều
hơn được gọi là tri-, tetra-, penta-peptide và polypeptide.

14


9/18/2020

Sự hình thành liên kết peptide
Ca COO-

NH3+

amino acid 1

amino acid 2

Ca

Cấu trúc bậc 2
• Các cấu trúc khơng gian (bậc 2, 3, 4) hình thành nên các cấu trúc gọi
là motifs và domains.
• Cấu trúc bậc 2 thường xảy ra ở những vùng cục bộ, được duy trì chủ
yếu nhờ các liên kết hydro giữa các nguyên tử trong mạch peptide.
• Những cấu trúc gọi là: xoắn ngẫu nhiên (random coil), xoắn thịng
lọng (loop) thường khơng có cấu trúc bậc 2 ổn định.
• Có 2 cấu trúc xoắn bậc 2 ổn định: Xoắn alpha (a-Helix) và phiến gấp
nếp beta (-sheet).
• Hai cấu trúc xoắn này thường thấy ở trong lõi của các protein, điều
đó giải thích tại sao các xoắn lịng lọng thường nhìn thấy ở vùng bên
ngồi của phân tử.

15


9/18/2020

Phiến gấp nếp Beta (-Sheet)

Đặc điểm phiến β
•

β-sheets được hình thành bởi 2 hoặc nhiều vùng kéo dài (5  10
amino acid)

•

Sự gấp nếp và sắp xếp 2 phía của các vùng trình tự kéo dài hình thành
nên phiến beta.

•

Cấu trúc được giữ ổn định nhờ các liên kết H

•

Các β-sheet có thể hoặc là song song hoặc đối song

•

Song song: các chuỗi peptide cạnh nhau cùng sắp xếp theo 1 chiều
(cùng đầu N  C hoặc từ C  N)

•

Đối song: Ngược lại.

16


9/18/2020

anti-parallel

NC

NC
loop
or
turn

CN
CN
parallel

NC
NC

crossover

NC
NC

Ví dụ một phiến β gồm 4 sợi đối song trong cấu trúc tinh thể của enzym catalase
a: Nhìn mặt đứng: các liên kết hydro hình thành dạng đối song giữa các nhóm
NH và CO trên các sợi kế cận nhau.
Ngun tử O (đỏ), N (xanh).
b: Nhìn mặt bên: Có 2 phiến β nằm gần như chồng lên nhau. Dạng gấp nếp
được quan sát rõ.

17


9/18/2020

Cấu trúc xoắn alpha (a-Helix)

•
•
•
•

Một vịng xoắn gồm 3,6 gốc amino acid
Các gốc bên (R) hướng ra ngoài
Cấu trúc α-helix thường gặp ở các protein hình cầu (nhóm hịa tan).
Các liên kết hidro giữa các nhóm carboxyl của amino acid n và nhóm amin của amino acid n + 4

Các amino acid và xoắn alpha
•

Khơng phải tất cả các amino acid có xu hướng hình thành xoắn alpha

•

Các amino acid A, D, E, I, L và M có xu hướng hình thành xoắn alpha

•

Các amino acid G, P có xu hướng phá vỡ xoắn alpha

•

Proline hạn chế khả năng quay xung quanh trục (liên kết peptide) dẫn
đến không thể kéo dài cấu trúc xoắn).

•

Sự phá vỡ xoắn alpha  tạo ra những kiểu gấp nếp khác góp phần
hình thành nên cấu trúc hình cầu.

18


9/18/2020

myoglobin

Bacteriorhodopsin

Parallel -sheets
carbonic anhydrase

Anti-parallel
-sheets
of lectin

37

Super-Secondary Structure
•

Một số protein có những kiểu sắp xếp cấu trúc bậc 2 tạo ra các vùng
domain hoặc cấu trúc motif.

•

Chẳng hạn như các cấu trúc helix-turn-helix (domain) có vai trị điều
hịa phiên mã ở vi khuẩn. Cấu trúc leucine zipper, helix-loop-helix và
zinc finger (domain) có vai trò điều hòa phiên mã ở eukaryote

19


9/18/2020

Motif và domain
•

Motif và domain là sự tổ hợp của các cấu trúc bậc 2.

•

Motif: chỉ bao gồm một vài cấu trúc bậc 2, không nhất thiết phải
thực hiện chức năng

•

Domain: gồm nhiều cấu trúc bậc 2, phức tạp hơn và thường
được định nghĩa như một đơn vị chức năng nhất định

•

Trong một số trường hợp motif và domain có ý nghĩa như nhau

20


9/18/2020

Cấu trúc bậc 3
•

Cấu trúc bậc 3  coi như cấu trúc 3 chiều hồn thiện của các chuỗi
polypeptide

•

Trong các cấu trúc bậc 2 của protein thường có các vùng cấu trúc
(domain) nhất định

•

Cấu trúc bậc 3 gồm các vùng cấu trúc bậc 2 gấp nếp tiếp theo

•

Sự tương tác của các vùng (domain) được duy trì bởi một số liên
kết và lực liên kết

•

Các aminoacid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide tương tác với
nhau nhờ các liên kết như; liên kết hydro, tương tác kị nước,
tương tác tĩnh điện và các lực van der Waals

GFP (Green fluorescent protein)
- Aequorea victoria
- Protein gồm 238 Aminoacid, 26,9kDa
- 11 chuỗi Beta, 01 chuỗi anpha trong vùng chromophore, 05 chuỗi alpha ngắn
(alpha helice)

21


9/18/2020

Năm 1996 cấu trúc kết tinh của GFP được làm sáng tỏ.
Xoắn alpha (đỏ), phiến beta (xanh lá cây), các vùng nối (loops) màu xanh đậm.
11 phiến beta tạo nên một hàng rào beta
1 chuỗi xoắn alpha chạy xuyên qua trung tâm
Chất phát quang (chromophore) định vị ở giữa hàng rào beta

Tháng 6 năm 2003, trong ngân hàng cấu trúc protein PDB,
GFP được xếp vào cấu trúc protein của tháng

Các nhóm R cấu tạo nên cấu trúc chromophore
bao gồm các amino acid từ vị trí 64 đến 170.
Trong đó Arg96 đóng vai trị quan trọng

22


9/18/2020

Cấu trúc bậc 4
•

Rất nhiều protein có chứa từ 02 chuỗi polypeptide trở lên, chúng liên kết với
nhau nhờ lực hút khơng cộng hóa trị (non-covalent) để cho cấu trúc bậc ba trở
nên ổn định hơn.

•

Các protein được tạo bởi nhiều chuỗi polypeptide đó được gọi là protein
oligomeric.

•

Cấu trúc được hình thành nhờ tương tác monomer-monomer trong protein
oligomeric được xác định là cấu trúc bậc 4 của protein.

•

Các protein oligomeric có thể gồm nhiều chuỗi polypeptide giống nhau
(multiple identical polypeptide chains) được gọi là homo-oligomers hoặc riêng
biệt (multiple distinct polypeptide chains) được gọi là hetero-oligomers

Heamoglobin là một hetero-oligomeric protein, bao gồm 02 chuỗi alpha và
02 chuỗi beta tạo ra cấu trúc bậc 4 là α2β2

23


9/18/2020

Các liên kết duy trì cấu trúc phân tử protein
• Liên kết cộng hoá trị chủ yếu là liên kết peptide nối các gốc axit amin tạo chuỗi
polypeptide.
• Liên kết disulfide (-S-S-) do 2 nhóm SH của gốc systein phản ứng với nhau tạo
thành góp phần đáng kể làm cuộn phân tử protein làm bền cấu trúc bậc III.
Có rất nhiều các liên kết khơng cộng hóa trị (non-covalent interaction), mặc dù
yếu nhưng đóng vai trị rất quan trọng trong việc ổn định cấu trúc không gian, đảm
bảo chức năng sinh học của các phân tử protein.

• Tương tác ion (Ionic interactions)
• Tương tác hấp dẫn Van der waals (Van der waals interactions)
• Liên kết Hydro (Hydrogen bonds)
• Tương tác kỵ nước (Hydrophobic interactions)

Liên kết hydro

•

Liên kết Hydro là 1 liên kết rất yếu được hình thành bởi lực hút tĩnh điện giữa
Hydro (đã liên kết trong 1 phân tử) với 1 nguyên tử có độ âm điện mạnh có kích
thước bé (N,O, F...) ở 1 phân tử khác hoặc trong cùng 1 phân tử

•

Liên kết Hydro được biểu diễn bằng ba chấm (...).

24


9/18/2020

25