Báo cáo thực hành ứng dụng CNSH trong nuôi trồng thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG
--------

BÁO CÁO THỰC HÀNH ỨNG
DỤNG CNSH TRONG NUÔI TRỒNG
THỦY SẢN

Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thành Luân
Lớp

: 16DSHA2

Nhóm 2
Sinh viên thực hiện

: Trần Trung Cương
Trần Quang
Nguyễn Thị Mỹ Huyền
Lê Ngọc Quân

Tp.Hồ Chí Minh, 6/12/2019

1

161110078
1611100041
1611100096
161110065

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VIBRIO TRONG TÔM ẤU
TRÙNG VÀ TƠM THƯƠNG PHẨM
1.MỤC ĐÍCH,U CẦU
_ Mục đích:
Giúp sinh viên tiếp cận phương pháp phân lập, mô tả , đánh giá sự hiện diện
của các lồi Vibrio spp trong tơm ấu trùng thơng qua phương pháp pha lỗng
mẫu rồi đếm trực tiếp.
Xác định được số lượng Vibrio spp trong tôm ấu trùng và phân lập được chủng
vi sinh vật mình mong muốn , tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu.
_ Yêu cầu:
 Định lượng số vi khuẩn tồn tại trong mẫu tôm ấu trùng
 Đánh giá sự nhiễm Vibrio ở mẫu khảo sát
 Cách thức chọn lọc của môi trường TCBS
2. KHÁI NIỆM, NGUYÊN TẮC
_ Khái niệm:
- Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio : Gram âm, hình que thẳng hoặc
hơi cong, kích thước 0,3-0,5 µm x 1,4-2,6 µm, khơng hình thành bào tử
và chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh, tất cả
chúng đều yếm khí tùy tiện và hầu hết là oxy hóa và lên men trong mơi
trường O/F Glucose. Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi
trường chọn lọc của Vibrio. Hầu hết các lồi đều phát triển trong mơi
trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các
lồi Vibrio, chúng khơng phát triển trong môi trường không muối NaCl,
chúng không sinh H2S, mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino-6,7
diisopropyl pteridine phosphat (O/129). Cơ bản chúng sống trong môi
trường nước biển và cửa sông (vùng nước lợ.Tơm có sự thay đổi màu sắc
và chuyển sang màu hồng nhợt nhạt khi cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio gây
bệnh phát.
- Phương pháp định lượng là các phương pháp để xác định sô lượng vi sinh

vật trong mẫu

- Các phương pháp định lượng:
+ Phương pháp đếm trực tiếp


+ Phương pháp đếm khuẩn lạc
+ Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc
+ Phương pháp đo độ đục
+ Phương pháp MPN ( most probable number
- Đơn vị tính: tế bào /ml ( CFU/ML hay MPN/ML), tê bào /g ( CFU/G hay
MPN/G)
Tên bệnh
Bệnh phát sáng

Giai đoạn tôm
ấu trùng, giống

Bệnh đỏ dọc thân
Bệnh đỏ thân
Bệnh vỏ hay ăn
mòn
kitin, đen mang

Ấu trùng, giống
Tôm thịt
ở các giai đoạn
của
tôm cua

Nhiễm khuẩn ở cá Cá nuôi ao, lồng

Vi khuẩn gây bệnh
V.parahaemolyticus
V.harveyi
V.alginolyticus
Vibrio spp.
Vibrio spp.,
Pseudomonas spp.,
Proteus sp.

Tác hại
Gây chết hàng
loạt
Gây chết rải rác
Gây chết rải rác
chết rải rác,
hàng loạt

Vibrio spp.

chết rải rác

Bảng : Một số bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm

3. NGUYÊN TẮC
_ Các kiểu khuẩn lạc khác nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau,thể
hiện qua sự lên men của sucrose . Ví dụ: V.cholerae và V.alginolyticus sinh ra
các khuẩn lạc màu vàng, vì chúng lên men đường sucrose ,acid được hình thành.
Ngược lại V.parahaemolyticus và V.vulniticus ln sinh ra khuẩn lạc màu xanh

do thiếu lên men sucrose. Vi sinh vật Vibrio không sinh ra hydrogen sulfide.
_ Cách thức chọn lọc của môi trường TCBS
Nồng độ thiosulfate và citrate cao và độ kiềm mạnh của mơi trường này có thể
ức chế sự phát triển của Enterobacteriaceae. Muối mật và cholate ức chế chủ yếu
enterococci. Các chủng dương tính với sucrose có thể phát triển để hình thành
3


các khuẩn lạc màu vàng do sự hiện diện của chất chỉ thị thymolbluebromothymol màu xanh thay đổi thành màu vàng, khi axit được hình thành,
ngay cả trong mơi trường kiềm mạnh này.

Khuẩn lạc mộc trên môi trường TCBS agar
_ Thành phần mơi trường thạch TCBS (g / lít)
Peptone from casein 5.0; peptone from meat 5.0; yeast extract 5.0; sodium
citrate 10.0; sodium thiosulfate 10.0; ox bile 5.0; sodium cholate 3.0; sucrose
20.0; sodium chloride 10.0; iron(III) citrate 1.0; thymol blue 0.04; bromothymol
blue 0.04; agar-agar 14.0.
_ Cách tiến hành:
Cân 88 g TCBS hịa tan trong 1 lít nước cất, đun sơi và đổ đĩa.
Không hấp.
pH: 8,6 ± 0,2 ở 25 ° C.
Môi trường TCBS có màu xanh (green).


4. NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ
-

Mẫu tôm ấu trùng
Môi trường TCBS
NaCl 0,9 %

Ống nghiệm
Micropepet
Que trang
Đèn cồn
Cồn 700C
Cồn 960C
Effendoft
5.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Mẫu tôm được nghiền nhuyễn trong điều kiện vô trùng cho tới khi
-

-

-

-

được thể đồng nhất
Cân dịch huyền phù của 3 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus
Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phịng
Sau đó, bỏ dịch và thu sinh khối
Thực hiện đến khi nào sinh khối đạt 0,001g tướng ứng với 109 cfu/ml
Tiến hành pha loãng xuống mật độ 108,107,106,105,…
Tại các nồng độ pha loãng 10 7,106,105 tiến hành cấy trang cho đến khi
bề mặt đĩa khô
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
Đọc kết quả sau 24 giờ

6.KẾT QUẢ

Nếu vi sinh vật trong mẫu được pha lỗng tốt, vi khuẩn sẽ hình thành
các khuẩn lạc riêng rẽ. Sau đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc và
-

tính tốn số lượng trong mẫu
Sau 48 giờ đếm tồn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả.

DILUTION
BOTTLE
b(1:10,000)
b(1:10,000)
c(1:1,000,000)
c(1:1,000,000)

ml
PLATED DILUTION
1,0
1:10,000
0,1
1:100,000
1,0
1:1,000,000
0,1
1:10,000,000
5

DILUTION

NUMBER OF

FACTOR
10^-1
10^-2
10^-3
10^-4

CONLONIES
>300
13
>300
7


-

Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha lỗng
càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả khơng hợp lý phải tiến

-

hành lại các bước ni cấy.
Các đĩa có từ 30 đến 300 khuẩn lạc được chọn để đếm. Từ số đếm, số
lượng trong 1 mL môi trường ban đầu được tính tốn

7.KẾT LUẬN
Vi khuẩn Vibrio sử dụng đường rất nhiều ở nồng độ 10-1,10-2,10-3,10-4
Số lượng vi khuẩn hình thành trên đĩa chỉ đếm được nồng độ 10-2, 10-4,
10-5 nhưng ở nồng độ 10-3, 10-1 số lượng vi khuẩn lớn hơn 300 khuẩn
lạc.

BÀI 2 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI KHUẨN
VIBRIO
1. MỤC ĐÍCH U CẦU
_Mục đích:
Các phản ứng sinh hóa giúp định danh các chủng vi khuẩn đã phân lập vì
-

-

-

-

-

mỗi vi khuẩn có những đặc tính sinh hóa khác nhau
Phát hiện VSV có hệ enzym oxydase
Xác định khà năng sử dụng Na+
Xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên
men glucose.
Phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên
men glucose
Xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm
carboxyl ở một số acid amin.
Phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm
ứng.
Phát hiện các vi sinh vật có hệ thống enzyme catalase.

Yêu cầu:
-

Khảo sát các phản ứng sinh hóa của ba chủng : V.parahemolyticus (xanh),
V.fluvialis (vàng), V.vulnificus (xanh), thông qua các phản ứng:










Catalase
Oxidase
ONPG
NaCl 0% / 6%
MR-VP
Lysine decarboxylase
Acid from D.cellobiose

Vi khuẩn vibro
2. KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC
_ Khái niệm
2.1 Khái niệm
-

Việc định danh chủ yếu dựa vào kiểu hình và đặc biệt là các phản ứng

-

sinh hóa
Có ba cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục
đích định danh
+

Cách truyền thống

+

Sử dụng các bộ kit

-

+
Dùng thiết bị tự động
Các kết quả thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật được tổng

-

hợp thành những Bảng sinh hóa định danh vi sinh vật.
Bảng bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân biệt các loài
vi sinh vật gây bệnh thường gặp. Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thị
một trị số là tỷ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả dương tính

-

theo thống kê ở một lồi vi sinh vật.
Các đặc điểm sinh hóa có trị số dao động ở mức 50% khơng có giá trị

-

trong việc định danh.
Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị qui
ước bằng các ký hiệu như:
(+) : dương tính
7


(-) : âm tính
Trong các thử nghiệm này, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả,
người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng.
2.2 Nguyên tắc
2.2.1. Thử nghiệm bằng phép thử catalase
-

Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa chuỗi truyền điện tử có
cytochrome đều có enzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng

-

-

theo phương thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2.
Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có
độc tính cao này trong tế bào.
Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt
khí

2.2.2. Thử nghiệm bằng phép thử oxidase

- Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của vi khuẩn
- Hệ thống cytochrom có ở vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy tiện. hệ thống
này hoạt động như chất liên kết trong quá trình hơ hấp, vận chuyển H+ →
O2 tạo thành nước.
- Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p – phenylenediamine
dihydrochloride.
2.2.3. Thử nghiệm ONPG
- Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp của 2 enzyme là
galactosidase có vai trị xúc tác thủy phân lactose và permease có vai trò
vận chuyển lactose vào bên trong tế bào. Hoạt tính của enzyme
galactosidase có thể được xác định vào một cơ chất tổng hợp là Onitrophenyl-D-galactopyranoside. Sự thủy phân cơ chất đường này bỏi
galactosidase sẽ phóng thích O-nitrophenol có màu vàng.
2.2.4. Khả năng sử dụng Na+
- Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na +
kích thích cho sự phát triển của tất cả các lồi Vibrio, chúng khơng phát
triển trong mơi trường khơng muối NaCl, thử nghiệm giúp xem khả năng
sông scuar Vibrio trong môi trường bổ sung 0%, 6% Nacl.


2.2.5. Thử nghiệm MR-VP
- Thử nghiệm Methyl red: Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất
và duy trì các sản phẩm acid bên trong mơi trường trong quá trình lên men
glucose. Thử nghiệm phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định
sự khác nhau trong con đường chuyển hóa glucose. Thử nghiệm này đươc
tiến hành trong thời gian nuôi 2-5 ngày ở 37oC.
- Thử nghiệm Voges Proskauer: Nhằm phát hiện khả năng vi sinh vật tạo
thành sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol (acetonin) trong q
trình lên men glucose. Để phát hiện acetonin trong môi trường nuôi cấy vi
sinh vật, α-naphtol được sử dụng như một thuốc thử trong môi trường
kiềm mạnh được tạo ra KOH 40% được co vào môi trường thử nghiệm.

2.2.6. Thử nghiệm Lysine decarboxylase
- Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp các
enzyme khử nhóm carboxyl từ lysin, qua đó chúng làm kiềm mơi trường
nuôi cấy.
3. NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ
3.1 Nguyên liệu
 Ba chủng V.parahemolyticus (xanh), V.fluvialis (vàng), V.vulnificus
(xanh) đã được phân lập và tăng sinh trên môi trường TCBS.
 H2O2 3%
 NaCL 0% và NaCl 6%
 Thuốc thử oxidase (N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine





(TMPD).
Môi trường MR-VP
Thuốc thử (α-napthol, KOH 40%)
Môi trường LDC
Đĩa giấy ONPG

3.2 Dụng cụ





Que cấy ria
Lam kính sạch

Ống nghiệm 100ml
Đèn cồn
9


 Kẹp
4 THỰC HIỆN
Ba chủng V.parahemolyticus (xanh), V.fluvialis (vàng), V.vulnificus (xanh)
đã được phân lập và tăng sinh trên môi trường TCBS tại phịng thí nghiệm
của Viện Khoa học ứng dụng HUTECH
4.1. Thử nghiệm bằng phép thử catalase
- Thử trên lame: nhỏ H2O2 30% lên lame, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh
khối đặt lên giọt H2O2. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.

Trong đó: V.flu : V.fluvialis
V.para: V.parahemolyticus
V.vu: V.vulnificus
4.2. Thử nghiệm bằng phép thử oxidase
- Dùng que cấy vô trùng lấy 3 khuẩn lạc V.parahemolyticus, V.fluvialis và
V.vulnificus đặt lên giấy đã thấm với thuốc thử oxidase (N,N,N′,N′tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)


4.3. Thử nghiệm ONPG
- Khuẩn lạc (sau 24 giờ nuôi trong mơi trường có lactose) được cấy vào
ống nghiệm chứa nước muối sinh lý. Sau đó, cho đĩa giấy ONPG vào ống
nghiệm trên và ủ ở 37℃ trong 24 giờ. Phản ứng được cho là dương tính
khi có chỉ thị màu vàng.

Trong đó: V.flu : V.fluvialis  (+)
11

V.para: V.parahemolyticus(-)
V.vu: V.vulnificus(-)
4.4. Khả năng sử dụng Na+
- Khảo sát nồng độ NaCl 0% và NaCl 6%. Môi trường được cấy và ủ ở
37℃ trong 18 - 24 giờ trong bể ổn nhiệt lắc. Kết quả dương tính được xác
định bởi độ đục của mội trường.

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (+)
V.para: V.parahemolyticus(+)
V.vu: V.vulnificus(-)
Mơi trường TSB+NaCl 6%

Mơi trường TSB+Nacl 0%
Trong đó từ trái qua: V.flu : V.fluvialis (+)
V.vu: V.vulnificus(+)
V.para: V.parahemolyticus (+)
4.5. Thử nghiệm MR-VP


- Cấy vi sinh vật trong môi trường MR–VP → Ủ 24 – 48 giờ, 37℃ → bổ
sung thuốc thử KOH 40% vào môi trường, lắc nhẹ → Đọc kết quả sau 20
phút
(+): màu đỏ trên môi trường
(-): mặt môi trường khơng đổi màu

Thử nghiệm với Methyl red
Trong đó: V.flu : V.fluvialis (+)
V.para: V.parahemolyticus(+)

V.vu: V.vulnificus(-)

13


Thử nghiệm Voges Proskauer
Trong đó: V.flu : V.fluvialis (-)
V.para: V.parahemolyticus(-)
V.vu: V.vulnificus(+)
4.6. Thử nghiệm Lysine decarboxylase
- Khuẩn lạc (sau 24 giờ) được cấy vào môi trường LDC lỏng và ủ ở 37℃
trong 24 - 48 giờ. Phản ứng dương tính được chỉ định bởi một màu tím
đậm trong suốt mơi trường, trong khi đó phản ứng âm tính được chỉ ra bởi
màu vàng trong suốt môi trường (Choopun et al., 2002).

Trong đó: V.flu : V.fluvialis (-)
V.para: V.parahemolyticus(+)
V.vu: V.vulnificus(+)
4.7. Acid from D.cellobiose


Trong đó: V.flu : V.fluvialis (-)
V.para: V.parahemolyticus(-)
V.vu: V.vulnificus(-)
5 KẾT QUẢ
V.parahemolyticus
Catalase
Oxidase
ONPG
NaCl 6%

NaCl 0%
MR
VP
LDC
Acid from
D.cellobiose

V.fluvialis (vàng)

(xanh)
+
+
+
+
+
+
-

V.vulnificus

+
+
+
+
-

(xanh).
+
+
+

+
+

-

-

BÀI 3: KHẢO SÁT KHÁNG SINH ĐỒ CỦA VI KHUẨN
1. MỤC ĐÍCH U CẦU
1.1Mục đích
15


Khảo sát kháng sinh đồ để biết được độ nhạy của các chất kháng sinh đối
với các chủng gây bệnh. Qua đó có thể biết cách sử dụng các loại kháng sinh
nào tốt nhất để điều trị bệnh nhiễm khuẩn, cải thiện, nâng cao hiệu quả trong
nuôi trồng thủy sản.
1.2 Yêu cầu
Khảo sát kháng sinh đồ của ba chủng : V.parahemolyticus (xanh),
V.fluvialis (vàng), V.vulnificus (xanh) bằng 6 loại kháng sinh là: Ampicillin,
Clindamycin, Erythromycin, Florfenicol, Penicillin, Streptomycin trên môi
trường Mueller-Hinton Agar ( MHA).
2. KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC
2.1 Khái niệm
Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar ( MHA) là môi trường
trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật với
kháng sinh. Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự
thuỷ phân tinh bột. Thạch Mueller-Hinton có chứa hỗn dịch động
vật, casamino acid và tinh bột giúp cho hầu hết các vi sinh vật phát
triển.

Các loại kháng sinh:
 Ampicillin (Am) được biết đến là loại loại thuốc được sử dụng để
-

điều trị những bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn do vi khuẩn gây ra.
 Clindamycin (CL) được dùng điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các
vi khuẩn kị khí.
 Erythromycin (Er) là kháng sinh nhóm macrolid, có phổ tác dụng
rộng, chủ yếu là kìm khuẩn đối với vi khuẩn gram âm và gram
dương.
 Florfenicol (FL) là kháng sinh thế hệ mới nhất của nhóm Phenicol,
là kháng sinh tổng hợp phổ rộng, có hiệu quả trong điều trị các
bệnh do vi khuẩn Gram (+) và Gram (-).
 Streptomycin (Str) là kháng sinh phổ rộng có tác dụng chủ yếu trên
vi khuẩn gram âm, còn trên vi khuẩn gram dương tác dụng kém
hơn penicillin.


 Penicillin (Pn) là một loại kháng sinh thuộc nhóm thuốc trị ký sinh
trùng, chống nhiễm khuẩn, kháng virus và kháng nấm.
2.2 Nguyên tắc
Thực hiện bằng cách trải đều một chủng sinh vi vật thử nghiệm đã
được chuẩn hóa trên mơi trường MHA, sau đó các đĩa giấy có chứa
nồng độ cụ thể của một loại kháng sinh được đặt trên bề mặt đĩa
thạch. Nếu có tác nhân ức chế hoặc giết chết sinh vật thử nghiệm,
sẽ có một khu vực xung quanh đĩa nơi khơng có sự tăng trưởng xảy
ra được gọi là vùng ức chế. Dựa vào đường kính vùng ức chế, mức
độ nhạy cảm có thể phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạy
cảm), I (intermediate - kháng trung gian), R (resistant - kháng).
3. NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ

3.1 Nguyên liệu
Ba chủng V.parahemolyticus (xanh), V.fluvialis (vàng), V.vulnificus
-

(xanh) đã được phân lập và tăng sinh trên môi trường TCBS.
6 loại đĩa kháng sinh gồm: Ampicillin, Clindamycin, Erythromycin,

Florfenicol, Penicillin, Streptomycin
3.2 Dụng cụ
Kẹp
Đèn cồn
Cồn 70o
Tăm bông đã khử trùng.
4. THỰC HIỆN
- Tăng sinh ba chủng V.parahemolyticus, V.fluvialis và V.vulnificus
→ đánh dấu nhãn tên của sinh vật khảo sát chuẩn bị mật độ huyền
ph→ hút 1ml dung dịch tăng sinh vào eppendofl rồi ly tâm 4000
vòng/10 phút → bỏ dịch thu sinh khối → hút 100μl nước muối sinh
lý → lắc đều
- Cấy chủng vi khuẩn lên bề mặt của môi trường MHA bằng tăm
bông. Phủ đều bề mặt thạch bằng cách quét theo ba hướng → để
đĩa khô trước khi gắn đĩa kháng sinh.
- Dùng kẹp được khử trùng gắp đĩa kháng sinh. Đặt nhẹ từng đĩa trên
môi trường thạch đã được chấm sẵn. Mỗi đĩa môi trường khảo sát 3
loại đĩa kháng sinh → ủ đĩa trong 16-18giờ ở 37℃ → đọc kết quả.
17


- Dùng thước kẻ đặt lên mặt đáy của đĩa thạch, đo đường kính vùng
ức chế hồn tồn, tính theo mm. Sau đó so sánh kết quả với tiêu

chuẩn quy định của CLSI.

Hình 3.1. V.fluvialis và V.vulnificus sau khi đặt 6 loại kháng sinh
5. KẾT QUẢ


Kháng sinh

Các chủng phân lập từ tôm ấu trùng
V.parahemolyticus
V.fluvialis
V.vulnificus

Ampicillin
16-22
Clindamycin
24-30
Erythromycin
22-30
Florfenicol
22-28
Penicillin
26-37
Streptomycin
23-25

R

R

S

S
I

R

R

S

S

I

S

R

R

I

R

BÀI 4: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN
LACTIC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH
1.MỤC ĐÍCH U CẦU
Mục đích:
_ Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Vibrio spp.

_ Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic.
_ Phân lập, tăng sinh các vi khuẩn hữu ích ứng dụng trong phòng bệnh thủy sản
từ nhiều nguồn khác nhau.
Yêu cầu: Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn bằng phương pháp sọc chéo
2. KHÁI NIỆM
_ Khái niệm:
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương và lên men carbohydrate khi có
hoặc khơng có oxy và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic. Nhóm vi khuẩn
này cịn sản xuất các hợp chất hữu cơ tạo ra mùi thơm và hương vị cho các sản
phẩm được lên men . Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa và gần
đây chúng được phân lập từ các sản phẩm lên men như: thịt, các sản phẩm từ
19


sữa, rau quả, nước uống và bánh mì lên men, hệ tiêu hóa các lồi động vật thủy
sản.
Vi khuẩn lactic phát triển ở nhiệt độ khác nhau nhưng hầu hết chúng phát triển ở
nhiệt độ tối ưu 20-30 độ C , một số loài ưa nhiệt phát triển ở nhệt độ cao hơn 5055 độ C, vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối cao,pH tối ưu cho hầu
hết các vi khuẩn lactic (pH=7.0)

Hình 4.1. Hình thái của vi khuẩn lactic
_ Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic
Tác động kháng lại vi sinh vật của vi khuẩn lactic chủ yếu là do acid lactic và
các sản phẩm acid hữu cơ. Chúng làm giảm pH của môi trường sinh sống của vi
sinh vật khác. Ở pH thấp thì các acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa tan và
khuếch tán qua màng tế bào chất.
Hầu hết các bacteriocins của vi khuẩn LAB là cation nhỏ (<10 kDa), ổn định
nhiệt, lưỡng tính và peptide thấm qua màng. Zacharof và Lovitt (2012) đã chia
các vi khuẩn LAB thành ba nhóm chính.

Nhóm I (Class I), lantibiotics, là nhóm của các chất peptide nhỏ (< 5 kDa) gồm
polycyclic thioether amino acids, lanthionine, hoặc methyl lanthionine, và các
amino acids khơng bão hịa như dehydroalanine và 2-aminoisobutyric acid.
Nhóm II (Class II), non-lantibiotics, các chất có kích thước nhỏ (<10 kDa) tương
đối ổn định nhiệt, non-lanthionine chứa peptide hoạt động màng.
Nhóm III (Class III) Large Bacteriocins, bao gồm các protein khơng bền nhiệt,
có trọng lượng phân tử lớn (> 30 kDa), ví dụ, helveticin I được sản xuất bởi
Lactobacillus helveticus và enterolysin do Enterococcus faecium sản xuất.
_ Các phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic đối
với vi khuẩn Vibrio spp.
Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar (MHA) được sử dụng để kiểm tra hoạt
động kháng khuẩn của vi khuẩn hữu ích. Với mục đích này, tác dụng ức chế và
đối kháng của vi khuẩn hữu ích với 2 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và V.
vulnificus được xác định theo các phương pháp: Phương pháp khuếch tán đĩa
thạch và phương pháp khuếch tán giếng. Tất cả các xét nghiệm được lặp lại hai
lần.
 Phương pháp khuếch tán đĩa
Đĩa giấy trắng vô trùng (đường kính 6-8 mm) được thấm với dịch ly tâm vi
khuẩn hữu ích trong 5 phút. Để làm khơ chúng, tất cả các đĩa được đặt ở 37 ° C
trong 15 phút. Các dịch huyền phù vi khuẩn gây bệnh được trải đều trên bề mặt
các đĩa chứa môi trường MHA. Các đĩa giấy được được đặt trên bề mặt thạch
21


MHA với khoảng cách 2,5 cm. Tất cả các đĩa được ủ ở 37 ° C và sau 24 giờ,
vùng ức chế tăng trưởng của vi sinh hữu ích kháng lại các chủng gây bệnh
Vibrio được ghi nhận bằng thước đo.
 Phương pháp sọc chéo (Cross Streak Method)
Các đĩa môi trường thạch đã được chuẩn bị và cấy với nhiều lồi vi khuẩn hữu

ích khác nhau bằng một vệt cấy ở giữa đĩa petri (đĩa). Sau 2 ngày ủ ở 37°C, các
đĩa được cấy tiếp với vi khuẩn Vibrio bằng một đường cấy duy nhất ở góc 90 °
với lồi vi sinh hữu ích. Các tương tác của vi sinh vật được phân tích bằng cách
quan sát kích thước của vùng ức chế.

Hình. Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn bằng phương pháp sọc
chéo
3. NGUYÊN LIÊU VÀ DỤNG CỤ
a/ Dụng cụ
- Đĩa petri vô trùng
- Bút đánh dấu,thước đo


- Tăm bông vô trùng
- Eppendorf vô trùng, giá thể
- Que cấy vịng
- Đèn cồn
- Bình xịt cồn
- Micropipet 100 và 1000
- Đầu típ 100 và 1000
- Giá để ống nghiệm
- Ống nghiệm
b/ Thiết bị
- Cân kỹ thuật
- Máy tính
- Tủ ủ
c/ Hóa chất
- Mơi trường thạch
- Cồn 96,70
- Nước muối NaCl 0.9%

4.THỰC HIỆN
23


Chuẩn bị:
Cá thí nghiệm được kiểm tra sức khỏe như màu sắc tươi sáng và khơng bị tổn
thương bên ngồi, kích thước đồng đều, đã ni thích nghi 1 tuần trong hệ thống
bể 300L, sục khí 24/24 giờ.
Các bể thí nghiệm theo nghiệm thức bên dưới

Hình : Hệ thống bể nuôi

Tiến hành:
 Cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh trên Cá tra con
Phương pháp cảm nhiễm là ngâm theo các nghiệm thức: (N1) đối chứng được
thực hiện ngâm trong nước muối sinh lí 0,85 %; (N2) cảm nhiễm vi khuẩn bệnh
với các nồng độ vi khuẩn khác nhau từ 10 4 – 107 tế bào/ml, với liều lượng 0,1
ml/con. Thực hiện chế độ sục khí liên tục, thay 50 % nước cá mỗi ngày. Quan
sát cá sau khi tiêm, nếu có biểu hiện bất thường như bơi không định hướng, bỏ
ăn, tiến hành ghi nhận số cá chết.


BÀI 5: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG
ĐỘNG VẬT THỦY SẢN CỦA VI KHUẨN LACTIC BẰNG MƠ
HÌNH CẢM NHIỄM VI KHUẨN GÂY BỆNH.
5.1.

MỤC ĐÍCH U CẦU

5.1.1.
Mục đích
- Theo dõi và đánh giá khả năng sống sót của cá tra con sau khi phơi nhiễm
với chủng Vibrio parahaemolyticus sau 6 ngày.
5.1.2.
Yêu cầu
- Phơi nhiễm cá tra con với chủng Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ
104, 105, 106 và 107. Với 5 bể và có 4 con/bể. Sau 6 ngày theo dõi và đánh
giá kết quả.
5.2.
KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC
5.2.1.
Khái niệm
 Các nghiên cứu về độc lực của Vibrio parahaemolyticus
- Các nghiên cứu về độc lực cũng như đặc điểm sinh học của loài vi khuẩn
này được thực hiện từ những năm 1990. Tedenci và cộng sự (1997) đã
tiến hành gây cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân
lập được từ tôm bị bệnh đỏ thân gây nhiễm bằng cách tiêm trên tơm sú có
trọng lượng 8 – 12g với các nồng độ 103 – 106 CFU/g và theo dõi trong
thời gian 7 ngày đã ghi nhận xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý. Kết quả cảm
nhiễm cho thấy có sự chuyển màu đỏ trên cá thể tơm được cảm nhiễm
tương tự như dấu hiệu của các mẫu tôm bị hội chứng đỏ thân thu trước đó.
Đồng thời, thí nghiệm xác định được liều gây chết 50% (LD 50) trong vịng
7 ngày của chủng vi khuẩn này trên tơm sú là 10 4 – 105 CFU/g. Dấu hiệu
bệnh lý tương tự cũng được ghi nhận trong thí nghiệm cảm nhiễm tôm sú
bằng phương pháp ngâm với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
phân lập được từ tôm mắc hội chứng đỏ thân ở vùng ven biển Andhra
Pradesh, Ấn Độ của Jayasree và cộng sự (2006), xác định được liều gây
chết 50% (LD50) trong 48 giờ của chủng vi khuẩn dùng trong cảm nhiễm
là 4,0 x 104 CFU/ml. Thơng qua hai thí nghiệm trên đã chứng minh được

Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây nên hội chứng đỏ thân trên tôm
sú.
- Phương pháp ngâm cũng được Roque và cộng sự (1998) áp dụng trong thí
nghiệm gây cảm nhiễm của vi khuẩn này trên tôm thẻ chân trắng với các
nghiệm thức khác nhau (1) tôm bị tổn thương, tiếp xúc với vi khuẩn, (2)
tôm tiếp xúc với vi khuẩn, (3) tôm chỉ bị tổn thương, (4) tơm khoẻ. Thí
nghiệm được theo dõi trong 4 ngày cho thấy tỉ lệ tôm chết cao nhất ở
nghiệm thức tôm bị thương cho tiếp xúc với vi khuẩn dao động từ 37 –
25