Điều chỉnh quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán Tilapia Lake virus (TiLV) và bước đầu phân lập TiLV từ cá rô phi Việt Nam

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

ĐIỀU CHỈNH QUY TRÌNH SEMI-NESTED RT-PCR CHẨN ĐỐN
TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP TiLV
TỪ CÁ RƠ PHI VIỆT NAM
Ngơ Huỳnh Phương Thảo1*, Trần Hạnh Triết1, Nguyễn Hoàng Thụy Vy1, Lê Thị Thu Thảo1,
Bùi Nguyễn Chí Hiếu1, Trần Thị Thanh Hương1, Nguyễn Hồng Chi Mai2,
Lê Hồng Thế Huy3, Trần Nhựt Linh4

TĨM TẮT
Tilapia Lake virus là loại virus được phát hiện trên cả cá rô phi trong tự nhiên và cá rô phi nuôi. Đây
là một trong những nghiên cứu đầu tiên về TiLV phân lập tại Việt Nam. Trong năm 2019 và 2020,
nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập 51 mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV tại thành phố Hồ Chí
Minh (Tp. HCM) và Vĩnh Long. Kết quả semi-nested RT-PCR cho thấy chỉ có 02/51 (3,9%) mẫu
dương tính với virus TiLV, các mẫu còn lại đều cho kết quả âm tính. Việc ni cấy virus trên dịng
tế bào E-11 được thực hiện thành công trên 02 mẫu virus TiLV Việt Nam (VL160 và VL167). Tuy
nhiên, các mẫu virus TiLV Việt Nam chưa được duy trì thành cơng trên dòng tế bào E-11 qua các
lần cấy chuyền và quy trình này cần phải được tối ưu thêm. Ngồi ra, nghiên cứu cũng đã thay đổi
quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán TiLV để đạt hiệu quả khuếch đại tốt hơn, so với 02 quy
trình semi-nested RT-PCR cho TiLV phổ biến hiện nay bằng cách thay cặp mồi đặc hiệu bằng cặp
mồi Random hexamer/OligodT trong phản ứng tổng hợp cDNA. Mặc dù, độ nhạy của quy trình
RT-PCR tối ưu này cần được khảo sát thêm ở các nồng độ mẫu RNA khác nhau, nhưng quy trình
RT-PCR này có thể được ứng dụng tại các đơn vị kiểm soát dịch bệnh thủy sản để tăng hiệu quả
phát hiện virus TiLV.
Từ khóa: Tilapia Lake virus, cá rô phi, phản ứng semi-nested RT-PCR, tế bào E-11

I. GIỚI THIỆU
Tilapia Lake virus (TiLV) được tìm thấy lần
đầu tiên trên cá rô phi nuôi vào năm 2014 tại Israel
(Eyngor et al., 2014a). Đây là loại virus RNA
mạch đơn, sợi âm, có vỏ bọc và chứa 10 đoạn

trình tự mã hóa cho 14 protein (Bacharach et al.,
2016; Eyngor et al., 2014a; Surachetpong et al.,
2017), với kích thước từ 55 đến 100 nm (DelPozo et al., 2017; Eyngor et al., 2014a; Ferguson
et al., 2014; Surachetpong et al., 2017; Acharya
et al., 2019). Trước đây, TiLV được đề xuất

thuộc họ Orthomyxoviridae do sự tương đồng
với các cấu trúc gen ở Orthomyxoviruses. Tuy
nhiên, sau này TiLV được xếp vào một họ mới,
Amnoonviridae, thuộc cùng bộ Articulavirales
với Orthomyxoviridae (ICTV, 2020). Tỷ lệ chết
trong các ổ dịch tự nhiên từ 09-90%; bệnh xuất
hiện ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu tập trung ở cá
giống (01-03 tháng tuổi). Cá rô phi đỏ (cá điêu
hồng) giống ni lồng bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết
có thể lên tới 90% trong vòng một tháng sau thả.
Bệnh lây lan theo chiều ngang từ cá bệnh sang

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh
3
Đại học Nguyễn Tất Thành
4
Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh
* Email: ;
1
2

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

45


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

cá khoẻ trong cùng ao nuôi, trại nuôi, qua nguồn
nước, dụng cụ … (Cục Thú y, 2017); đồng thời
theo chiều dọc từ cá bố mẹ sang cá con thông
qua trứng và tinh trùng cá (Dong et al., 2020).
Vào tháng 5 năm 2017, FAO đã ban hành
hệ thống cảnh báo sớm và thông tin toàn cầu số
338 về TiLV (FAO, 2017) và Tổ chức Thú y Thế
giới (World Organization for Animal Health,
OIE) đã công bố trang thơng tin về bệnh TiLV
(OIE, 2017a). Sau đó, hơn 14 quốc gia/vùng
lãnh thổ đã báo cáo với OIE về sự hiện diện của
TiLV, ví dụ như Đài Loan (OIE, 2017b), Israel
(OIE, 2017c), Thái Lan (OIE, 2017d), Malaysia
(OIE, 2017e), Peru (OIE, 2018) và Philippin
(OIE, 2017f). Trong khi OIE gọi dịch bệnh
do TiLV gây ra là “tilapia lake virus” ((OIE),
2017a), một số tên khác cũng được sử dụng
trong các báo cáo khoa học như bệnh viêm gan
do virus ở cá rô phi (syncytial hepatitis of tilapia,
SHT) (Ferguson et al., 2014) và Hội chứng chết
hàng loạt tháng nuôi đầu (1-month mortality
syndrome) (Tattiyapong et al., 2017). Bệnh này
có thể lây lan qua hoạt động vận chuyển cá rô
phi giống mang mầm bệnh từ nước này sang
nước khác.

Tại Việt Nam, cá rô phi được kỳ vọng là
đối tượng nuôi và xuất khẩu chủ lực của ngành
thủy sản. Tuy nhiên, việc nuôi thâm canh cá rơ
phi đang gặp phải trở ngại khá lớn đó là dịch
bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và lây lan trên
diện rộng, gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi.
Từ năm 2015, Việt Nam có nhập khẩu cá rơ phi
về làm giống hoặc thực phẩm từ một số nước
có cơng bố dịch bệnh do TiLV (Thái Lan, Đài
Loan, Israel, Philippin) hoặc nước nguy cơ cao
xuất hiện bệnh này (Vương quốc Anh, Trung
Quốc). Nguy cơ TiLV xâm nhiễm vào Việt Nam
thông qua đường nhập khẩu cá rô phi giống là
rất cao do bệnh này chưa có trong danh sách các
bệnh phải công bố dịch theo quy định của OIE
(Jansen et al., 2019) và pháp luật hiện hành của
Việt Nam (Cục Thú y, 2017a). Ngoài ra, Cục
46

Thú y đã tổ chức phối hợp các đơn vị liên quan
tổ chức điều tra, lấy mẫu xét nghiệm TiLV trên
cá rơ phi, tính đến nay đã lấy và xét nghiệm 257
mẫu cá tại 15 tỉnh, thành phố, trong đó có 60
mẫu (chiếm 26,43%) dương tính với TiLV (Chi
cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản tỉnh Bình
Dương, 2017). Do đó, theo nhận định của OIE,
FAO và Mạng lưới các Trung tâm Nuôi trồng
thủy sản khu vực Châu Á Thái Bình Dương
(NACA), Việt Nam là nước thuộc diện có nguy
cơ rất cao đối với bệnh này. Để chuẩn bị sẵn

sàng đối phó với dịch bệnh nguy hiểm này, Cục
Thú y bước đầu ban hành một số văn bản chỉ
đạo nhằm cảnh báo về nguy cơ bùng phát và
lây lan của dịch bệnh do TiLV gây ra trên cá rô
phi, như công văn 1357/TY-TS ngày 17/7/2017
về hướng dẫn phịng, chống bệnh do TiLV trên
cá rơ phi; cơng văn số 8862/BNN-TY ngày
20/10/2017 về chỉ đạo áp dụng các biện pháp
cấp bách phòng, chống dịch bệnh mới do TiLV
gây ra trên cá rơ phi.
Quy trình semi – nested RT-PCR phát hiện
TiLV trên các mẫu cá bệnh đều dựa theo cơng
bố của Dong et al. (2017). Quy trình này dựa
vào đoạn trình tự số 3 trong bộ gen TiLV và hiện
được các đơn vị thuộc Cục thú y Việt Nam ứng
dụng trong chẩn đốn TiLV (TCCS 05:2017/
TY-TS). Sau đó, Taengphu et al. (2020) phát
triển quy trình tương tự trên đoạn trình tự số
1 của chủng TiLV. Cả hai quy trình này đều sử
dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu vào
q trình tổng hợp cDNA.
Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, bộ mồi
Random hexamer và OligodT được sử dụng vào
quá trình tổng hợp cDNA của phản ứng seminested RT-PCR chẩn đoán TiLV và so sánh
hiệu quả khuếch đại giữa các quy trình với nhau.
Ngồi ra, hiện chưa có nghiên cứu nào nuôi cấy
chủng TiLV phân lập từ cá rô phi ni tại Việt
Nam. Do đó, nghiên cứu này đã tiến hành thu
thập và nuôi cấy chủng TiLV Việt Nam trên
dịng tế bào E-11.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguồn gốc các mẫu virus TiLV đối
chứng và tế bào E-11
Chủng TiLV-TL Thái Lan và dòng tế bào
E-11 ( />product/sigma/01110916?lang=en®ion=VN
) được cung cấp bởi Khoa Khoa học và Công
nghệ, trường Đại học Suan Sunandha Rajabhat,
Thái Lan.
Mẫu cá rơ phi dương tính với TiLV (TiLVRIA2) được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thủy sản II. Mẫu mô này được phân
lập từ trại cá rô phi ở Tp. HCM và bảo quản
trong cồn 96o.
2.2. Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn
đoán TiLV với bộ mồi Random hexamer và
OligodT
2.2.1. Tách chiết RNA
RNA virus được tách chiết từ mẫu cá
bằng dung dịch Trizol. Mơ cá nhiễm TiLV (10
mg) hoặc 200 µL dịch nuôi cấy virus TiLVTL trên tế bào E11 được trộn với trong 1 mL
TRISure (Bioline) và đồng nhất bằng máy
Qiagen TissueLyserII ở tần số rung (Oscillation
frequency) 50 Hz/giây trong thời gian 1 phút
ở 4oC. Sau khi đồng nhất, mẫu được ủ ở nhiệt

độ phòng trong 5 phút và bổ sung thêm 100 µL
BCP (Merck), lắc mạnh tuýp trong 15 giây và
tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Mẫu
được ly tâm ở tốc độ 20.000 xg trong 15 phút ở
4°C sẽ tách các pha. Phần pha nổi bên trên được
chuyển qua tuýp 1,5 mL mới (khoảng 300-500
µL). Lượng isopropanol lạnh tương đương thể
tích mẫu được bổ sung để tủa RNA. Các tuýp
được đảo đều 5-7 lần và ly tâm ở tốc độ 20.000
xg trong 15 phút ở 4°C. Cặn ở đáy tube được
rửa với 1 mL ethanol 75% lạnh và tiếp tục ly
tâm ở 20.000 xg trong 5 phút ở nhiệt độ phịng.

Cặn sau khi rửa được phơi khơ ở nhiệt độ phịng
trong 5-10 phút. Sau đó, cặn được hịa trong
10-20 µL nước nuclease-free (Thermo Fisher
Scientific) qua đêm ở 4oC. RNA được bảo quản
ở -80oC cho đến khi dùng. Nồng độ và chất
lượng RNA sau khi tách được kiểm tra bằng
máy Nanodrop (Thermo Scientific).
Ngoài ra, để làm tăng hiệu suất tách chiết
RNA từ dịch nuôi cấy TiLV, bộ kit QIAmp Viral
RNA Mini (Qiagen) cũng được sử dụng theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.2. RT-PCR chẩn đốn TiLV
Quy trình semi-nested RT-PCR khuếch đại
đoạn trình tự thứ 3 của TiLV với bộ mồi gồm
Nested ext-1 (5’-TAT GCA GTA CTT TCC
CTG CC-3’), ME1 (5’-GTT GGG CAC AAG
GCA TCC TA-3’) và 7450/150R/ME2 (5’TAT CAC GTG CGT ACT CGT TCA GT-3’)

(Eyngor et al., 2014; Kembou Tsofack et al.,
2017; Dong et al., 2017) là quy trình phổ biến,
hiện được các Trung tâm chẩn đốn virus TiLV
sử dụng. Trong quy trình này, phản ứng tổng
hợp cDNA được tiến hành với bộ kit RevertAid
First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo
Scientific™), gồm 5 μl mẫu RNA (100–400
ng), 0,4 μM mỗi mồi Nested ext-1 và ME1, 1
mM dNTP, 1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl
RiboLock RNAse inhibitor và 1X dung dịch
đệm trong tổng thể tích 20 μl. Chương trình
nhiệt gồm 25oC 10 phút, 50oC 30 phút và 94oC ở
2 phút. Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại
bằng phản ứng Nested PCR với cặp mồi ngoài
Nested ext-1 và ME1 (PCR1, 415 bp) và cặp
mồi trong 7450/150R/ME2 và ME1 (PCR2, 250
bp) bằng bộ kit DreamTaq Green PCR master
mix (Thermo Scientific). Phản ứng PCR 1 gồm
1,5 μL cDNA, 0,4 μM mỗi mồi Nested ext-1
và ME1, 1X DreamTaq Green PCR master mix
trong tổng thể tích 25 μL. Chương trình nhiệt

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

47


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

gồm một chu kỳ 94oC trong 2 phút 25 chu kỳ

với 94°C trong 30s, 60°C trong 30s, 72°C trong
30s, và một chu kỳ 72oC trong 5 phút. Phản
ứng PCR2 được tiến hành trong thể tích 20 μL
gồm có 1 μL sản phẩm PCR1, 0,25 μM mỗi mồi
7450/150R/ME2 và ME1, 1 X DreamTaq PCR
master mix. Chương trình nhiệt tương tự như
phản ứng PCR1 (Dong et al., 2017a).
Quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn trình
tự thứ 1 của TiLV được thiết kế với bộ mồi
gồm TiLV/nSeg1F (5′-TCT GAT CTA TAG
TGT CTG GGC C-3′), TiLV/nSeg1R (5′-AGT
CAT GCT CGC TTA CAT GGT-3′) và TiLV/
nSeg1RN (5′- CCA CTT GTG ACT CTG AAA
CAG -3′) (Dong et al., 2020; Taengphu et al.,
2020). Quy trình mới này có độ nhạy cao gấp
100 lần so với quy trình RT-PCR trên đoạn trình
tự số 3 của TiLV. Trong quy trình này, phản
ứng tổng hợp cDNA được tiến hành với bộ kit
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,
gồm 5 μl mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mỗi mồi
TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1R, 1 mM dNTP,
1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock
RNAse inhibitor và 1X dung dịch đệm trong
tổng thể tích 20 μl. Chương trình nhiệt gồm
25oC 10 phút, 50oC 30 phút và 94oC ở 2 phút.
Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại bằng
phản ứng Nested PCR với cặp mồi ngoài TiLV/
nSeg1F và TiLV/nSeg1R (PCR1, 620 bp) và
cặp mồi trong TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1RN
(PCR2, 274 bp). Phản ứng PCR 1 gồm 1,5 μL

cDNA, 0,4 μM mỗi mồi TiLV/nSeg1F và TiLV/
nSeg1R, 1X DreamTaq Green PCR master mix
trong tổng thể tích 25 μL. Chương trình nhiệt
gồm trình nhiệt gồm một chu kỳ 94oC trong 2
phút, 25 chu kỳ với 94°C trong 30s, 60°C trong
30s, 72°C trong 30s, và một chu kỳ 72oC trong
2 phút. Phản ứng PCR2 được tiến hành trong
thể tích 25 μL gồm có 5 μL sản phẩm PCR1,
48

0,5 μM mồi TiLV/nSeg1F và 0,6 μM mồi TiLV/
nSeg1RN, 1 X DreamTaq Green PCR master
mix. Chương trình nhiệt tương tự như phản ứng
PCR1.
Ngoài ra, việc sử dụng cặp mồi Random
hexamer (5´ – d (NNNNNN) –3´ N = G, A, T
or C) và OligodT (5´-d (TTT TTT TTT TTT
TTT TTT)-3´) để tổng hợp cDNA thay cho các
cặp mồi đặc hiệu với đoạn trình tự số 1 và số
3 nhằm tối ưu quy trình chẩn đốn TiLV. Phản
ứng tổng hợp cDNA gồm được tiến hành với bộ
kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,
gồm 5 μL mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mỗi mồi
Random hexamer và OligodT, 1 mM dNTP, 1 μl
Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock RNAse
inhibitor và 1X dung dịch đệm trong tổng thể
tích 20 μl. Chương trình nhiệt gồm 25oC trong
10 phút, 45oC trong 60 phút và 85oC ở 5 phút.
Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại với 02
bộ mồi liên quan đến đoạn trình tự số 1 và số 3

của TiLV với quy trình PCR tương tự như trên.
Mẫu RNA của chủng TiLV-TL ni cấy trên
dịng tế bào E-11 được dùng để so sánh hiệu quả
khuếch đại của các quy trình với nhau. Chứng
dương là mẫu RNA của virus TiLV-RIA2, trong
khi đó, chứng âm là mẫu nước. Sản phẩm PCR
được kiểm tra trên gel agarose 1% chứa với 1X
dung dịch GelRed® 10,000X (Biotum) trong
dung dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris (Merck),
10 mM acetic acid (Merck), and 0.5 mM EDTA
(Merck)). Kết quả điện di được quan sát bằng
máy chụp ảnh gel điện di (GelDoc-it2, UVP).
2.3. Thu mẫu cá rô phi nhiễm TiLV tại
Việt Nam
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập
mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV thông qua
các dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết, lở loét
thân, bụng phình, tróc vảy, mắt lồi (Dong et
al., 2017b; Ferguson et al., 2014; Jansen and

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Mohan, 2017; Surachetpong et al., 2017) tại các
trại nuôi cá rô phi ở Tp. HCM và Vĩnh Long.
Các mẫu cá chết được vận chuyển trong đá lạnh
(trong vòng 24 giờ) về Trung tâm Công nghệ
sinh học Tp. HCM. Mẫu gan, thận, lách và não

của các mẫu cá nghi ngờ nhiễm TiLV được thu,
trộn chung và chia làm hai phần để bảo quản ở
-80oC và trong cồn 96o.
Mẫu mô cá bảo quản trong cồn 96o được
kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng quy trình
semi-nested RT-PCR đã trình bày ở Mục 2.2.
Đối với các mẫu mơ cá ở 96o dương tính với
TiLV, mẫu mơ tương ứng bảo quản ở -80oC
được sử dụng để nuôi cấy virus TiLV trên dịng
tế bào E-11.
2.4. Ni cấy virus TiLV trên dịng tế bào
E-11
2.4.1. Ni cấy tế bào E-11
Dịng tế bào E-11 (tế bào từ cá lóc
Ophicephalus striatus) là dòng tế bào nhạy cảm
với TiLV. Tế bào bảo quản ở -80oC (khoảng
106 tế bào mL-1) được rã đông nhanh ở 37oC và
chuyển vào môi trường Liebovitz L-15 (Bioind)
ở nhiệt độ phịng. Tiến hành loại bỏ mơi trường
đơng lạnh bằng cách ly tâm với tốc độ 450 xg
ở 25oC trong 5 phút. Cặn tế bào được huyền
phù trong môi trường L-15 bổ sung 5% huyết
thanh bò (fetal bovine serum, FBS, Sigma) và 2
mM L-glutamine (Sigma) với mật độ 3 x 105 tế
bào/cm2 và ủ ở 25oC trong điều kiện không có
CO2. Thay mơi trường L-15 + 5%FBS + 2mM
L-glutamine khi tế bào mọc lan 50% diện tích
đĩa ni cấy. Khi tế bào E-11 phát triển thành
một lớp đơn liên tục (monolayer) chiếm 70 –
80% diện tích đĩa ni cấy, tế bào được cấy

chuyền sang đĩa mới hoặc cảm nhiễm với virus
TiLV.
2.4.2. Cảm nhiễm tế bào E-11 với virus
TiLV

Để thu virus từ mẫu bệnh phẩm, các mẫu
mơ dương tính với TiLV được đồng nhất trong
dung dịch Hank’s balanced salt solution (HBSS,
Thermo Fisher Scientific) và sau đó ly tâm ở
3.000 xg trong 10 phút ở 4oC (Tattiyapong et al.,
2017). Dịch nổi được thu và lọc qua màng lọc
0,22 μm. Sau đó, 0,5 – 1 mL dịch virus sau lọc
được bổ sung vào đĩa nuôi cấy 6 giếng chứa tế
bào E-11 lớp đơn chiếm 70 – 80% diện tích đĩa
và ủ ở 25oC trong 14 ngày. Mật độ tế bào được
quan sát hàng ngày. Khi trong bình ni cấy
có hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE, cytopathic
effect) với mật độ tế bào bị ly giải từ 50 – 90%,
dịch nổi sẽ được lọc qua màng lọc 0,22 μm, cấy
chuyền sang các giếng tế bào E-11 mới với tỷ
lệ thể tích 1:1. Để thu virus, dịch nổi ở lần cấy
chuyền thứ 2 và 3 với dấu hiệu CPE rõ ràng
sẽ được lọc qua màng lọc 0,22 μm và chia vào
nhiều tuýp để bảo quản ở -80oC. Dịch nuôi cấy
virus được kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng
quy trình semi-nested RT-PCR (Mục 2.2) và cấy
chuyền sang bình tế bào mới nhằm mục đích
duy trì sự tồn tại của virus cho các nghiên cứu
sâu hơn sau này.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn
đoán TiLV với bộ mồi Random hexamer và
OligodT
Khi sử dụng cùng 01 mẫu RNA để so sánh
khả năng chẩn đốn TiLV của quy trình seminested RT-PCR trên đoạn trình tự số 3 và số
1 theo công bố bởi Dong et al., (2017); Dong
et al., (2020); Taengphu et al., (2020) với quy
trình có sự điều chỉnh ở phản ứng tạo cDNA
với cặp mồi Random hexamer/OligodT, kết quả
cho thấy khả năng phát hiện TiLV tốt nhất ở quy
trình RT-PCR sử dụng bộ mồi Random hexamer/
OligodT/Nested ext-1/ME1/ 7450/150R/ME2
(Hình 1). Quy trình điều chỉnh này được nhóm

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

49


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

nghiên cứu sử dụng cho các đợt kiểm tra TiLV
sau này.
Căn cứ trên bộ gen TiLV, một số phương
pháp PCR đã được thiết lập như RT-PCR (Eyngor
et al., 2014), nested RT-PCR (Kembou Tsofack
et al., 2017), semi-nested RT-PCR (Dong et
al., 2017a; Taengphu et al., 2020), RT-qPCR
(Kembou Tsofack et al., 2017; Tattiyapong et
al., 2017; Waiyamitra et al., 2018) và RT-LAMP

(Phusantisampan et al., 2019; Yin et al., 2019).
Hầu hết các phương pháp này đều hướng đến
đoạn trình tự 3 của TiLV. Mặc dù quy trình RT-

PCR khuếch đại đoạn trình tự thứ 1 của TiLV
với bộ mồi gồm TiLV/nSeg1F, TiLV/nSeg1R,
TiLV/nSeg1RN được Taengphu và ctv. (2020)
đánh giá là nhạy hơn bộ mồi khuếch đại đoạn
trình tự số 3 (Dong et al., 2017), nhưng kết quả
so sánh hiện tại của đề tài thì lại cho thấy điều
ngược lại. Việc khảo sát trên quy mô mẫu lớn
hơn và nồng độ mẫu khác nhau cần được triển
khai để kiểm chứng thêm về độ nhạy và độ đặc
hiệu của các quy trình semi-nested RT-PCR với
bộ mồi Random hexamer/OligodT/Nested ext1/ME1/ 7450/150R/ME2.

Hình 1. Kết quả chẩn đốn TiLV của các quy trình semi-nested RT-PCR căn cứ trên đoạn trình
tự số 3 (Ex1/ME1) của Dong et al., (2017), trên đoạn trình tự số 1 (nSeq1F/R) của Taengphu et
al., (2020) và quá trình tổng hợp cDNA có điều chỉnh với cặp mồi random hexamer/oligodT. M:
thang DNA 1kb (Thermo); 1: mẫu RNA của TiLV-TL tách bằng phương pháp Trizol; 2: mẫu
RNA của TiLV-TL, tách bằng QIAmp Viral RNA Mini; 3: mẫu TiLV-RIA2; (-): chứng âm.

3.2. Phân lập và nuôi cấy chủng

TiLV Việt Nam

3.2.1. Thu thập mẫu cá nhiễm TiLV
50

Từ tháng 08/2019 đến tháng 06/2020,

nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành 04 đợt thu
thập mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV tại các

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

bè ni cá rô phi ở Tp. HCM (04 mẫu) và Vĩnh 5/2019 và cũng là nơi thu được mẫu cá dương
Long (47 mẫu) (Bảng 1). Bè ni cá rơ phi tại tính TiLV của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Tp. HCM từng nhiễm TiLV vào khoảng tháng Thủy sản II.
Bảng 1. Danh sách các mẫu cá rô phi nghi nhiễm TiLV thu tại Tp. HCM và Vĩnh Long.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31

Q3
Q4
Q130
Q134
VL1
VL2
VL3
VL4
VL5
VL6
VL7
VL8
VL9
VL10
VL11

VL12
VL13
VL14
VL15
VL16
VL17
VL18
VL19
VL20
VL21
VL22
VL23
VL24
VL25
VL26

Rô phi vằn
Rô phi vằn
Rô phi vằn
Rô phi vằn
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng

Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng
Điêu hồng

100 g
100 g
300 g
30 g
210 g
36 g
186 g
53 g
122 g
127 g
55 g
47 g
112 g

52 g
66 g
67 g
179 g
22 g
73 g
52 g
226 g
59 g
156 g
101 g
141 g
133 g
116 g
146 g
182 g
176 g

Tp. HCM
Tp. HCM
Tp.HCM
Tp.HCM
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long

Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long
Vĩnh Long

08/2019
08/2019
06/2020
06/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020

03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020
03/2020

Kết quả
chẩn đoán
TiLV
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)

(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)

VL27

Điêu hồng

164 g

Vĩnh Long

03/2020

(-)

32

VL28

Điêu hồng

92 g

Vĩnh Long

03/2020

(-)

TT

Ký hiệu

Loài cá

Trọng
lượng cá

Nguồn gốc

mẫu

Thời gian thu
mẫu

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

51


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

TT

Ký hiệu

Lồi cá

Trọng
lượng cá

Nguồn gốc
mẫu

Thời gian thu
mẫu

Kết quả
chẩn đoán
TiLV

33

VL29

Điêu hồng

170 g

Vĩnh Long

03/2020

(-)

34

VL156

Điêu hồng

600 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

35

VL157

Điêu hồng

350 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

36

VL158

Điêu hồng

270 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

37

VL159

Điêu hồng

400 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

38

VL160

Điêu hồng

350 g

Vĩnh Long

06/2020

(+)

39

VL161

Điêu hồng

400 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

40

VL162

Điêu hồng

520 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

41

VL163

Điêu hồng

90 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

42

VL164

Điêu hồng

70 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

43

VL165

Điêu hồng

70 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

44

VL166

Điêu hồng

70 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

45

VL167

Điêu hồng

70 g

Vĩnh Long

06/2020

(+)

46

VL168

Điêu hồng

60 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

47

VL169

Điêu hồng

70 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

48

VL170

Điêu hồng

50 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

49

VL171

Điêu hồng

40 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

50

VL172

Điêu hồng

40 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

51

VL173

Điêu hồng

35 g

Vĩnh Long

06/2020

(-)

Sau khi mẫu chuyển về Trung tâm CNSH
Tp. HCM, sự hiện diện của TiLV trong 51 mẫu
mô cá được kiểm tra bẳng RT-PCR (Hình 2 – 3).

Kết quả RT-PCR cho thấy chỉ có mẫu VL160 và
VL167 dương tính với virus TiLV, các mẫu còn
lại (49/51 mẫu) đều cho kết quả âm tính.

Hình 2. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trên mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu tại Tp. HCM bằng
quy trình semi nested RT-PCR. M: thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline); 1: Q3; 2: Q4; 3: Q130;
4: Q134; 5, 6: Chứng âm; 7: mẫu virus TiLV-TL.
52

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 3. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trên mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu tại Vĩnh Long
(VL156 – VL173) bằng quy trình semi nested RT-PCR. M: thang DNA O’Generuler 1kb
(Thermo); (+): mẫu virus TiLV- RIA2; (-): Chứng âm.
Dịch bệnh TiLV thường xảy ra vào mùa
nóng từ tháng Năm đến tháng Mười hàng năm
(Kembou Tsofack et al., 2017). Đa số các đợt
lấy mẫu của nghiên cứu này đều rơi vào khoảng
mùa hè với nhiệt độ cao. Đồng thời, vào những
thời điểm thu mẫu, hiện tượng nước bị đục tại
khu vực nuôi cá đều ghi nhận được. Đây có thể
là một trong các yếu tố môi trường gây stress và
khiến cá dễ nhiễm bệnh. Tuy nhiên, số mẫu cá
rô phi bệnh dương tính với TiLV có tỷ lệ thấp
(2/51 mẫu, chiếm 3,9%) và mức độ nhiễm yếu
theo đánh giá cảm quan thông qua kết quả điện

di các sản phẩm RT-PCR (Hình 2 - 3). Điều này
cho thấy dịch bệnh TiLV ở các trại nuôi cá rô
phi ở Tp. HCM và Vĩnh Long chưa hiện diện
nhiều và mạnh; do đó, hiện chưa gây ra dịch lớn
và tổn thất nghiêm trọng.
3.2.2. Nuôi cấy virus TiLV từ mẫu cá rô
phi nuôi tại Việt Nam

Mẫu cá rơ phi VL160 và VL167 dương tính
với TiLV được sử dụng để cảm nhiễm dịng tế
bào E-11 nhằm mục đích phân lập và nuôi cấy
virus TiLV Việt Nam phục vụ cho các nghiên
cứu chuyên sâu sau này. Cả hai mẫu VL160 và
VL167 đều cho thấy sự ly giải tế bào với các
dấu hiệu đặc trưng do virus TiLV gây ra như
những vệt tan xuất hiện trên lớp đơn tế bào E11
(vật kính 4x) lan dần đến khi tồn bộ E11 bị
ly giải hết. Ở vật kính 20x, các tế bào E11 có
hiện tượng bị co trịn và bong tróc khỏi bề mặt
bình ni cấy. Mẫu VL167 đã ly giải 80% tế
bào chỉ sau 02 ngày cảm nhiễm, trong khi đó
mẫu VL160 có tốc độ ly giải tế bào chậm hơn,
đến ngày thứ 8 thì mới ly giải được 80-90% tế
bào (Hình 4). Sau khi 89-90% tế bào bị ly giải,
phần dịch nổi được thu để kiểm tra sự hiện diện
của TiLV và cấy chuyền sang các bình ni cấy
tế bào tiếp theo.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

53


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 4. Hình ảnh sau 2-8 ngày cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu VL160 và VL167. Dấu
(*): vệt tan trên tế bào, dấu hiệu ly giải tế bào đặc trưng ở vật kính 4X. Dấu (→): tế bào bị co trịn và
bong tróc ở vật kính 20x. dpi: số ngày sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào (day post infection).
Kết quả semi-nested RT-PCR có sự tồn tại
của TiLV trong dịch ly giải tế bào sau khi cảm
nhiễm ở cả hai mẫu VL160 và VL167 (Hình 5).
Điều này cho thấy hai chủng virus TiLV VL160
và VL167 đã được phân lập và bước đầu nuôi cấy
thành công. Tuy nhiên, tốc độ ly giải tế bào của hai
chủng này ngày càng chậm và yếu dần qua các đợt
cấy chuyền (Hình 6). Chủng VL160 vẫn ly giải
54

được tế bào E-11 qua 2 đợt cấy chuyền (P1, P2) và
không ly giải tế bào ở lần cấy chuyền thứ 3 (P3).
Trong khi đó, chủng VL167 chỉ ly giải tế bào trong
lần nuôi cấy đầu tiên (P1) và không tiếp tục ly giải
tế bào E-11 khi cấy chuyền lần 2 (P2). Bên cạnh
đó, dịch ni cấy virus P1 bảo quản ở -80oC của
cả 02 chủng mất khả năng ly giải tế bào sau khi rã
đông và ni cấy trong bình tế bào E-11 mới.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

Theo các nghiên cứu trước đây, việc cảm
nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu cá
nghi nhiễm TiLV cũng là một phương pháp
chẩn đốn TiLV có độ chính xác tương đương
phản ứng nested RT-PCR (Kembou Tsofack et
al., 2017). Nhiều dòng tế bào khác cũng đã được
dùng để nuôi cấy TiLV, như tế bào não cá rô
phi ban sơ (Eyngor et al., 2014a), OmB, TmB
(Kembou Tsofack et al., 2017), CFF (Behera et
al., 2018), OnlB, OnlL (Thangaraj et al., 2018).
Trong đó, Thangaraj và ctv. (2018) đã duy trì
thành cơng virus TiLV qua 20 đợt cấy chuyền
trên dòng tế bào não (OnlB) và gan (OnlL) của
cá rô phi. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu
trước đây đều chưa đề cập đến tỷ lệ mật độ virus
TiLV so với mật độ tế bào nuôi cấy để đảm bảo
quá trình ly giải xảy ra tốt nhất, và thời điểm thu
virus thích hợp nhất (dựa vào phần trăm tế bào
bị ly giải, trong khoảng 50 - 90%) trước khi cấy
chuyền để thu được lượng virus cao nhất.
Trong nghiên cứu hiện tại, hai mẫu cá
VL160 và VL167 đều có mức độ nhiễm TiLV

yếu (Hình 3), chỉ được phát hiện ở PCR bước
2 của quy trình semi-nested RT-PCR với vạch
mờ. Mặc dù, chủng TiLV ở hai mẫu này được
nuôi cấy thành công trên tế bào E-11, nhưng khi
cấy chuyền qua đợt hai và ba, nhóm nghiên cứu

nhận thấy hàm lượng virus có sự giảm sút dần
cho đến khi sự ly giải tế bào khơng xảy ra nữa.
Điều này có thể do hai nguyên nhân: một là, hai
chủng TiLV Việt Nam này có hoạt lực yếu nên
khơng duy trì được khả năng xâm nhiễm tế bào
qua các đợt cấy chuyền, vì mẫu TiLV-Thái Lan
đối chứng vẫn được cấy chuyền tốt qua nhiều
đợt (dữ liệu này khơng được trình bày trong
bài báo này); hai là, cần xác định thời điểm thu
virus thích hợp trước khi cấy chuyền vì TiLV
dường như khơng tồn tại được lâu trong môi
trường nuôi cấy khi thiếu tế bào để xâm nhiễm.
Do đó, quy trình ni cấy TiLV cần được tìm
hiểu và tối ưu hơn trong thời gian tới để lưu giữ
được chủng TiLV Việt Nam cho các nghiên cứu
sâu hơn sau này.

Hình 5. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các dịch nuôi cấy mẫu mô đồng nhất VL160-P1 và
VL167-P1 bằng quy trình semi-nested RT-PCR. M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+):
mẫu virus TiLV- RIA2.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

55


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 6. Thời gian ly giải 80-90% tế bào của các chủng TiLV VL160 (A) và VL167 (B) qua
các đợt cấy chuyền trong khoảng thời gian từ 01/07/2020 đến 31/07/2020. P: đợt cấy chuyền

(passage); dpi: số ngày sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào (day post infection).
V. KẾT LUẬN
Virus TiLV đã được phát hiện tại các quốc
gia trên thế giới, nhưng hiện có rất ít cơng bố
liên quan đến TiLV phân lập tại Việt Nam. Trong
nghiên cứu này, dù số lượng mẫu cịn ít và tập
56

trung tại hai tỉnh thành, nhưng kết quả chẩn đốn
TiLV cũng phản ánh phần nào tình trạng nhiễm
TiLV tại các trại nuôi cá rô phi tại khu vực phía
Nam. Cụ thể là, dịch bệnh do TiLV gây ra tại
đây chưa xuất hiện nhiều, chưa có tình trạng lây

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

lan rộng khắp trại cá, chưa ở mức nghiêm trọng,
có vẻ xảy ra theo mùa trong năm và phụ thuộc
vào các yếu tố môi trường (như nhiệt độ cao,
nước bị đục). Bên cạnh đó, nghiên cứu này đã
bước đầu tăng hiệu quả chẩn đốn của TiLV ở
các mẫu có mức độ nhiễm virus yếu với quy
trình semi-nested RT-PCR bằng cách sử dụng
cặp mồi Random hexamer/OligodT trong phản
ứng tổng hợp cDNA. Tuy nhiên, độ nhạy chính
xác của quy trình này cần được định lượng bằng
bộ mẫu chuẩn với số lượng bản sao TiLV khác

nhau. Việc phân lập và nuôi cấy TiLV bước đầu
thành công, nhưng cần phải tìm được mẫu cá
bệnh với mật độ TiLV nhiều hơn; đồng thời điều
chỉnh và tối ưu hóa thêm quy trình cấy chuyền
virus nhằm lưu trữ được nguồn TiLV Việt Nam
phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn sau này.
LỜI CẢM ƠN
Các kết quả nghiên cứu trong bài báo này
đều thuộc nhiệm vụ khoa học cơng nghệ “Phân
tích hệ gen phiên mã (transcriptome) của cá rô
phi đỏ (Oreochromis spp.) nhằm sàng lọc các
chỉ thị phân tử tiềm năng có liên quan đến tính
kháng virus TiLV (Tilapia Lake virus)” (Mã số:
TS01/19-21) do Sở Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn Tp. HCM cấp kinh phí.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt
Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản tỉnh Bình
Dương, 2017. Phịng, chống bệnh mới do Tilapia
lake virus (TiLV) trên cá rô phi tại Việt Nam.
Tại trang: />phong-chong-benh-moi-do-tilapia-lake-virustilv-tren-ca-ro-phi-tai-viet-nam-958.html (xem
ngày 31/12/2020).
Cục Thú y, 2017a. “Công văn số 8862/BNN-TY ngày
20/10/2017 về chỉ đạo áp dụng các biện pháp
cấp bách phòng, chống dịch bệnh mới do TiLV
gây ra trên cá rô phi”, Cục Thú y Việt Nam, Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Tại trang:
(xem ngày 11/01/2021).
Cục Thú y, 2017b. “Cơng văn số 1357/TY-TS về

hướng dẫn phịng, chống bệnh do TiLV trên cá
rô phi”. Cục Thú y Việt Nam, Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn. Tại trang: http://www.
cucthuy.gov.vn/Pages/cong-van-so-1357-ty-ts-vv-huong-dan-phong-chong-benh-do-tilv-tren-caro-phi-.aspx (xem ngày 11/01/2021).
Tài liệu tiếng Anh
Acharya, V., Chakraborty, H.C., Rout, A.K.,
Balabantaray, S., Behera, B.K. & Das, B.K.,
2019. “Structural Characterization of Open
Reading Frame-Encoded Functional Genes
from Tilapia Lake Virus (TiLV)”, Molecular
Biotechnology, 61, tr.945-957.
Bacharach, E., Mishra, N., Briese, T., Zody, M.
C., Kembou Tsofack, J. E., Zamostiano, R.,
Berkowitz, A., Ng., J., Nitido, A., Corvelo, A.,
Toussaint, N.C., Nielsen, S.C.A., Hornig, M.,
Pozo, J. D., Bloom, T., Ferguson, H., Eldar, A.
& Lipkin, W., I., 2016. “Characterization of a
Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass DieOffs of Tilapia”, MBio, 7(2), e00431-16.
Behera, B. K., Pradhan, P. K., Swaminathan, T. R.,
Sood, N., Paria, P., Das, A., Verma, D.K., Kumar,
R., Yadav, M.K., Dev, A.K., Parida, P.K., Das,
B.K., Lal, K.K. & Jena, J. K., 2018. “Emergence
of Tilapia Lake Virus associated with mortalities
of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus
(Linnaeus 1758) in India”, Aquaculture, 484,
tr.168–174.
Del-Pozo, J., Mishra, N., Kabuusu, R., Cheetham, S.,
Eldar, A., Bacharach, E., Lipkin, W.I. & Ferguson,
H. W., 2017. “Syncytial Hepatitis of Tilapia (

Oreochromis niloticus L.) is Associated With
Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes”,
Veterinary Pathology, 54(1), tr.164–170.
Dong, H.T., Siriroob, S., Meemetta, W.,
Santimanawong, W., Gangnonngiw, W.,
Pirarat, N., Khunrae, P., Rattanarojpong, T.,
Vanichviriyakit, R. & Senapin, S., 2017a.
“Emergence of tilapia lake virus in Thailand
and an alternative semi-nested RT-PCR for
detection”, Aquaculture, 476, tr.111–118.
Dong, H.T., Siriroo, S., Meemetta, W.,
Santimanawong, W., Gangnonngiw, W.,
Pirarat, N., Khunrae, K., Rattanarojpong, T.,
Vanichviriyakit, R., Senapin, S.11. Dong, H.T.,
Siriroo, S., Meemetta, W., Santimanawong, W.,
Gangnonngiw, W., Pirarat, N., Khunra, S., 2017b.
“A warning and an improved PCR detection
method for tilapia lake virus (TiLV) disease in
Thai tilapia farms”, Network of Aquaculture
Centres in Asia-Pacific. Retrieved from http://
www.enaca.org.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

57


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Dong, Ha Thanh, Senapin, S., Gangnonngiw, W.,
Nguyen, V. V., Rodkhum, C., Debnath, P. P.,

Delamare-Deboutteville, J. & Mohan, C. V., 2020.
“Experimental infection reveals transmission of
tilapia lake virus (TiLV) from tilapia broodstock
to their reproductive organs and fertilized eggs”,
Aquaculture, 515, tr.734541.
Eyngor, M., Zamostiano, R., Kembou Tsofack, J. E.,
Berkowitz, A., Bercovier, H., Tinman, S., Lev,
M., Hurvitz, A., Galeotti, M., Bacharach, E. &
Eldar, A., 2014a. “Identification of a Novel RNA
Virus Lethal to Tilapia”, Journal of Clinical
Microbiology, 52(12), tr.4137–4146.
Ferguson, H. W., Kabuusu, R., Beltran, S., Reyes,
E., Lince, J. A., & del Pozo, J., 2014. “Syncytial
hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus
(L.): a case report”, Journal of Fish Diseases,
37(6), tr.583–589.
Food and Agriculture Organization off the United
Nations (FAO), 2017. “Outbreaks of Tilapia
Lake Virus (TiLV) Threaten the Livelihoods and
Food Security of Millions of People Dependent
on Tilapia Farming”, FAO, Rome. Global
Information and Early Warning System (GIEWS)
Special Alert No. 338 - Global, 26 May 2017.
Retrieved from />card/en/c/3ce1da5b-%0A1529-4e7c-8b887adfef8d138c (available on 11/01/2021)
Jansen, M.D. & Mohan, C. V., 2017. “Tilapia lake
virus (TiLV): Literature review”. Penang,
Malaysia: CGIAR Research Program on Fish
Agri-Food Systems. Working Paper: FISH2017-04. Retrieved from: https://digitalarchive.
worldfishcenter.org/handle/20.500.12348/121
(available on 11/01/2021)

Jansen, M. D., Dong, H. T. & Mohan, C. V., 2019.
“Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia
industry?”, Reviews in Aquaculture, 11, tr.725–
739.
Kembou Tsofack, J. E., Zamostiano, R., Watted, S.,
Berkowitz, A., Rosenbluth, E., Mishra, N., Briese,
T., Lipkin, W.I., Kabuusu, R.M., Ferguson, H.,
del Pozo, J. & Bacharach, E., 2017. “Detection
of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by
Culturing and Nested Reverse TranscriptionPCR”, Journal of Clinical Microbiology, 55(3),
tr.759–767.
OIE, 2017a. “Hepatitis sincitial de la tilapia,
Israel”, Immediate Notification. Retrieved from
/>php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF

58

ullEventReport&reportid=23836 (available on
11/01/2021)
OIE, 2017b. “Tilapia Lake Virus (TiLV),
Philippines”, Immediate Notification. Retrieved
from />php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF
ullEventReport&reportid=31034 (available on
11/01/2021)
OIE, 2017c. “Tilapia Lake Virus (TiLV) – A Novel
Orthomyxo-Like Virus”, World Organisation for
Animal Health. Retrieved from .
int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_
Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf
(available on 11/01/2021)

OIE, 2017d. “Tilapia Lake Virus Disease, Chinese
Taipei”, Immediate Notification. Retrieved
from />php/Reviewreport/Review?reportid=24033
(available on 11/01/2021)
OIE, 2017e. “Tilapia Lake Virus Disease,
Malaysia”, Immediate Notification. Retrieved
from />php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF
ullEventReport&reportid=24809 (available on
11/01/2021)
OIE, 2017f. “Tilapia Lake Virus Disease, Thailand”,
Immediate Notification. Retrieved from https://
www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/
Reviewreport/Review?page_refer=MapEve
ntSummary&reportid=23832 (available on
11/01/2021)
OIE, 2018. “Tilapia Lake Virus, Peru”, Immediate
Notification. Retrieved from .
int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/
Review?page_refer=MapFullEventReport&repo
rtid=26027 (available on 11/01/2021)
Phusantisampan,
T.,
Tattiyapong,
P.,
Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., &
Surachetpong, W., 2019. “Rapid detection
of tilapia lake virus using a one-step reverse
transcription
loop-mediated
isothermal

amplification assay”, Aquaculture, 507, tr.35–39.
Surachetpong, W., Janetanakit, T., Nonthabenjawan,
N., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., &
Amonsin, A., 2017. “Outbreaks of Tilapia Lake
Virus Infection, Thailand, 2015-2016”, Emerging
Infectious Diseases, 23(6), tr.1031–1033.
Taengphu, S., Sangsuriya, P., Phiwsaiya, K., Debnath,
P. P., Delamare-Deboutteville, J., Mohan, C.
V., Dong, H.T. & Senapin, S., 2020. “Genetic
diversity of tilapia lake virus genome segment 1

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
from 2011 to 2019 and a newly validated seminested RT-PCR method”, Aquaculture, 526,
tr.735423.
Tattiyapong,
P.,
Dachavichitlead, W.,
&
Surachetpong, W., 2017. “Experimental
infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile
tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia
(Oreochromis spp.)”, Veterinary Microbiology,
207, tr.170–177.
Thangaraj, R. S., Ravi, C., Kumar, R., Dharmaratnam,
A., Valaparambil Saidmuhammed, B., Pradhan,
P. K., & Sood, N., 2018. “Derivation of two
tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for

efficient propagation of Tilapia Lake Virus

(TiLV)”, Aquaculture, 492, tr.206–214.
Waiyamitra, P., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K.,
Mongkolsuk, S., Nicholson, P., & Surachetpong,
W., 2018. “A TaqMan RT-qPCR assay for
tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia”,
Aquaculture, 497, tr.184–188.
Yin, J., Wang, Q., Wang, Y., Li, Y., Zeng, W., Wu, J.,
Ren, Y., Tang, Y., Gao, C., Hu, H. & Bergmann,
S. M., 2019. “Development of a simple and rapid
reverse transcription-loopmediated isothermal
amplification (RT-LAMP) assay for sensitive
detection of tilapia lake virus”, Journal of Fish
Diseases, 42(6), tr.817–824.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020

59


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

MODIFIED SEMI-NESTED RT-PCR DETECTING TILAPIA LAKE
VIRUS (TiLV) AND INITIAL ISOLATION OF TiLV VIRUS FROM
VIETNAMESE TILAPIA
Ngo Huynh Phuong Thao1*, Tran Hanh Triet1, Nguyen Hoang Thuy Vy1,
Le Thi Thu Thao1, Bui Nguyen Chi Hieu1, Tran Thi Thanh Huong1,
Nguyen Hoang Chi Mai2, Le Hoang The Huy3, Tran Nhut Linh4
ABSTRACT

Tilapia Lake virus has been recently identified both in natural and cultured tilapia. This research
is one of the first studies on TiLV isolates from Vietnam. During 2019-2020, 51 diseased tilapia
samples were collected in Ho Chi Minh city and Vinh Long. Semi-nested RT-PCR confirmed only
02 out of them (3.9%) as TiLV-positive. Culturing these two TiLV-positive tissues (VL160 and
VL167) on E-11 cell line provided good cytopathic effects. However, these virus samples did not
propagate in the second and third passage; thus, requiring an optimized procedure of subculturing
TiLV. Besides, the current study also modified the available semi-nested RT-PCR for detecting TiLV
to obtain a better amplification efficacy by replacing the specific primers with Random hexamer/
OligodT in the reaction of cDNA synthesis. Although the sensitivity and specificity of this modified
semi-nested RT-PCR needs further investigations on various RNA dilutions, this modified protocol
could be applied in diagnostic labs for better results of TiLV detection.
Keywords: Tilapia Lake virus, tilapia, semi-nested RT-PCR, E-11 cell line.

Người phản biện: TS. Nguyễn Ngọc Phước

Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước

Ngày nhận bài: 16/11/2020

Ngày nhận bài: 16/11/2020

Ngày thông qua phản biện: 20/12/2020

Ngày thông qua phản biện: 05/12/2020

Ngày duyệt đăng: 25/12/2020

Ngày duyệt đăng: 25/12/2020

Biotechnology Center of Ho Chi Minh City

University of Science, Vietnam National University Ho Chi Minh City
3
Nguyen Tat Thanh University
4
International University, Vietnam National University Ho Chi Minh City
* Email: ;
1
2

60

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020