Đồ án ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

Mục lục
LỜI CẢM ƠN..........................................................................................................4
LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................5
I/ GIỚI THIỆU........................................................................................................6
II/ NỘI DUNG.........................................................................................................7
1. Điều kiện in vitro..............................................................................................8
2. Sự tăng trưởng thực vật và sự ra hoa in vitro................................................8
3. Giai đoạn phát triển........................................................................................9
4. Tỷ lệ C / N và mức khoáng chất...................................................................11
5. Hình thái hoa in vitro....................................................................................12
III/ RA HOA IN VITRO TREN 1 SỐ LỒI CĨ THÂN NGẦM DƯỚI ĐẤT. 13
1.

Tre (Bambusa spp)....................................................................................13

2.

Rau diếp xoăn (Cichorium intybus).........................................................15

3.

Diên hồ sách (Corydalis yanhusuo)..........................................................16

4.

Nghệ tây (Crocus sativus).........................................................................17

5.

Hoa diên vĩ (Iris).......................................................................................18

6.

Kniphofia leucocephala............................................................................19

7.

Hoa loa kèn (Lilium x cv. Star Gazer)......................................................20

8.

Hoa lan (Orchids).....................................................................................21

9.

Cymbidium spp..........................................................................................22

10.

Doritis pulcherimma x Kingiella philipinensis.........................................23

11.

Ornithogalum arabicum...........................................................................23

12.

Nhân sâm (Panax ginseng).......................................................................24

13.

Hyacinthus orientalis (lục bình)...............................................................25

14.

Allium........................................................................................................25

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................27

1


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

DANH MỤC CHÚ THÍCH
A/ CHÚ THÍCH TÊN VIẾT TẮT
PGR: Plant growth Regulators: chất điều hòa sinh trưởng thực vật
TCL: Thin Cell Layer: Nuôi cấy mô lát mỏng tế bào
TC: Tissue Culture: Nuôi cấy mô
Cytokinin, gibberellin và auxin: Các chất kích thích sinh trưởng
MS: Mơi trường ức chế ra hoa và thúc đẩy tăng trưởng thực vật
NAA: α-Naphthalene Acetic Acid

2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

KN: Kinetin

DFMO: Di-Flouro-me-thyl-Ornithine

IBA: Indole 3 Butyric Acid

DFMA: Di-Flouro- me thyl-Arginine

IAA:Indole Acetic Acid

SAM: S-Adenosyl methionine

GA: Gibberellic Acid

DNP: Day Neutral Plant

CM: Coconut Milk

PBA: (n-benzyl-9-(2-

BA: N6-Benzyl Adenine

terahydropropanyl)-adenine

B/ CHÚ THÍCH BẢNG 1
1 +: Tác động tích cực; -: Tác động tiêu cực; ?: Tác động không rõ ràng.
2 Adenine được thêm vào
3 CM: Sữa dừa
4 Kinetin, BA, Zeatin, PBA và adenine tác động kém hiệu quả

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS.
Trịnh Thị Lan Anh, giảng viên Trường ĐH Công nghệ Tp HCM người đã giảng
2

Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

dạy, nhiệt tình hướng dẫn trong quá trình học và hồn thành đồ án Cơng nghệ sinh
học thực vật. Trong thời gian làm đồ án, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng
góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của cơ và anh chị, đến nay chúng em đã có thể hồn
thành đồ án. Cảm ơn phịng thí nghiệm đã hỗ trợ em thực hiện tốt đồ án này.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!

LỜI MỞ ĐẦU
Ra hoa in vitro có nhiều thuận lợi, đặc biệt đối với một số lồi có giai đoạn
trưởng thành dài như cây có thân ngầm trong đất. Các nghiên cứu đánh giá cho thấy

3


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

trong điều kiện nuôi cấy in vitro rút ngắn thời gian trưởng thành của cây có thân
ngầm trong đất.
Các thành phần môi trường, nồng độ các chất điều hịa sinh trưởng thực vật
(PGR), điều kiện ni cấy, giai đoạn sinh lý của nguồn mẫu cũng như các mô hay
cơ quan dùng để nuôi cấy là các yếu tố làm ảnh hưởng đến việc ra hoa in vitro. Do
đó, trong điều kiện ni cấy in vitro, các quy trình được kiểm soát và quản lý chặt
chẽ để nghiên cứu việc ra hoa, cảm ứng hoa và phát sinh hình thái của hoa. Nó cũng
có thể được áp dụng như một cơng cụ để đẩy nhanh q trình nhân giống hoặc có
thể được điều chỉnh để sản xuất các sản phẩm có nguồn gốc từ hoa. Các nồng độ và
tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật giảm trong mơi trường đã được tìm thấy
có mối tương quan chặt chẽ với sự sinh trưởng và phát triển các cơ quan hoa từ chồi

hoặc mô sẹo. Gần đây, mức độ tăng trưởng đã được chứng minh là ảnh hưởng đến
điều hịa gen và phát triển cơ quan trong ni cấy in vitro. Điều này bao gồm các
khía cạnh khác nhau trong việc kiểm soát sự phát triển hoa và phát triển của các tế
bào ngầm trong đất khi nuôi cấy in vitro. Nó nhấn mạnh tầm quan trọng của hệ
thống nuôi cấy mô như dụng cụ để nghiên cứu nhiều khía cạnh khác nhau của việc
ra hoa có kiểm sốt tiến tới tiềm năng của cây có thân ngầm trong đất đưa vào các
ngành cơng nghiệp trang trí, thực phẩm, dược liệu và CN ghép cành.
Giai đoạn phát sinh hình thái hoặc quá trình ra hoa, là một trong những giai
đoạn quan trọng trong phát triển thực vật, chu kỳ sống và sản xuất giống. Quá trình
này liên quan đến sự cảm ứng và phát triển của hoa và cơ quan của chúng đã nghiên
cứu và ứng dụng cho nhiều thực vật nuôi cấy in vitro. Những tiến bộ trong kỹ thuật
nuôi cấy tế bào mô thực vật cung cấp một hệ thống tuyệt vời để nghiên cứu các khía
cạnh sinh lý và sinh học phân tử của thực vật, bao gồm cả việc ra hoa.

I/ GIỚI THIỆU
Tổng quan này tập trung vào việc ni cấy cây có thân ngầm trong đất bẳng
phương pháp nuôi cấy in vitro. Nhiều tế bào thân ngầm trong đất có giá trị thương

4


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

mại quan trọng trong các ngành công nghiệp trang trí, thực phẩm, dược liệu và CN
ghép cành. Các giai đoạn nhân giống liên tục được sử dụng để cải thiện các đặc
điểm về chất lượng của những cây này. Tuy nhiên, giai đoạn trưởng thành của
chúng thường kéo dài qua các quá trình nhân giống trong khi việc sử dụng đột biến
cho nghiên cứu thực tế là không thể. Kỹ thuật ra hoa in vitro có thể là một công cụ
quan trong trong mục tiêu này. Hệ thống này bao gồm nuôi cấy các mẫu thực vật vô
trùng, cây hoặc các bộ phận cơ quan như rễ, lá, chồi và hoa trong bình vơ trùng với

mơi trường xác định trong được kiểm soát (Ziv và Altman, 2003).
Để nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của việc ra hoa, từng lồi thực vật
hoặc chồi sinh sản được ni cấy trong môi trường khác nhau bao gồm các thành
phần vô cơ, hữu cơ và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR). Mục đích của
các nghiên cứu này là tạo ra và kiểm sốt q trình hình thành hoa ở thực vật. Các
nghiên cứu được thực hiện với các lồi thực vật có các u cầu về ánh sáng hoặc
nhiệt độ khác nhau, và các nghiên cứu trong các nghiên cứu này đã được phân lập ở
các giai đoạn sinh lý khác nhau. Ngồi ra, ni cấy mơ lát mỏng tế bào (TCL) từ
các bộ phận thực vật hoặc cơ quan sinh sản của cây con trưởng thành cũng được sử
dụng cho nghiên cứu về ra hoa in vitro (Trần Thanh Vân, 1999). Tuy nhiên, ra hoa
in vitro không phải là hiện tượng phổ biến. Nó xảy ra một cách tự nhiên hoặc có chủ
ý ở một số lồi cỏ và thảo mộc (de Fossard, 1974; Scorza; 1982, Dickens và van
Staden, 1988; Rastogi và Sawheny, 1989; Taixeira da Silva, 2003). Việc ra hoa có
chủ ý trong ni cấy có thể phục vụ như một công cụ để nghiên cứu cảm ứng và
phát triển hoa và để kiểm soát các quy trình ni cấy ở các lồi có thời kỳ trưởng
thành dài như cây chồi có thân ngầm trong đất (Lin et al. 2003b). Một ứng dụng
khác của việc trồng hoa trong ống nghiệm là sản xuất chất thứ cấp từ cây nghệ, nơi
nuôi cấy hoa in vitro là lợi thế là nguồn sản xuất thương mại đầu nhụy với hợp chất
thơm và sắc tố. Sự tăng trưởng trực tiếp của các cơ quan sinh sản trong các quy
trình, được phát triển cho nhân sâm và tre, có thể phục vụ như là một nguồn sản
xuất hợp chất dược phẩm (Lin et al. 2003a). Ngược lại, ra hoa in vitro ở các lồi
khác có thể khơng mong muốn như trong sản xuất thương mại các loài cây tre non
(Chambers et al. 1991) và hoa Ornithogalum. Gần đây khi nghiên cứu với hoa
Ornithogalum, chồi sinh sản phát triển làm giảm tỷ lệ nhân giống sinh dưỡng. Cây
5


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

có thân ngầm trong đất là lồi thực vật lâu năm với một cơ quan lưu trữ trong đất và

chồi thay mới. Chúng nhân giống và tồn tại khơng những bằng hạt mà cịn bằng cơ
quan lưu trữ trong đất như là giả hành, thân củ, rễ củ (Raunkiaer, 1934). Bao gồm
một số hoa lan có cụm lá mọc ra từ một giả hành (psedudobulb) và loài tre lâu năm.
Chức năng chính của cơ quan lưu trữ là lưu trữ các chất dinh dưỡng và nước cho sự
tăng trưởng của cây và đảm bảo sự sống còn trong các mùa có điều kiện mơi trường
khắc ngiệt. Các cơ quan lưu trữ, phân loại theo cấu trúc hình thái của chúng, thường
được chia thành các nhóm củ và giả hành (De Hertogh và Le Nard, 1993). Cây cây
có thân ngầm trong đất bao gồm cả hai loài một lá mầm và hai lá mầm. Tùy theo
điêu kiện khí hậu và mơi trường mà chồi có các giai đoạn sinh trưởng. Những cơ
chế này bao gồm các cơ quan lưu trữ dưới lòng đất, nhận thức về các dấu hiệu thời
tiết theo mùa. Cảm ứng ra hoa trong nhiều cây có thân ngầm trong đất được điều
chỉnh về phương diện môi trường bằng thời lượng chiếu sáng, nhiệt độ, hoặc cả hai
( Le Nard và De Hertogh 1993 ). Ở các lồi khác, hoa được kiểm sốt bởi các tín
hiệu trong từng loài. Trong một bài đánh giá, Hartsema (1961) đã chia cây có thân
ngầm trong đất thành 7 nhóm thời gian bắt đầu ra hoa khác nhau liên quan đến giai
đoạn phát triển của cây. Sự hiểu biết về các mơ hình phát triển của thực vật là điều
cần thiết cho việc nghiên cứu cảm ứng của hoa và phát triển nuôi cấy hoa in vitro.
II/ NỘI DUNG
Lựa chọn các nguồn mẫu để nuôi cấy được quyết định theo mục tiêu của
nghiên cứu và khả năng tái sinh chồi trực tiếp hay gián tiếp thông qua mô sẹo. Các
mẫu cấy có thể là cơ quan, một phần của một cơ quan, một lát mỏng mô (bao gồm
TCL) hoặc các tế bào. Tuy nhiên, theo Dickens và Van Staden (1988), để nghiên
cứu sự ra hoa, cây trồng phải có nguồn gốc từ cây con hoặc hạt giống, trong khi các
nghiên cứu phát triển hoa cần phải có từ cây trưởng thành và bộ phận của hoa như
nụ hoa, đài hoa hoặc cánh hoa. Cây thân ngầm dưới đất có giai đoạn cây con được
phân biệt rõ ràng từ giai đoạn trưởng thành. Do đó, việc lựa chọn cây mẹ tương đối
đơn giản và phải được xem xét theo mục tiêu của nghiên cứu. Khả năng phục hồi cơ
quan hoa thông qua việc kích thích ra hoa đã được chứng minh trong suốt q trình
ni cấy liên tục. Ở một số lồi hiện tượng này kéo dài trong nhiều năm (ví dụ,

6


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

Cymbidium trong 22 năm, Kostenyuk et al, 1999). Ngược lại, hoa in vitro đã bị
biến đổi rất nhanh sau một lồi ni ở Passiflora, và bốn cây con ở Saccharum spp.
(Scorza, 1982). Tuy nhiên, trong cây cẩm chướng non tăng trưởng ở nuôi cấy mô
TC, sản xuất ra hoa ở vị trí khác thường tiếp tục cho ni cấy cấp hai nhiều hơn hai
năm ( Daksha et al, 1994 ).
1. Điều kiện in vitro
Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy mô là khả năng điều chỉnh các điều kiện môi
trường cũng như các thành phần môi trường như chất dinh dưỡng, vitamin, gia tăng
hoặc làm giảm chất điều hịa sinh trưởng thực vật. Các thành phần mơi trường, điều
kiện tăng trưởng và nguồn mẫu ảnh hưởng đến phát sinh hình thái. Những nghiên
cứu ban đầu về Aquilegia (Tepfer et al, 1963, tóm tắt trong Rastogi và Sawheny
1989, Tepfer et al, 1966) cũng như các nghiên cứu gần đây trong Hyacynthus (Lu
và et al 1988, 2000) cho thấy rằng các thành phần môi trường khác nhau cần thiết
để thúc đẩy phát triển các lồi hoa khác nhau. Do đó, mơ hình phát triển phụ thuộc
vào các thành phần trong môi trường và bất kỳ thay đổi nào một trong các thành
phần của mơi trường có thể thay đổi biểu hiện hình thái. Mặc dù các thành phần căn
bản khác nhau, hoạt tính, yếu tố khác ( chẳng hạn như tỷ lệ các chất điều hòa sinh
trưởng, nhu cầu về dinh dưỡng, pH, nhiệt độ và ánh sáng ) phải nghiên cứu riêng lẻ
đối với mỗi lồi hoặc thậm chí các loại cây trồng (Rastogi và Sawheny, 1989 ).
2. Sự tăng trưởng thực vật và sự ra hoa in vitro
Vai trị của chất điều hồ sinh trưởng thực vật trong tái tạo và phát triển cơ
quan hoa in vitro được thảo luận rộng rãi trong các đánh giá trước đó (de Fossard
1974, Scorza, 1982; Dickens và Van Staden, 1988; Rastogi và Sawheny, 1989;
Taixeira da Silva, 2003; Naor et al, 2004). Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
thường được sử dụng nhiều nhất cho ra hoa trong ống nghiệm là cytokinin,

gibberellin và auxin. Ở một số chất GA3 và IAA ức chế hoặc giảm sự ra hoa, trong
khi ở các chất cịn lại được xem là chất kích thích tăng trưởng (de Fossard, 1974;
Scorza, 1982; Dickens và Van Staden, 1988; Naor và et al, 2004). Các nghiên cứu
trước đây cho thấy mối tương quan giữa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật
và thay đổi hình thái ra hoa (Tepfer et al, 1966; Bilderback, 1972; Sano và Himeno,
7


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

1987; Lu et al, 1988; Lee et al, 1990, 1991; tóm tắt ở Dickens và Van Staden 1988;
Duan và Yazawa, 1994; Kostenyuk et al, 1999; Lu et al, 2000; Luo và Lan 2000;
Tang, 2000; Chang và Chang, 2003; Lin et al, 2003b, 2004, 2005). Sử dụng các
công cụ sinh học phân tử, các nghiên cứu gần đây ở Hyacinthus đã chứng minh mối
quan hệ qua lai giữa chất sinh trưởng thưc vật và phát triển cơ quan hoa (Li et al,
2002; Xu et al, 2004). Có vẻ như những thay đổi trong tỷ lệ chất sinh trưởng thực
vật là cần thiết cho sự phát triển của các bộ vỏ hoặc cơ quan hoa khác nhau. Bảng 1
tóm tắt sự tham gia của chất sinh trưởng thực vật khác nhau trong việc nở hoa của
cây chồi dưới trong ống nghiệm. Khi mẫu cấy là một chồi hoặc các cơ quan là chất
sinh trưởng thực vật có thể ảnh hưởng đến hình thái và phát triển của các cơ quan
khác nhau hoa. Tuy nhiên, khi mô cấy là chồi sinh dưỡng hoặc mơ, chất sinh trưởng
thực vật có thể ảnh hưởng giai đoạn gây cảm ứng hoa, phát triển cơ quan hoa, hoặc
cả hai. Trong một số trường hợp nuôi cấy hoa in vitro xảy ra trên mơi trường khơng
có chất sinh trưởng thực vật (Bảng 1), dường như xảy ra phản ứng đối với quan hệ
nội sinh giữa chất sinh trưởng thực vật và các yếu tố sinh lý khác trong chồi.
Gibberellin kích thích tăng trưởng phát triển hoa in vitro trong Zantedeschia tương
tự như ảnh hưởng của nó trong tế bào (Naor et al, 2004). gibberellin và cytokinin
kích thích ra hoa trong ống nghiệm ở Orichophragmus violaceus và dường như thay
thế điều trị lạnh (Luo và Lan, 2000).
3. Giai đoạn phát triển

Thực vật hạt kín đi qua ba giai đoạn trong vòng đời của chúng: cây non, trưởng
thành, và sinh sản (Poethig 1990, Simpson et al 1999.).Thời gian của mỗi giai đoạn
thay đổi từ một giai đoạn rất ngắn đến một giai đoạn rất dài có thể kéo dài trong
nhiều năm (Scorza, 1982). Cây thân thảo hàng năm thường có một giai đoạn chưa
trưởng thành rất ngắn (nếu có), và được coi là hình thành ra hoa trong giai đoạn
tăng trưởng của chúng. Ngược lại, trong cây thân thảo lâu năm, bao gồm cả cây
chồi non và cây thân gỗ, giai đoạn chưa trưởng thành là khác biệt rõ ràng với giai
đoạn trưởng thành. Ở cây chồi có thân ngầm trong đất chưa trưởng thành (tức là
khơng có khả năng nở hoa trong điều kiện tự nhiên) thường kéo dài 1-3 năm, mặc
dù các lồi có thời gian dài hơn được biết: Urginea (Dafni et al, 1981), Bambusa

8


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

(Nadgauda et al, 1990), và Tulip (Fortanier, 1973; Le Nard và De Hertogh,
1993).Sự chuyển đổi từ giai đoạn chưa trưởng thành sang giai đoạn trưởng thành
của thực vật được kiểm soát bởi các hệ thống nội sinh (Simpson et al. 1999).Về mặt
sinh lý, sự thay đổi từ chưa trưởng thành đến cây trưởng thành được thể hiện như là
một sự thay đổi từ khơng có năng lực thành có năng lực (Poethig, 1990). Mơ phân
sinh có khả năng đáp ứng với các tín hiệu mơi trường hoặc tự trị mà cuối cùng dẫn
đến sự hình thành hoa. Quá trình ra hoa được thể hiện bởi những sự thay đổi trong
hình thái và sinh lý phát triển của mơ phân sinh chồi (Simpson et al, 1999). Cuối
cùng, sau khi hình thành cơ quan hoa, trong hầu hết các trường hợp, những thay đổi
này được thực hiện bằng cách chấm dứt các hoạt động phân sinh (Poethig, 1990).
Trong các tế bào chồi dưới, sự chưa trưởng thành được biểu hiện như một cơ quan
lưu trữ dưới đáy cho hoa hoặc một mô phân sinh chồi (Halevy 1990, LangensGerrits et al. 2003). Ở một số loài, chồi chưa trưởng thành được biểu hiện bằng số
lượng củ dưới ngưỡng quan trọng (Le Nard và De Hertogh, 1993; Langens-Gerrits
et al, 2003). Kích thước củ tối thiểu cho việc ra hoa là chi và loài hoặc phụ thuộc

vào loài và cũng thay đổi theo các điều kiện về giống và môi trường (Le Nard và De
Hertogh, 1993). Tuy nhiên, Langens-Gerrits et al( 2003 ) cho thấy rằng trong cây
Lilium con phát triển trong ống nghiệm, tuổi sinh lý học góp phần tạo nên sự thay
đổi từ cây con giai đoạn trưởng thành có kích thước bầu dục. Các nghiên cứu gần
đây ở Zantedeschia đã báo cáo rằng sự ra hoa in vitro để đáp ứng với ứng dụng
GA3. Các tác giả đã chỉ ra rằng chồi, ngoại trừ các cụm chồi được nuôi cấy trên mơi
trường (BA) nồng độ cao có thể cho ra hoa bất kể kích thước, vị trí của chúng (Naor
et al, 2005). Cây trưởng thành trong cây có thân ngầm mang đặc tính của củ và hạt
hoặc củ và hạt đang phát triển vơ tính từ cây trưởng thành rễ củ nhỏ hoặc củ lớn từ
mô nuôi cấy cũng chưa trưởng thành. Vì vậy, trong các tế bào ni cấy mô đảo
ngược giai đoạn trưởng thành thành giai đoạn chưa trưởng thành làm mất khả năng
nở hoa trong điều kiện tự nhiên và trong nuôi cấy mô (Chang và Hsing 1980;
Nadgauda et al, 1990), trái ngược với cây gỗ (Poethig, 1990).Tuy nhiên, giai đoạn
chưa trưởng thành của chồi Lilium được tái tạo trong nuôi cấy mô thực vật ngắn hơn
nhiều so với giai đoạn nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên (Langens-Gerrits et al.
2003). Từ mơ sinh sản hình thành đến mơ sinh dưỡng được dùng loai cây có thân

9


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

ngầm trong đất như là Allium ampeloprasum, Dichelostemma multiflorum,
Eucrosia radiate, Gladiolus grandiflorus, Haemanthus coccineus, Hyacinthus
orientalis, Narcissus tazetta, Nerine sariniensis, Ornithogalum dubium, (Ziv và
Lillien-Kipnis 1997, 2000), cũng như Allium cepa (Keller 1990), A. sativum (Xu et
al. 2005), và A. ampeloprasum (Ziv et al. 1983), Amaryllis (Bapat) và
Narayanaswamy 1976), Bambosa (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992), Iris
enstata (Kawase et al,.1995; Boltenkov và Zarembo, 2005), Iris setosa và Iris
sanguinea (Boltenkov và Zarembo, 2005).Trong các nghiên cứu này, các bộ phận

cơ quan hoa hoặc phân đoạn cuống hay đài hoa được sử dụng làm nguồn phát tán.
Điều này trái ngược với chồi trong cây trồng, nơi có thể vơ cùng khó khăn để đảo
ngược sự tăng trưởng đến giai đoạn sinh dưỡng, sau khi chồi được hoàn toàn
chuyển đổi giai đoạn sinh sản mới (Rastogi và Sawheny 1989, Poethig 1990). Ở
nhiều loài ra hoa có thể được chuyển từ cây mẹ sang cây con trong nuôi cấy mô
thực vật (Dickens và Van Staden, 1988; Daksha et al, 1994).
4. Tỷ lệ C / N và mức khống chất
Mơi trường ni cấy mơ chứa các nguồn khống chất và đường, ngồi ra cịn
có các chất điều hòa sinh trưởng và các thành phần khác. Người ta khám phá ra rằng
ra hoa in vitro cũng chịu ảnh hưởng của các nồng độ và tỷ lệ của hai thành phần
chính carbohydrate và khống chất. Nồng độ nitơ cao trong môi trường MS ức chế
ra hoa và thúc đẩy tăng trưởng thực vật, cạnh tranh hiệu quả hơn cho carbohydrate
từ môi trường (Dielen, 2001). Theo giả thuyết về chuyển hóa dinh dưỡng của hoa,
tỷ lệ C / N tăng trong chồi trong q trình kích thích hoa (Sachs,1977). Do đó, sử
dụng mơi trường MS có nồng độ cao (Murashige và Skoog, 1962) hoặc giảm hàm
lượng nitơ tăng cường trong nở hoa in vitro ở cây chồi dưới như Bambusa vulgaris,
Dendrocalamus giganteus, D. strictus (Rout và Das, 1994), Cymbidium (Kostenyuk
et al, 1999), Doritis (Duan và Yazawa, 1994), nhân sâm (Chang và Hsing, 1980),
Orichophragmus violaceus (Luo và Lan, 2000) và cà chua (Dielen et al, 2001).
Ngược lại, khơng có sự khác biệt về tỷ lệ nở hoa in vitro của cây con Bambusa
edulis được quan sát kết quả của các nồng độ sucrose và nitơ khác nhau trong môi
trường (Lin et al, 2003b). Photpho cao trong mơi trường đã được tìm thấy để kích

10


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

thích ra hoa trong Cymbidium (Kostenyuk et al, 1999) và Ornithogalum dubium.
5. Hình thái hoa in vitro

Ra hoa in vitro thường cho hoa nhỏ hơn khi ra hoa trong điều kiện bình thường
( Rastogi và Sawheny, 1989; Nadgauda et al, 1990, 1997; Chang và Chang 2003,
Naor et al, 2004) trong khi hoa có kích thước bình thường phát triển như
Cymbidium (Tran Thanh Van, 1974) với sắc tố màu (Kostenyuk et al, 1999 ). Trong
một số trường hợp phát triển hoa phát triển khơng hồn tồn (Tepfer et al. 1966; Lin
et al. 2003a) hoặc dị dạng (Scorza, 1982). Tuy nhiên, hạt phấn và hạt giống hữu cơ
đã được báo cáo đối với loài tre và Cymbidium (Nadgauda et al. 1990, 1997, Chang
và Chang 2003).Mơ hình phát triển của vịng thường tương tự như các mơ hình in
vivo nhưng mức độ phát triển thường phụ thuộc vào nồng độ chất sinh trưởng thực
vật trong môi trường. Đây cũng là trường hợp cho mơ hình phát triển cụm hoa như
đã thấy trong sự phát triển của loài gai trúc dại Bamboosa arundinacea và
Dendrocalamus brandisii Kurz.(Nadgauda et al, 1990, 1997). Loài Zantedeschia
được nuôi cấy mô thực vật, hoa đực phát triển tốt hơn hoa cái trên mơ hình thu nhỏ
của hoa (Hình 2A, Naor và et al 2004). Các điều kiện kiểm sốt cho phép hình
thành khơng xác định các cơ quan cụ thể (Lu et al, 1988, 2000) và khuếch đại các
cụm hoa (Lin et al, 2003a, 2004) để đáp ứng với những thay đổi về mức độ và tỷ lệ
chất sinh trưởng thực vật(Scorza, 1982).

11


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

III/ RA HOA IN VITRO TREN 1 SỐ LỒI CĨ THÂN NGẦM DƯỚI ĐẤT
1. Tre (Bambusa spp)

Chi này có thể được coi là thuộc nhóm cay thần ngầm trong đất vì chúng là cây
lâu năm, thân cây lớn thuộc lồi ơn đới phát triển từ thân rễ, và thân rễ chứa tinh bột
như một hợp chất dự trữ. Thân rễ hoạt động như một cơ quan dự trữ thời gian ngắn
cho việc chuyển hóa từ củ sang những cây mới phát triển (Kleinhenz và Midmore,

2001). Nó giống như cây thần ngầm vì mẫu ra hoa một lần phát triển của nó. Việc
ra hoa trong tự nhiên xảy ra trong vòng từ 2-120 năm (Nadgauda et al. 1990;
Chambers et al. 1991; Kleinhenz và Midmore 2001; Lin et al. 2003b. Tre được coi
là loài đơn và hầu hết trong số chúng có thói quen tăng trưởng tự nhiên (Chambers
et al, 1991; Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992; John và Nedgauda, 2001;
Kleinhenz và Midmore, 2001). Các cây mọc thành cụm từ cùng một quần thể địa
phương hoặc từ cùng một loài nhiều hơn hay ít hơn trong cùng thời gian sẽ chết sau
một mùa ra hoa (Nadgauda et al, 1990; Kleinhenz và Midmore, 2001). Điều này
cho thấy việc ra hoa được kiểm soát tự nhiên (Nadgauda et al, 1997) hoặc được
kiểm soát bởi nhiều tín hiệu mơi trường bên ngồi (Nadgauda et al,1990). Những
đặc tính sinh sản này ngăn cản sự sinh sản được kiểm sốt (Nadgauda et al, 1990,
1997) nhưng có thể được khắc phục bằng việc cấy hoa trong ống nghiệm (Gieles et

12


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

al, 2002). Mặt khác, cái chết đã được quan sát thấy trong các chồi đã nở hoa trong
ống nghiệm, áp đặt một vấn đề khi nuôi cấy mô được sử dụng để nhân giống đại trà
thương mại (Lin et al. 2003b). Tuy nhiên, Gieles và các đồng sự(2002) báo cáo sự
tăng trưởng thực vật của thực vật ex vitro từ cây con có nguồn gốc từ bơng giả của
ba loài tre. Ở hoa in vitro xảy ra ở cây con bảy loài: Bambusa arundinacea
(Nadgauda et al. 1990, 1997), Dendrocalamus brandisii (Nadgauda et al. 1990),
Dendrocalamus brandisii (Chambers et al. 1991), Bambusa vulgaris,
Dendrocalamus giganteus, Dendrocalamus strictus (Rout và Das, 1994), Bambusa
edulis (Lin et al, 2003b). Prutpongse và Gavinlertvatana (1992) báo cáo tỷ lệ ra hoa
in vitro thấp và rải rác ở B. arundinacea, B. brandisii, B. glaucescens, B. multiplex,
B. nana, B. spp.'Dam Khan', Cephalostachym pergracile và D. membranaceus. Đối
với sáu loài ra hoa in vitro xảy ra từ hạt giống nuôi cấy phát triển thành cây con,

hoặc từ cây con có nguồn gốc từ cây zygotic (thơng qua callus) sau 2-3 lần cấy
truyền (Nadgauda et al, 1990, 1997, Chambers et al. 1991), hoặc từ mẫu cấy có
nguồn gốc từ phơi soma (Rout và Das, 1994). Ở một trong các loài, ra hoa phát triển
in vitro từ phân đoạn hoa. Hoa được theo dõi 12-15 tuần sau khi hạt gieo hạt hoặc
ni cấy mơ, do đó rút ngắn thời kỳ cây con đáng kể. Trong hầu hết các nghiên cứu,
BA là Cytokinin phổ biến nhất được sử dụng trong môi trường sinh trưởng, trong
khi TDZ được tìm thấy là cytokinin hiệu quả nhất (Lin et al. 2003b). Nước dừa
không phải là một thành phần thiết yếu. Việc tăng trưởng sự ra hoa kết quả sau 10
tháng cấy ghép lặp lại trên mơi trường MS bổ sung với TDZ 0,5-4,5 µM (Lin và
cộng sự 2003a, 2004).Tuy nhiên, Rout và Das (1994) đã báo cáo việc cấy hoa in
vitro của ba loài trên mơi trường MS bổ sung với 1,2 µM IBA, 1,2 µM adenine
sulphate và 1,4 µM GA3. Tuy nhiên, Auxin được chứng minh là có tính chất đối
kháng với Cytokinin trong sự phát triển của bào tử và sự phát triển của hoa (Lin et
al. 2003b, 2004). Tuy nhiên, kích thước hạt nhỏ hơn trong năm loài hạt đã được sản
xuất (Nadgauda et al. 1990, Rout và Das 1994, Nadgauda et al. 1997). Các nghiên
cứu về ra hoa in vitro ở Bambusa có vai trị quan trọng trong việc tìm hiểu sinh lý
của các loài thực vật ra hoa một lần.

13


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

2. Rau diếp xoăn (Cichorium intybus)

Các nhà khoa học đã xem xét Cichorium intybus vì nó có đặc điểm của cây chồi
thân ngầm bởi vì gốc rễ dự trữ mang lại sự tăng trưởng chồi. Cây rau diếp xoăn phụ
thuộc cả ngày dài và một thời gian cho ra hoa (Demeulemeester et al, 1995b). Các
cây con có nguồn gốc từ mô rễ cấy trong ống nghiêm hoặc cây con được lấy ngoài
tự nhiên (Demeulemeester et al, 1995a; Bais et al, 2000). Một nỗ lực để thay thế

các yêu cầu nông nghiệp cho sự khởi phát và phát triển hoa trong nuôi cấy mô (TC)
với ứng dụng ngoại sinh của 5-azacytidine, một tác nhân demethyl hóa DNA, kết
quả chỉ có 15% ra hoa (Demeulemeester và De Proft, 1999). Trong một nghiên cứu
khác, putrescine, một tiền chất của polyamine spermine và spermidine, đã được tìm
thấy để được tham gia vào sự phát triển hoa in vitro khi 40 mM được bổ sung cùng
với 14,4 mM GA3 vào môi trường. Vai trị của nó trong phát triển hoa được thể
hiện bằng ứng dụng ngoại sinh hoặc do tác dụng của các chất ức chế sinh tổng hợp
putrescin di-flouro-methyl-ornithine (DFMO) và di-flouro-methyl-arginine
(DFMA), cũng như ứng dụng của AgNO3. Sadenosyl methionine (SAM) là tiền chất
phổ biến của ethylene và putrescine. Do đó AgNO3, ức chế hoạt động của etylen,
tăng sự ra hoa trong ống nghiệm có thể thơng qua sự gia tăng sản xuất putrescine
(Bais et al. 2000). Các chất ức chế sinh tổng hợp gibberellin ức chế sự phát triển
của thân hoa nhưng không phải sự khác biệt về hoa trong cây con rau diếp xoăn in
vitro. Người ta đã đề xuất rằng GA1 được tổng hợp trong q trình ni cấy in vitro
và kiểm soát sự kéo dài của thân hoa (Demeulemeester et al. 1995a). Các thí

14


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

nghiệm in vitro đã được phát hiện là có khả năng nở hoa ở tất cả các giai đoạn chồi
trái ngược với thực vật in vivo (Demeulemeester và De Proft, 1999). Người ta gợi ý
rằng một yếu tố ức chế ra hoa chưa biết đã được loại bỏ bằng cách loại bỏ các chất
bài tiết và nuôi cấy chúng trong ống nghiệm (Demeulemeester et al. 1995a,
Demeulemeester và De Proft, 1999), hoặc bằng cách phát triển các mô cấy dưới ít
nhất một chu kì 16 giờ (Demeulemeester et al, 1995b)
3. Diên hồ sách (Corydalis yanhusuo)

Nhân giống bằng phương pháp ra hoa in vitro có lợi cho cây thảo dược (Kuo et

al, 2002). Corydalis, một loại thảo mộc quan trọng trong y học Trung Quốc,chứa
một số alkaloids quan trọng dược(Kuo et al,2002) đã kiểm tra sự tái tạo in vitro từ
phôi soma phân biệt với mô sẹo. Các cây con phát triển tốt trong việc ra hoa in vitro
đã được quan sát thấy sau bốn tháng nuôi cấy. Tuy nhiên, giai đoạn sinh lý của mô
thực vật mẹ không được nghiên cứu. Tỷ lệ ra hoa in vitro rất thấp (5%), và hiệu ứng
PGR trên hoa in vitro không rõ ràng.

15


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

4. Nghệ tây (Crocus sativus)

Mục đích của việc ra hoa in vitro của Crocus sativus L. là tạo ra sự phát triển
hoa cho việc sản xuất đầu nhụy thương mại, có chứa các hợp chất có thể sử dụng
trong ngành công nghiệp gia vị (Sano và Himeno, 1987; Plessner và Ziv, 1999). Sắc
tố và các hợp chất thơm trong đầu nhụy làm cho nó trở thành một gia vị quý giá
trong thực hành ẩm thực phương Đông và phương Tây. Nghiên cứu trước đây cho
thấy rằng các cấu trúc giống như hoa được sản xuất trong ống nghiệm chủ yếu từ
các cơ quan hoa, ngoại trừ trong một trường hợp sử dụng mô chồi hoặc mô mỡ.
Trong hầu hết các trường hợp, sự kết hợp auxin (thường là NAA) và cytokinin
(thường là BA) có hiệu quả ở một trong các môi trường sau: MS (Murashige và
Skoog, 1962), W (White 1963), LS (Linsmaier và Skoog, 1965), N6 ( Nitsch và
Nitsch, 1969), B5 (Gambourg et al. 1968), bổ sung sucrose hoặc sữa dừa (Plessner
và Ziv 1999). Những PGR này đã được sử dụng để tái tạo vòng thứ tư, tức là, nhụy
hoa với đầu nhụy. Sự hình thành các cấu trúc đặc biệt in vitro tăng lên đã được báo
cáo khi môi trường được bổ sung auxin (NAA hoặc IBA) cùng với cytokinin,
kinetin hoặc BA (Sano và Himeno 1987), hoặc với nồng độ đường sucrose cao cùng
với BA, NAA và alanine (Otsuka et al. 1992). Chất lượng và số lượng các hợp chất

nghệ tây phụ thuộc vào loại mô hoặc cơ quan tái sinh in vitro (Plessner và Ziv,
1999). Các cấu trúc giống đầu nhụy từ các cơ quan hoa khác nhau chứa hàm lượng
thấp các sắc tố thơm (Sano và Himeno, 1987), hoặc thậm chí các sắc tố khác nhau
16


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

thường thấy ở thực vật trong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, trong một số trường
hợp, thành phần và số lượng của các hợp chất sắc tố và nghệ tây tương tự với các
chất tự nhiên trong planta (Sano và Himeno, 1987).
5. Hoa diên vĩ (Iris)

Wedgwood iris là cây một lá mầm (Rodrigues Pereira, 1961). Dưới điều kiện
tự nhiên, thân hoa phát triển trong củ sau khi trồng trong mùa lạnh (De Munk và
Schip-per, 1993), hoặc khi được lưu trữ ở 13oC trong một khoảng thời gian cụ thể
(Hartsema, 1961). Khi lưu trữ ở 25,5 ° C, chồi đỉnh sỉnh trưởng vẫn duy trì sinh
dưỡng trong hơn 10 tháng. Tuy nhiên, trong giai đoạn này, chồi đỉnh được tạo ra, và
khi chuyển sang 13°C, 60% số chồi đã trở thành hoa (Rodrigues Pereira, 1961).
Ethylene đã được tìm thấy để tăng cường sự phân biệt hoa bởi bóng đèn cở nhỏ
(Imanishi et al, 1994). Sử dụng nuôi cấy mô, Rodrigues Pereira (1961) đã kiểm tra
các tín hiệu mơi trường chuyển đổi chồi đỉnh từ sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản.
Ơng tương quan các tín hiệu với những thay đổi nội sinh trong các chất giống như
gibberellin có thể đóng vai trị như các chất trung gian nội bộ. Wedgwood iris là
một loại cây một lá mầm, ra hoa khơng phụ thuộc vào lượng ánh sáng ban ngày. Tín
hiệu bên ngoài chịu trách nhiệm cho sự thay đổi pha trong chồi được trung gian bởi
17


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

các yếu tố có trong thang đo. Do đó, quy mơ gây ra được phân lập từ đỉnh chồi và
được đặt trên bề mặt trung bình, hoặc chiết xuất chồi trong mơi trường làm tăng tỷ
lệ hình thành các đỉnh hoa, cho thấy tín hiệu cảm ứng được chuyển từ vảy sang
đỉnh. Ngược lại, các cơ quan giống như thùy màu tím có hình thái được hình thành
từ calli có nguồn gốc từ nụ hoa của Iris enstata bất kể nồng độ chất điều hòa sinh
trưởng trong thực vật trong môi trường. Hiện tượng này kéo dài trong hai năm liên
tiếp (Boltenkov và Zarembo, 2005).
6. Kniphofia leucocephala

Ra hoa in vitro của Kniphofia leucocephala (Asphodelaceae), một lồi có nguy
cơ bị tuyệt chủng ở Nam Phi, đã được quan sát thấy từ chồi bên trên môi trường MS
bổ sung PGR. Mức độ cao tương đối của BA (35.5 µM) tăng sự khác biệt về hoa
trong 30% số chồi (McCarten và Van Staden, 2003). Các hoa con chưa trưởng
thành (khơng có cơ quan sinh sản), dị dạng, và khơng có sắc tố, và cuối cùng
chuyển thành màu xanh lá cây. Trong sự hiện diện của cytokinin, sự khác biệt về
hoa được quan sát theo các chế độ dài ngày, ngắn ngày hoặc trung hòa trong ngày.
Trong số ba cytokinin được thử nghiệm, BA cho tỷ lệ cụm hoa cao nhất (60%) khi
được bổ sung 20 µM vào mơi trường. Việc trì hoãn hoa non phát triển bằng GA3
18


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

không nhấn mạnh tầm quan trọng của thời điểm áp dụng. Các tác giả đề xuất một sự
tương tác giữa sucrose và BA để thúc đẩy ra hoa ở Kniphofia (Taylor et al, 2005).
7. Hoa loa kèn (Lilium x cv. Star Gazer)

Ra hoa in vitro không đạt được trong Lilium. Tuy nhiên, một sự thay đổi giai
đoạn từ sự chưa trưởng thành đến giai đoạn trưởng thành đã được báo cáo

(Langens-Gerrits et al. 2003). Có ba giai đoạn trong chu trình trồng cây loa kèn:
một giai đoạn chưa trưởng thành, nơi một hoặc một vài lá với cuống lá bị sưng, một
giai đoạn trưởng thành thực vật, với thân và kéo dài và nhiều lá, và một giai đoạn ra
hoa, khi cụm hoa đầu cuối phát triển.Trong điều kiện tự nhiên, độ tuổi chưa trưởng
thành tương quan với kích thước củ. Do đó, sự chuyển đổi từ giai đoạn chưa trưởng
thành sang giai đoạn trưởng thành khi mô phân sinh có thẩm quyền, thường mất 1-2
mùa. Tuy nhiên, Langens-Gerrits et al. (2003) cho thấy rằng các viên nang được
trồng trong TC trong 12 tuần ở 25ºC sau 2-4 tuần ở 15ºC trở nên khả nạp sau một
thời gian ngắn hơn đáng kể. Sự chuyển đổi này được đặc trưng bởi sự phân chia tế
bào tăng lên trong mô phân sinh đỉnh. Các yếu tố như kích thước phóng xạ và nồng
độ sucrose, kích thích sự tăng trưởng và kích thước của củ, cũng tăng cường sự thay
đổi pha. nồng độ tăng cường một giai đoạn thay đổi bất kể kích thước củ. Tình trạng
sinh lý của củ góp phần vào sự thay đổi pha nhiều hơn kích thước của củ.Vì vậy,

19


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

trong nghiên cứu này các yếu tố liên quan đến khả năng mô phân sinh đã được
nghiên cứu. Những kết quả này có thể đóng góp vào các nghiên cứu về những thay
đổi nội sinh của PGR và hệ thống di truyền trong mô phân sinh đỉnh trước khi ra
hoa in vivo và in vitro.
8. Hoa lan (Orchids)

Nhiều cây lan được coi là cây có thân ngầm(các chồi sống qua mùa đông nằm
dưới mặt đất, thông thường gắn với thân hành, thân củ v.v...) vì thân rễ của nó hoặc
một thân hành giả (pseudobulb) của nó hoạt động như một cơ quan lưu trữ. Một số
nghiên cứu nuôi cấy hoa in vitro hoa lan đã được báo cáo bao gồm bốn loài
geophytic (Duan và Yazawa 1994, 1995b, Kostenyuk I, 1999, Chang và Chang,

2003). Phải mất 3-13 năm để tạo ra một cây hoa từ hạt giống, do đó làm cho chương
trình nhân giống rất chậm (Duan và Yazawa 1995b, Kostenyuk et al, 1999, Chang
và Chang 2003). Thời kỳ chưa trưởng thành có thể được rút ngắn đáng kể bằng mô
cấy vi mô (Duan và Yazawa 1994, Yu và Goh, 2001). Các hệ thống in vitro được sử
dụng để nghiên cứu cơ sở sinh lý và phân tử của quá trình ra hoa phong lan, thúc
đẩy ra hoa trong hoa lan trưởng thành chậm và cải thiện khả năng kiểm soát thời
gian ra hoa (Mudalige và Kuehnle, 2004). Các cơ sở phân tử của hoa trong hoa lan

20


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

đã được xem xét gần đây bởi Yu và Goh (2001) và Mudalige và Kuehnle (2004).
Bảy mươi gen đã được nhân bản cho đến nay từ 7 chi trong đó một số liên quan đến
ra hoa. Thơng tin về biểu hiện gen trong quá trình chuyển đổi sang hoa đã được
thiết lập ở Dendrobium spp. sử dụng hệ thống hoa in vitro (Yu và Goh 2000).
9. Cymbidium spp.

Trong tự nhiên, thời kỳ chưa trưởng thành của Cymbidium niveo-marginatum
và C. ensifolium var. misericors kéo dài 4-7 năm. Các nghiên cứu cho thấy hoa in
vitro sau 40-100 ngày từ các cây con nuôi cuối cùng (Kostenyuk et al.1999, Chang
và Chang 2003). Hiện tượng này được thể hiện trong các thí nghiệm của C. niveomarginatum được sử dụng trong 22 năm ni cấy phụ (Kostenyuk et al. 1999) hoặc
từ calli có nguồn gốc từ rễ của C. ensifolium var. misericors (Chang và Chang
2003). Các hệ thống in vitro được sử dụng để nghiên cứu vai trò của PGR trong
việc phát triển và phát triển hoa. Vì cây lan Cymbidium được coi là cây không phụ
thuộc vào ánh sáng mặt trời (DNP) (Dole và Wilkins, 2004), nên vai trò của PGR là
cần thiết cho nghiên cứu kiểm soát di truyền để cải thiện cây trồng (Ko-stenyuk et
al, 1999). C. niveo-marginatum phản ứng với cytokinin và auxin khác với C.
ensifolium var. misericors. Trong cấy hoa in vitro xảy ra ở những loài này với sự có

mặt của NAA và các cytokinin khác nhau.Trong C. niveo-marginatum với 44,4 µM

21


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

BA cho kết quả tốt nhất (Kostenyuk I. 1999), trong khi cụm hoa của C. ensifolium
var. misericors phát triển với sự hiện diện của 10 µM 2iP (N6- (2-sopentenyl)
adenine), nhưng không phải với BA trong môi trường (Chang và Chang 2003).
Khơng có cụm hoa nào được quan sát thấy trong sự hiện diện của NAA trong môi
trường (Chang và Chang 2003, Kostenyuk et al 1999), và do đó vai trò auxin trong
sự khởi đầu và phát triển hoa khơng rõ ràng. TDZ có hiệu quả cho việc khởi đầu
hoa ở cả hai lồi. Tuy nhiên, nó dẫn đến sự kém phát triển của C. niveo-marginatum
và nụ hoa héo sau một thời gian ngắn (Kostenyuk et al. 1999). Sự khác biệt trong
phản ứng có thể liên quan đến các lồi, nguồn gốc của các mơ cấy, hoặc giai đoạn
sinh lý của cây mẹ. Phản ứng tích cực với cytokinin là phù hợp với các báo cáo
khác về việc ra hoa sớm ở hoa lan khi sử dụng cytokinin cao (Duan và Yazawa,
1995a). Tuy nhiên, ở những lồi này, khơng rõ liệu cytokinin có cần thiết cho sự
phát triển hoa hoặc phát triển hoa hay khơng.(Kostenyuk et al.1999). Nó cũng gợi ý
rằng GA3 tương tác với PGR khác trong cảm ứng hoa và phát triển của C. niveo marginatum. Giảm lượng nitơ thúc đẩy trong hoa in vitro của C. niveo-marginatum
khi BA có mặt trong mơi trường. Nguồn P cung cấp điều kiện thuận lợi cho việc
trồng hoa trong ống nghiệm của Cymbidium (Kostenyuk và et al 1999, Chang và
Chang 2003).
10. Doritis pulcherimma x Kingiella philipinensis

22


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

Ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến phát triển hoa đã được nghiên cứu
trong các cây con Doritis pulcherrima x Kingiella philippiensis (xDoriella Tiny) có
nguồn gốc từ cuống hoa. Những bông hoa in vitro thể hiện màu sắc, kích cỡ và hình
dạng bình thường khi so sánh với hoa trong điều kiện tự nhiên (Duan và Yazawa,
1994, 1995b). Trong hoa in vitro xảy ra ở các cây con sau 6-7 (Duan và Yazawa,
1994) hoặc 10-12 (Duan và Yazawa, 1995b) tháng trong phịng ni trái ngược với
3 năm trong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, những nụ này héo từ khi chuyển sang
mơi trường khơng có BA. Chồi hoa đã được quan sát thấy trên môi trường nitơ thấp
bổ sung với 14,4 µM BA sau 80 ngày. Nồng độ nitơ tối ưu là 6-9 mM và có lợi hơn
khi tỷ lệ cao các ion NH4 + / NO3- được bổ sung. Ngoài ra, loại bỏ rễ cũng kích
thích hình thành nụ hoa in vitro. Các tác giả kết luận rằng BA là cần thiết cho sự
hình thành nụ hoa nhưng ức chế sự phát triển hoa hoàn chỉnh.
11. Ornithogalum arabicum

Các tín hiệu mơi trường liên quan đến cảm ứng hoa và GA3 như là một thay thế cho
các tín hiệu bên ngồi đã được sử dụng trong ra hoa in vitro (Halaban et al, 1965).
Sự chuyển đổi từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản trong nụ
Ornithogalum xảy ra bên trong củ trong mùa trước khi ra hoa. Sự thay đổi này và sự
phát triển của hiện tượng quang hợp theo các điều kiện nhiệt động cụ thể để kích
thích, bắt đầu và kéo dài của cụm hoa. Các tác giả thấy rằng 16 tuần ở 30ºC gây ra
sự thay đổi giai đoạn này các nụ được cắt bỏ trong ống nghiệm. Cụm hoa được phát
triển in vitro nếu nụ được giữ trong 6 tuần ở 20ºC, sau đó là 4 tuần ở 13ºC. Tốc độ

23


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

phát triển của hoa trong ống nghiệm tăng lên với kích thước đầu chồi (một đầu chồi

lớn hơn được tạo thành từ đỉnh). Các mơ vảy đóng góp vào tốc độ tăng hơn so với
lá nguyên thủy. Các cụm hoa được phát triển trên một môi trường với các yếu tố vĩ
mô của Knop (Knop, 1865) và vi mô của Heller (Heller, 1953), bổ sung 2% sucrose
và agar 0,8%. Tuy nhiên, trong ra hoa in vitro chỉ được thể hiện trong chồi. Trong
nghiên cứu này GA 3 là chất điều chỉnh tăng trưởng duy nhất được thử nghiệm.
GA3 (0,29 mM) khơng thể kích thích sự ra hoa trong ống nghiệm mà gây ra sự tắc
nghẽn của mô phân sinh và ức chế sự kéo dài của lá. Không có sự khác biệt về hoa
được quan sát thấy trong những đỉnh này.
12. Nhân sâm (Panax ginseng)

Rút ngắn thời gian chưa trưởng thành bằng phương pháp điều chỉnh khơng khí
(CA). Các chương trình nhân giống của nhân sâm có khoảng thời gian thuận lợi là 3
năm (Chang và Hsing, 1980). Hoa nhân sâm in vitro được lấy từ các cây con phát
triển từ một nguồn giống chưa trưởng thành (Lee et al, 2003a, 2005). Nuôi cấy hoa
in vitro trong thời kỳ chưa trưởng thành được rút ngắn thu được trực tiếp từ phôi
zygotic (Lee và cộng sự 1991), hoặc gián tiếp từ phôi soma (Lee và cộng sự 1990,
Tang 2000). Nuôi cấy in vitro từ các nguồn thực vật trưởng thành thu được từ phơi
soma có nguồn gốc từ mơ sẹo gốc của cây trưởng thành (Chang và Hsing 1980, Lin
et al 2005) hoặc được khuếch đại từ cụm hoa phát triển từ cây trồng trưởng thành
24


Đồ án: Ra hoa in vitro trên cây có thân ngầm trong đất

(Lin et al. 2003a) .Hoa xuất hiện sau 1-1.5 tháng ni cấy trên mơi trường có 1 nửa
nồng độ MS, nồng độ B5 đầy đủ hoặc MS trung bình. BA (4.4-5 µM) trong mơi
trường là rất cần thiết cho phát triển hoa, nhưng hiệu quả đã bị chặn bởi 5 µM ABA
(Lee et al, 1991). BA được thay thế thành cơng bằng 0,5-4,5 µM TDZ với sự hiện
diện của 0,3-2,9 µM GA3 (Lin et al. 2005). GA 3 (5 µM) là cần thiết khi có sự hiện
diện của ABA (Lee et al, 1991). Tuy nhiên, Tang (2000) cho thấy một tỷ lệ thấp (ít

hơn 6%) của hoa in vitro trong sự hiện diện của 5.8 hoặc 11,6 µM GA3, trong cây
con có nguồn gốc từ chồi hoặc phơi soma. Điều này cho thấy vai trò của gibberellin
trong cảm ứng hoặc phát triển hoa khơng rõ ràng. Sự hình thành hoa in vitro bị ức
chế bởi nồng độ NAA cao (27 µM). Ngược lại, liều thấp hơn (5.4 µM) dường như
khơng có hiệu quả (Lin et al. 2005). Những bơng hoa được hình thành trên các
nhánh của nách dài. Chúng nhỏ hơn một vài lần so với hoa in vivo, nhưng mang
những lỗ hổng phát triển tốt (Lee et al, 1990) với phấn hoa màu mỡ (Chang và
Hsing, 1980). Trái non chưa trưởng thành phát triển từ hoa (Lee et al, 1990, 1991),
cuối cùng đã thối hóa trước khi trưởng thành. Phấn hoa vô trùng đã được quan sát
thấy trong cụm hoa được khuếch đại trực tiếp từ cụm hoa khác (Lin et al, 2003a).
13. Dạ lan (Hyacinthus orientalis)

Sự tái sinh của các cơ quan hoa và hoa hoàn chỉnh của Hyacinthus có thể từ các
phân đoạn của bao hoa (Lu et al, 1988).Sự phát sinh cơ quan trực tiếp được đã được
quan sát trong vịng 50-200 ngày ni cấy, cung cấp một hệ thống nghiên cứu các
yếu tố kiểm sốt sự phát triển của hoa. Hoa lục bình phát triển trong bốn vòng liên

25