Nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

LÊ QUỐC PHONG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO
SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh - Năm 2021


Cơng trình được hồn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TSKH. NGÔ KẾ SƯƠNG

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học

viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …, ngày … tháng … năm 202….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Nấm Đơng trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (C. sinensis) là
loài nấm dược liệu quý hiếm hiện nay. Chúng chứa nhiều hoạt chất
đáng quý như adenosine, cordycepin, polysaccharide, β -glucan và
nhiều loại vitamin khoáng chất khác. Những nghiên cứu trước đây
cho thấy C. sinensis có nhiều tác dụng như tăng cường miễn dịch,
chống lão hóa, kháng viêm, cũng như hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan
đến phổi, thận, các bệnh mãn tính như đái tháo đường, gout, hoặc ung
thư.
Hiện nay, sản lượng C. sinensis thu hái tự nhiên ngày càng
khan hiếm do đó, nuôi cấy nhân tạo nấm trên môi trường lỏng hoặc
bán rắn là điều cần thiết. Ngồi những nghiên cứu thơng thường, trong
qua trình ni cấy có thể bổ sung thêm các tiền chất nhằm nâng cao
chất lượng nấm hoặc thu được những hợp chất thứ cấp có hoạt tính
cao rất được quan tâm. Trong đó, một trong những nguyên tố vi lượng
đang được nghiên cứu nhiều hiện nay là selen (Se).
Selen là nguyên tố tham gia vào cấu trúc của acid amin thứ 21
- selenocysteine, ngồi ra chúng cịn tham gia vào nhiều cấu trúc
enzyme kháng oxy hóa quan trọng của cơ thể như glutathione
peroxidase (GPx), iodothyronine deiodinases (DIOs), thioredoxin

reductase (Txnrd),… hơn nữa, chúng cịn có vai trị quan trọng đối với
hệ miễn dịch cũng như các bệnh liên quan đến tim mạch, cơ xương.
Tuy nhiên, ở dạng vô cơ Se lại có độc tính với con người, vì vậy để
chuyển hóa thành dạng hữu cơ có khả dụng sinh học cao, nấm C.
sinensis được sử dụng để có thể chuyển hóa Se từ dạng vơ cơ trong


2
mơi trường thành dạng hữu cơ tích lũy trong cơ thể nấm, từ đó có thể
nâng cao giá trị của loài nấm dược liệu này.
Hơn thế nữa, tại Việt Nam, từ năm 1965 đã có nghiên cứu về
Se trong nguyên liệu làm thuốc Đông Y. Năm 2003 – 2005, Bộ Y tế
khuyến khích và định hướng những nghiên cứu tìm nguồn Se từ cây
cỏ để làm thuốc. Một số dược liệu chứa Se ở nước ta như: tỏi, nấm
linh chi và quả nhàu được khuyến khích sản xuất để sử dụng làm thực
phẩm chức năng… nhưng hàm lượng không ổn định. Một số nghiên
cứu về hàm lượng Se trong cơ thể cho thấy sự thiếu hụt của Se đáng
kể. Từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men
Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh
học” được thực hiện.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh
học được cải thiện và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
Nội dung 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của selen lên khả năng
sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis
Nội dung 2: Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện ni cấy sản
xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen
Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính sinh học của sinh khối nấm
Cordyceps sinensis giàu selen

3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nấm Cordyceps sinensis
Cordyceps sinensis là lồi nấm kí sinh trên ấu trùng lồi bướm
đêm Thitarodes (Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống
dưới đất. Đây là loài nấm đặc hữu của vùng cao nguyên Tây Tạng và
các vùng đồng cỏ núi cao xung quanh khu vực dãy Himalaya như
Bhutan, Trung Quốc và Nepal ở độ cao 3500-5000 m so với mực nước
biển. Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được ghi nhận cách đây
2000 năm ở Trung Quốc cũng như các nước phương Đông với những
tác dụng như cải thiện chức năng gan thận, đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu
đường, máu nhiễm mỡ, hồi phục sức khỏe, các bệnh về tim, tăng tuổi
thọ và nâng cao thể trạng cơ thể.
1.2 Selen và vai trò sinh học của selen
Se được Jacob Berzelius Jöns phát hiện năm 1817 trong chất
thải của quá trình khai thác quặng pyrit. Trong đất, Se tồn tại chủ yếu
ở dạng selenite (Se+4) và selenate (Se+6), một lượng nhỏ dạng hữu cơ
do hoạt động của vi sinh vật và thực vật tạo ra.
Hiện nay, 25 gen mã hóa seleno-protein đã được xác định ở
genome người. Selenoprotein có những chức năng khác nhau, bao
gồm hoạt tính kháng oxy hóa, chức năng miễn dịch, sự trao đổi chất
hormon tuyến giáp, vận chuyển và cân bằng nội môi Se và trao đổi
chất ở xương và cơ tim.
1.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps
Do nhu cầu sử dụng Cordyceps ngày càng lớn nên số lượng
thu thập ngoài tự nhiên ngày càng hạn chế. Chính vì vậy, để duy trì
nguồn dược liệu quý hiếm này, các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu

4
ni cấy nhân tạo nấm Cordyceps mang lại lợi ích lâu dài cho con
người. Hiện nay, ni cấy Cordyceps có thể tiến hành theo hai phương
pháp là nuôi cấy lỏng và bán rắn.
Để tăng hoạt tính của C. sinensis cũng như giúp bổ sung lượng
Se cần thiết cho cơ thể, chiến lược nuôi cấy làm giàu Se hữu cơ đã
được các nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, khi bổ sung Se ở nồng
độ cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm, vì vậy, những nghiên
cứu về khả năng thích nghi, tối ưu thành phần và điều kiện mơi trường
ni cấy là vấn đề cấp thiết. Ngồi ra, tối ưu hóa mơi trường và điều
kiện ni cấy bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) cũng đã được
nghiên cứu áp dụng để nâng cao sinh khối và tích lũy Se qua đánh giá
sự tương tác giữa các yếu tố để tìm được điểm cực trị hoặc vùng tối
ưu cho thí nghiệm. Phương pháp này cịn giúp tiết kiệm tối đa thời
gian và công sức so với phương pháp tối ưu kinh điển.


5
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 được cung cấp bởi
TS. Trương Bình Nguyên, Viện nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp
công nghệ cao, Trường Đại học Đà Lạt, Lâm Đồng.
Hóa chất phân tích được cung cấp bởi các hãng Sigma Aldrich,
Fisher Scientific, các hóa chất cho ni cấy được cung cấp bởi các
hãng tại Việt Nam.
Thiết bị: Nồi hấp Jibimed (Trung Quốc); Tủ cấy Shinsaeng
(Hàn Quốc); Máy quang phổ Phoenix (Đức); Hệ thống ICP-MS

Agilent 7700x (Mỹ); Kính hiển vi (Trung Quốc); Máy đo độ ẩm AND
MX–50 (Nhật Bản); Tủ sấy MEMMERT (Đức); Máy đo pH HANNA
(Romania); Máy ly tâm Micro 17R (Đức); Cân kỹ thuật PioneerTM
Ohaus (Mỹ); Hệ thống NexION 350X Perkin Elmer (Mỹ); Bể điều
nhiệt Julabo F34 (Đức).
2.2 Phương pháp
2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến sinh trưởng hệ sợi C.
sinensis trên môi trường PGA và môi trường lỏng PS
2.2.1.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường
PGA
Nghiên cứu được tiến hành trên môi trường PGA. Sau đó, bổ
sung muối selenite Se+4 (Na2SeO3.5H2O) và selenate Se+6
(Na2SeO4.12H2O) và selenourea (SeC(NH2)2) với các nồng độ từ 5 40 mgSe/L và đổ vào các đĩa petri. Theo dõi tốc độ lan tơ của sợi nấm


6
ở các thời điểm 5, 10, 15 ngày và xác định đường kính sợi nấm qua
kính trắc vi thị kính.
2.2.1.2. Khảo sát sự ảnh hướng của Se đến C. sinensis trên môi trường
lỏng PS
Nghiên cứu được tiến hành trên môi trường lỏng PS. Sau đó,
bổ sung muối selenite (Se+4), selenate (Se+6) và selenourea với nồng
độ 5, 10, 15, 20, 15, 30 mgSe/L. Nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2 °C, theo dõi
trong 40 ngày. Thu sinh khối, sấy khô và phân tích Se.
2.2.2. Phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến
Sử dụng loại muối Se đã chọn ở thí nghiệm 2.2.1 và tiến hành
qua các nồng độ từ 0 đến 25 mgSe/L nđể nấm có thể thích ứng dần.
2.2.3. Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện ni cấy Cordyceps
sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen
2.2.3.1 Sàng lọc thành phần môi trường bằng thiết kế Plackett –

Burman
Sử dụng thiết kế Plackett-Burman để sàng lọc các thơng số
chính trong một số lượng lớn các yếu tố của quá trình tối ưu. Sàng lọc
thành phần môi trường ảnh hưởng đến tổng hợp được tiến hành ở 2
mức (-1 và +1). Các nghiệm thức thiết kế theo Plackett – Burman với
các yếu tố được lựa chọn là khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm
men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 được liệt kê trong bảng 2.3, trong đó
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 là các biến độc lập. Bố trí 12 thí nghiệm
như bảng 2.4. Sinh khối thu nhận, sấy khô ở 60 °C và phân tích Se.
2.2.3.2. Tối ưu hóa bằng đáp ứng bề mặt Box -Behnken
Dựa vào kết quả của thí nghiệm sàng lọc, mơ hình Box –
Behnken được sử dụng để tối ưu hóa mơi trường ni cấy nấm C.


7
sinensis giàu Se. Mơ hình thực hiện ở 3 mức (-1, 0 và +1) với 17 thí
nghiệm. Sinh khối thu nhận, sấy khơ ở 60 °C và phân tích Se. Hàm
đáp ứng được chọn là sinh khối (g/L) hoặc hàm lượng Se (µg/g), mơ
hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc hai:
Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 +
B23X2X3 + B11X12 + B22X22 + B33X32.
Trong đó, B1, B2, B3 là các hệ số bậc 1; B11, B22 và B33 là
hệ số bậc 2; B12, B23 và B13 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu
tố; X1, X2, X3 là các biến độc lập.
2.2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy bằng đáp ứng bề mặt D-optimal
Tiến hành tối ưu hóa mơi trường bằng D-optimal ở 3 mức (1, 0 và +1). Chuẩn bị môi trường (2L): theo các nghiệm thức được
thiết kế theo D-optimal và được lặp lại 3 lần.
2.2.4. Phương pháp thu nhận cao chiết
Sinh khối nấm được chiết ngấm kiệt với EtOH 96% theo tỷ tệ
1:10 trong 48 giờ. Cô quay chân không để đuổi EtOH thu lấy cao

EtOH thô (cao tổng). Cao EtOH thô tiếp tục được phân đoạn bằng kỹ
thuật chiết lỏng – lỏng lần lượt qua các dung môi PE – EtOAc – Bu –
H2O.
Bã nguyên liệu sau khi chiết ngấm kiệt đem đi sấy khô. Sau
đó chiết với nước nóng ở 65 °C, lọc lấy dịch chiết. Sấy khô mẫu ở 50
°C, bảo quản mẫu trong tủ lạnh. Cao chiết polysaccharide từ bã (CPS)
được thu nhận.
Dịch nuôi cấy nấm C. sinensis được cô đặc, tủa với ethanol
lạnh 96% theo tỷ lệ 1 dịch : 5 ethanol (v/v), trong 24h ở 4 °C, loại bỏ


8
dịch nổi, thu tủa và rửa tủa với ethanol 96%. Sấy khô tủa trong 48h
thu được EPS.
Sinh khối bột nấm được chiết với 20mL NaOH 0,4M ở 60°C.
Dịch được cô đặc giảm thể tích bằng máy cơ quay chân khơng ở 60°C.
Bổ sung ethanol lạnh 96% vào dịch chiết theo tỉ lệ (ethanol:dịch = 5:
1, v/v), giữ qua đêm ở 4°C, thu tủa. Chuyển vào màng thẩm tách 1 - 2
kDa, thẩm tách với nước cất trong 24h. Mẫu được sấy khô trong 24h
và bảo quản trong chai tối màu ở 4°C.
2.2.5. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết
2.2.5.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS
Mẫu cao chiết được tiến hành phản ứng với dung dịch ABTS
trong đệm PBS pH 7,4, trong tối 30 phút, Sau đó tiến hành đo OD
734nm và đánh giá khả năng bắt gốc tự do.
2.2.5.2 Khả năng bắt gốc tự do DPPH
Mẫu cao chiết được tiến hành phản ứng với dung dịch DPPH
trong methanol 80%, trong tối 30 phút, Sau đó tiến hành đo OD 517
nm và đánh giá khả năng bắt gốc tự do.
2.2.5.3 Xác định năng lực khử

Mẫu cao chiết được tiến hành phản ứng với dung dịch
K3[Fe(CN)6]) 1% trong đệm phosphate 0,2 M pH 6,0 trong 50 phút,
Sau đó thêm dung dịch TCA 10%, lắc đều. Thêm FeCl3 1%. Đo mật
độ quang ở bước sóng 700 nm.
2.2.5.4. Xác định khả năng bảo vệ DNA
Phương pháp này đánh giá khả năng bảo vệ DNA trước sự tấn
công của gốc OH tự do tạo ra từ phản ứng fenton. Tạo hỗn hợp phản
ứng bằng cách cho 4 µL DNA, 1 µL cao chiết, 1 µL H2O2 1M và 1 µL


9
FeSO4 140 mM. Ủ 20 phút, bổ sung 1 µL EDTA 0,5M. Đọc kết quả
điện di trên gel agarose 1,5%, 100V, 15 phút
2.2.5.5. Hoạt tính ức chế xanthine oxidase
Hoạt tính được tiến hành đánh giá theo phương pháp của
Nguyên và cs (2004).
2.2.5.6. Đánh giá hoạt tính kháng viêm
Thực hiện dựa trên phương pháp của Trần Quốc Tuấn và cs
(2014).
2.2.5.7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase
Thực hiện quy trình khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase
nấm men được tham khảo theo quy trình của Vũ Thị Bạch Phượng.
2.2.5.8. Khảo sát khả năng gây độc tế bào
Thử nghiệm độc tính SRB (Sulforhodamin B assay) được thực
hiện theo quy trình của Nguyen, TMN và cs (2017). Thí nghiệm được
thực hiện tại Phịng thí nghiệm Di truyền – SHPT, Trường ĐH Khoa
học Tự nhiên, TP.HCM
2.2.6. Định lượng selen trong nấm Cordyceps sinensis
2.2.6.1. Phân tích selen tổng
Thí nghiệm được thực hiện tại Phịng Thí nghiệm Hóa phân

tích, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG, TP.HCM bằng phương
pháp HPLC- ICP-MS.
2.2.6.2 Phân tích selen ngun dạng
Quy trình phân tích được tham khảo theo Gergely và cs
(2006).
2.2.6.3. Xác định các nhóm chức bằng phân tích FT-IR


10
Thí nghiệm này được thực hiện tại Viện Cơng nghệ Hóa học,
TP.HCM
2.2.7. Thử nghiệm độc tính cấp của sinh khối nấm Cordyceps
sinensis giàu selen
Khảo sát độc tính cấp bằng đường uống cao chiết theo phương
pháp của Bộ Y tế.
2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thể hiện dưới dạng trung bình độ lệch ch̉n, các
thí nghiệm nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý thống kê bằng
phần mềm IBM SPSS Statistics 20.0, Design Expert® 7.0 Stat-Ease.


11
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của selen đến sự sinh trưởng của nấm Cordyceps
sinensis
3.1.1. Ảnh hưởng của dạng và nồng độ selen đến sự sinh trưởng của
hệ sợi nấm Cordyceps sinensis
Đối với Se+4, khi C. sinensis khảo sát ở nồng độ Se thấp từ 5
- 25 mg Se/L thì khả năng lan tơ khơng có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với đối chứng ở thời điểm 15 ngày. Tuy nhiên, sự phát

triển của tơ nấm bắt đầu bị ức chế khi nồng độ Se+4 > 25 mg/L.
Trong khi đó, đường kính kh̉n lạc của nấm C. sinensis trên
môi trường chứa Se+6 từ 5 - 40 mgSe/L thì khơng có sự khác biệt so
với môi trường đối chứng. Đối với selenourea, sự lan tơ của nấm bị
ảnh hưởng nhiều bởi selenourea và giảm dần khi tăng nồng độ
selenourea từ 5 – 40mgSe/L, khi tăng lên nồng độ 35, 40mgSe/L sự
phát triển của nấm hầu như bị ức chế hồn tồn.
Qua thí nghiệm này cho thấy, C. sinensis có khả năng thích
nghi tốt hơn trên môi trường Se+6 so với Se+4. Kết quả này đưa ra
những nhận định ban đầu, Se+4 có độc tính cao hơn so với Se+6 trong
q trình ni cấy C. sinensis. Tuy nhiên, nhằm đánh giá rõ hơn, chúng
tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của Se vô cơ đến sự sinh trưởng hệ sợi
của C. sinensis trên môi trường nuôi cấy lỏng.
3.1.2. Ảnh hưởng của selen đến sản xuất sinh khối của nấm
Cordyceps sinensis
Dựa vào một số kết quả như hình thái và kích thước sợi nấm,
hiệu suất sinh khối và hàm lượng Se tích lũy trong sinh khối, Se+6 vẫn
thể hiện những đặc tính tốt hơn Se+4, đặc biệt về hiệu suất sinh khối.


12
Thành phần Se có trong sinh khối nhằm đánh giá khả năng
tích lũy Se của sợi nấm C. sinensis trong q trình ni cấy có bổ sung
hai loại Se+4 và Se+6. Nhìn chung, lượng Se tích lũy trong sinh khối
nấm C. sinensis tăng dần tương ứng với mơi trường có chứa Se từ 0 30 mg/L (hình 3.2).

Hình 3.2. (A) Sự phát triển của sinh khối nấm Cordyceps
sinensis trên môi trường lỏng có bổ sung selenite và selenate ở nồng
độ 30 mgSe/L sau 40 ngày. (B) Sinh khối nấm Cordyceps sinensis
trên môi trường lỏng bổ sung selen từ 0 – 30 mgSe/L sau 40 ngày.

13
Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure. Chữ cái
trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm
thức trong từng loại selen với giá trị α = 0,05.
Do vậy trong nghiên cứu này, ngưỡng Se 25 mg/L Se+6 là nồng
độ Se thích hợp nhất cho sự phát triển và sản xuất sinh khối của nấm
C. sinensis.
3.1.3 Về khả năng nâng cao phát triển và sản xuất sinh khối của
nấm Cordyceps sinensis trên mơi trường bổ sung selenate bằng
phương pháp ni cấy thích nghi cải tiến
Nấm C. sinensis nuôi cấy theo phương pháp cải tiến (PP2) có
hiệu suất sinh khối đạt cao hơn so với nấm nuôi cấy theo phương pháp
truyền thống (PP1) (Hình 3.3). Sợi nấm PP2 mọc đều, dày và phủ kín
bề mặt hộp, trong khi sợi nấm PP1 mọc yếu, chưa phủ kín bề mặt và
rất mỏng. Hàm lượng sinh khối thu được từ PP2 đạt 17,31 ± 1,12g/L
cao gấp 1,2 lần so với PP1 chỉ đạt 14,52 ± 0,82g/L (p < 0,05). So với
đối chứng, sinh khối PP2 giảm khoảng 16%, trong khi PP1 giảm gần
30% (hình 3.3). Qua đó nhận thấy, PP2 cải thiện được gần 50% khả
năng sản xuất sinh khối so với PP1.
Đối với sự tích lũy Se giữa PP2 và PP1, hàm lượng Se trong
sinh khối PP2 thấp hơn so với trong sinh khối PP1, tương ứng là
1354,97 ± 54,54µg/g và 1644,83 ± 116,45µg/g. Tuy nhiên, tổng Se có
trong sinh khối ở PP2 tương đương so với ở PP1 (23454,53 và
23882,93µg Se tương ứng). Qua kết quả này nhận thấy PP2 đã nâng
cao khả năng sản xuất sinh khối của nấm trên môi trường giàu Se.
Phân tích hàm lượng selen nguyên dạng bằng phương pháp
HPLC-ICP/MS cho thấy, sinh khối nấm nuôi bằng phương pháp cải
tiến (PP2) có chứa selenate (Se+6) cao nhất với hàm lượng 991,9 µg/g,

14
sau đó là selenomethionine (SE-MET) (383,9 µg/g). Một lượng nhỏ
selenocystine (SE-CYS2) cũng được phát hiện trong sinh khối của
PP2. Trong khi đó, đối với sinh khối ni theo phương pháp truyền
thống (PP1), SE-MET là dạng selen nguyên dạng được tích lũy cao
nhất với 645,6 µg/g, kế tiếp là SE-CYS2 (93,5 µg/g).

Hình 3.3. (A) So sánh sự sản xuất sinh khối (cột) và hấp thụ selen
(đường gạch nối) bởi nấm Cordyceps sinensis giữa hai phương pháp
nuôi cấy truyền thống và cải tiến sau 40 ngày. Đối chứng: nấm được
nuôi cấy bằng phương pháp truyền thống không bổ sung selen; PP1
và PP2: nấm được nuôi cấy bằng phương pháp truyền thống và cải
tiến tương ứng có bổ sung selen. Nguồn selen sử dụng là selenate với
nồng độ bổ sung 25mgSe/L. (B) Hình thái sợi nấm phát triển trên


15
môi trường thạch sau 14 ngày và (C) sự sản xuất sinh khối của nấm
trên môi trường lỏng theo các nghiệm thức tương ứng sau 40 ngày.
3.2. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để nâng cao
chuyển hóa selen trong sinh khối nấm Cordyceps sinensis
Từ kết quả sàng lọc bằng Plackett – Burman, chúng tôi nhận
thấy saccharose, peptone, khoai tây và KH2PO4 là những yếu tố ảnh
hưởng mạnh đến khả năng sản xuất sinh khối. Kết quả này tạo tiền đề
tối ưu môi trường nuôi cấy theo phương pháp đáp ứng bề mặt Box Behnken.
Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường
đến khả năng tích lũy Se bằng mơ hình Plackett - Burman cho thấy mơ
hình khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, những thành phần

môi trường trong nuôi cấy gồm khoai tây, saccharose, peptone, cao
nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 khơng ảnh hưởng nhiều đến sự
tích lũy Se trong sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis.
3.2.1 Tối ưu hóa thành phần mơi trường
Sau khi phân tích các số liệu của mơ hình Box – Behnken, sử
dụng phần mềm DE để dự đốn thành phần mơi trường tối ưu cho sự
phát triển của nấm C. sinensis. Thông số được đưa ra như sau:
saccharose 53,48 g/L, peptone 11,17 g/L, KH2PO4 1,05 g/L với trọng
lượng sinh khối nấm C. sinensis và lượng Se tổng tích lũy dự đốn đạt
25,35 g/L và 24343,86 µg (khoảng 960,31 µg/g).
Sau đó, đã tiến hành kiểm tra thực nghiệm cơng thức mơi
trường do mơ hình Box – Behnken dự đốn. Kết quả thu được cho
thấy mơ hình tối ưu hóa mơi trường ni cấy đã được thực hiện thành
công.


16
Tóm lại, mơi trường tối ưu cho ni cấy C. sinensis thu sinh
khối giàu Se theo mơ hình Box - Behnken gồm khoai tây 200 g/L,
saccharose 53,48 g/L, cao nấm men 4 g/L, peptone 11,17 g/L, KH2PO4
1,05 g/L, K2HPO4 0,5 g/L, MgCl2 0,1 g/L cho phép thu được 24,93
g/L sinh khối C. sinensis và lượng Se tổng tích lũy đạt 26.400,87 µg
(1059 µg/g).
3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy
Dựa vào các phân tích, mơ hình D-optimal đưa ra điều kiện
nuôi cấy tối ưu cho nấm C. sinensis giàu Se như sau: nhiệt độ 20 °C,
ánh sáng trắng, pH 6,1 với điều kiện này, trọng lượng sinh khối và
hàm lượng Se theo mơ hình dự đốn đạt được lần lượt 24,79 g/L và
1097 µg/g. Sau đó chúng tơi tiến hành nuôi kiểm chứng tại điều kiện
như trên và thu được sinh khối 26,45 g/L và hàm lượng Se đạt 1068

µg/g Tuy nhiên, điều kiện nuôi cấy không ảnh hưởng rõ rệt đến hàm
lượng Se trong sinh khối, có thể ngưỡng chuyển hóa của C. sinensis
chỉ đạt khoảng 1000 - 1200 µg/g.
3.3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong
nấm Cordyceps sinensis
Hiệu suất chiết cao khác nhau ở từng phân đoạn cho thấy sinh
khối nấm C. sinensis giàu selen và nhóm C. sinensis đối chứng có hàm
lượng các hợp chất có sự khác biệt giữa các phân đoạn cao. Các cao
chiết đều có chứa selen, tuy nhiên hàm lượng selen chủ yếu tập trung
ở nhóm các cao chiết phân cực cao, đặt biệt là các cao chiết có chứa
polysaccharide.


17

3.4 Về hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen
3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa in vitro
Nhìn chung, hoạt tính bắt gốc tự do ABTS của C. sinensis giàu
Se cao hơn nhóm ĐC. Đặc biệt, cao EtOAc thể hiện hoạt tính cao nhất
(IC50 = 2026 ± 23,45µg/mL).
Tương tự với khả năng bắt gốc tự do ABTS, cao EtOAc thể
hiện hoạt tính cao nhất, đặc biệt với ở nấm giàu Se với giá trị IC50 là
1.200 ± 69,5µg/mL so với nấm đối chứng 1.598 ± 17,5µg/mL.
Ở nấm C. sinensis giàu Se, cao chiết có năng lực khử cao nhất
là cao EtOAc (0,137) và cao tổng (0,120) tiếp theo là cao nước, cao
Bu, cao CPS, IPS, EPS và cao PE. Ở nhóm ĐC thứ tự năng lực khử
giảm dần theo thứ tự cao tổng > cao nước > cao EtOAc > cao Bu >
EPS, IPS > CPS > cao PE. Nhìn chung, cao EtOAc, cao tổng đều thể
hiện hoạt tính tốt và cao PE cho thấy hoạt tính thấp nhất.
3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bảo vệ tính nguyên

vẹn của DNA
Kết quả này cho thấy tất cả các cao chiết, IPS và EPS đều có
khả năng bảo vệ sự nguyên vẹn của DNA ở nồng độ 1500 µg/mL, khi
giảm dần nồng độ cao chiết từ 1500 xuống 1000 và 500 (µg/mL) mức
độ nguyên vẹn của DNA cũng giảm theo ở một số mẫu cao. Cụ thể, ở
cao EtOAc và cao Bu, nước ở nấm C. sinensis giàu Se đều có hoạt tính
rất tốt, mức độ ngun vẹn DNA tương đương với mẫu 0, (tại nồng độ
500 µg/mL) và cao hơn ĐC. Trong khi đó, cao tổng, IPS, cao PE, cao


18
CPS có mức độ tồn vẹn DNA khá thấp, DNA bị phân mảnh nhiều
(hình 3.12).

Hình 3.12. Kết quả bảo vệ DNA của các mẫu cao chiết; A, C: Kết
quả vạch điện di; B, D kết quả ở định dạng 3D; (+): Mẫu DNA
ngun vẹn; (-): Mẫu chứng âm (khơng có chất bảo vệ); Nồng độ
tương ứng với mỗi cao từ trái qua phải: 1500µg/mL-1000µg/mL500µg/mL
3.4.3 Khả năng ức chế xanthine oxidase
Kết quả trên cho thấy việc bổ sung Se làm gia tăng đáng kể
hoạt tính ức chế enzyme XO của nấm C. sinensis ở một số phân đoạn
như cao PE; cao BuOH với IC50 lần lượt 2558,49 ± 208,54, 3017,41 ±
195,25 (µg/mL). Ở cả hai nhóm nấm, cao có khả năng ức chế XO cao
nhất là cao EA với giá trị IC50 lần lượt 1979,96 ± 225,73, 1938,13 ±
165,40 (µg/mL) ở 2 mẫu giàu Se và ĐC.
3.4.5. Hoạt tính kháng viêm in vitro


19
Hầu hết các cao có hoạt tính kháng viêm ở nấm C. sinensis

giàu Se đều có giá trị IC50 thấp hơn so với ĐC, điều này cho thấy bổ
sung Se tăng cường hoạt tính kháng viêm của nấm. Ở các cao tổng,
PE, EtOAc, CPS, IPS ở C. sinensis giàu Se đều có hoạt tính tốt hơn so
với các cao của mẫu nấm ĐC (p > 0,05), cụ thể, cao tổng gấp 4,4 lần,
cao PE gấp 3,1 lần, cao EtOAc gấp 1,72 lần (các mẫu CPS, IPS ĐC
IC50 >1500 µg/mL nên không xác định). Trong khoảng nồng độ khảo
sát các cao như cao Bu, cao nước ức chế biến tính bé hơn 50% nên
không xác định được giá trị IC50. Đối với các mẫu cao, cao PE thể hiện
hoạt tính tốt nhất với (IC50 = 64,19 ± 0,22 µg/mL), tiếp theo là cao
tổng (195,58 ± 7,89 µg/mL), cao EtOAc (469,27 ± 16,57 µg/mL), cao
CPS (1259,28 ± 46,20 µg/mL) và IPS (1280,33 ± 135,22 µg/mL).
3.4.6. Hoạt tính ức chế α–glucosidase
Ở nấm C. sinensis giàu Se cho thấy phần trăm ức chế enzyme
tăng dần theo nồng độ khảo sát nhưng giá trị này nhỏ hơn 50% nên
khơng tính được giá trị IC50 nên chúng tôi quan sát dựa vào bảng số
liệu phần trăm ức chế enzyme và nhận thấy có giá trị âm xuất hiện ở
nồng độ 50 và 500 µg/mL, phần trăm ức chế enzyme cao nhất là ở cao
EtOAc đạt 23,76% tại nồng độ 5000 µg/mL và cao hơn ĐC 12,8%).
Đối với nấm C. sinensis ĐC ta thấy giá trị âm xuất hiện nhiều hơn, ở
một số cao như cao EtOH phần trăm ức chế enzyme giảm dần theo
nồng độ khảo sát, giá trị phần trăm ức chế enzyme cao nhất vẫn nằm
ở cao EtOAc ở nồng độ 5000 µg/mL đạt 12,8%.
3.4.7. Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư
Kết quả cho thấy cao chiết nấm C. sinensis giàu Se và ĐC đều
có khả năng gây độc tế bào MCF7, cụ thể ở cao EtOH, PE và EtOAc,
ở mẫu ĐC có thêm cao BuOH (Hình 3.14). Đối với cao EtOH, khi bổ


20
sung Se giá trị IC50 thấp hơn 1,57 lần so với ĐC (p < 0,05). Tương tự

ở cao EtOAc, hoạt tính ở nấm giàu Se cũng rất tốt với IC50 = 3,82 ±
0,12g/mL cao hơn mẫu ĐC 7,59 lần, điều này cho thấy Se có tác
động cộng gộp làm tăng họat tính của mẫu cao này (hình 3.14).
Mặc dù các mẫu cao chiết không xác định được giá trị IC50
song so với thử nghiệm trên dòng tế bào MCF-7 kết quả cũng có điểm
tương đồng, cao EtOH, PE, EtOAc cũng cho hoạt tính gây độc cao
nhất với khả năng gây độc lần lượt 36,87; 37,11; 7,85 (%). Ngoài ra,
EPS từ nấm C. sinensis giàu Se cũng cho thấy khả năng gây độc tế bào
với 15,06 ± 7,12% ở nồng độ 100µg/mL.
120

100

IC50 (µg/mL)

80

60
a

a

40

a

a
b

20

b

0
EtOAc

EtOH
ĐC

PE

BuOH

Se

Hình 3.14. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF7. Giá trị IC50 càng
thấp thể hiện hoạt tính càng cao. IC50 là nồng độ cao chiết tại đó 50%
tế bào MCF7 bị chết. Chữ cái khác nhau trên mỗi cột thể hiện sự
khác biệt về mặt thống kế trong mỗi cao chiết tại giá trị α = 0,05


21

3.5 Đề xuất quy trình ni cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis
giàu selen
3.5.1 Đánh giá độc tính cấp
Liều 2500mg/kg là liều đậm đặc nhất có thể dung nạp được
cho chuột nhắt trắng thông qua đường uống bằng kim cho uống chun
dụng. Kết quả cho thấy khơng có hiện tượng gây chết động vật thử
nghiệm, khơng có triệu chứng bất thường sau 1 giờ, 24 giờ sau khi cho
uống. Chuột ở 2 lơ thử nghiệm vẫn ăn uống, hoạt động bình thường,

phân và nước tiểu khơng có gì bất thường, quan sát thêm đến 7 ngày
và 14 ngày chuột vẫn hoạt động bình thường, ăn khỏe, tăng thể trọng.
3.5.2 Đánh giá các chỉ tiêu an toàn thực phẩm
Bên cạnh việc thử độc tính cấp, các chỉ tiêu an tồn thực phẩm
được tiến hành theo các tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT, QCVN 82:2011/BYT, 46/2007/QĐ-BYT để đảm bảo chất lượng sản phẩm của
nấm C. sinensis, từ đó làm tiền đề để xây dựng quy trình cơng nghệ
sản xuất C. sinensis giàu Se hữu cơ (hình 3.16).


22

Hình 3.16. Quy trình cơng nghệ ni cấy nấm C. sinensis giàu Se


23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu thu được có thể rút ra được một
số kết luận sau đây:
1. Trong 3 loại muối Se: selenite, selenate và selenourea dùng trong
nuôi cấy C. sinensis, muối selenate nồng độ 25mgSe/L phù hợp
cho qui trình ni cấy thu sinh khối hệ sợi C. sinensis giàu selen.
2. Xác định được thành phần và điều kiện tối ưu nuôi cấy thu sinh
khối hệ sợi nấm C. sinensis giàu Se như sau: môi trường nuôi cấy
gồm: khoai tây 200g/L, saccharose 53,48g/L, cao nấm men 4g/L,
peptone 11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L, K2HPO4 0,5g/L, MgCl2
0,1g/L; muối selenate 25 mg/L và ở các điều kiện tối ưu là: nhiệt
độ 20°C, ánh sáng trắng, pH 6,1. Hiệu suất sinh khối đạt được
26,45 g/L và hàm lượng Se tổng khoảng 1068 µgSe/g sinh khối.
3. Đã xác minh được một số dạng selen hữu cơ chuyển hóa từ
selenate trong sinh khối: selenomethylcystein 0,6µgSe/g,

selenomethionine 383,9µgSe/g, selenocystamine 3,2µgSe/g và
selenocystine 85,6µgSe/g. Selen cũng được tích lũy ở các cao
chiết polysaccharide và cao chiết nước với hàm lượng tương ứng.
4. Hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis giàu selen cao
hơn so với sinh khối nấm đối chứng không bổ sung selen. Đặc
biệt, cao chiết ethyl acetate từ sinh khối nấm C. sinensis giàu
selen thể hiện dược tính sinh học cao trong kháng oxy hóa và hoạt
tính gây độc đối với các dịng tế bào ung thư MCF7 và Jurkat.
5. Đã đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm C.
sinensis giàu selen ở qui mô pilot (10 L); hiệu suất sinh khối
26,45g/L; 1068 µgSe/g sinh khối. Sinh khối hệ sợi nấm C.