Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài thuộc chi trung quân ancistrocladus ở việt nam

Luận văn thạc
sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

PHẠM THỊ THANH HƯƠNG

NGHI N C U A DẠNG DI TRU ỀN M T S O I THU C
CHI TRUNG QUÂN (ANCISTROCLADUS) Ở VI T NAM.
UẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2016
1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

PHẠM THỊ THANH HƯƠNG

NGHI N C U A DẠNG DI TRU ỀN M T S O I
THU C CHI TRUNG QU N ANCISTROCLADUS) Ở VI T NAM.
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121
UẬN VĂN THẠC S KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. ê Quỳnh iên
PGS.TS. N uy n Thị Hồn V n

Hà Nội, 2016


ỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên (Viện Hóa
sinh biển, Viện HLKHCNVN) và PGS.TS. Nguy n Th H ng Vân ( ộ m n
i truy n học, Trường Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN) đã tận tình
hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đ tài.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn ThS. Nguy n Chi Mai (Viện Hóa sinh
biển, Viện HLKHCNVN) đã gi p đ em trong suốt qu trình em làm đ tài.
Em xin chân thành cảm ơn đến c TS. Lê Th Thu Hi n (Viện nghiên
cứu hệ gen, Viện Hàn lâm khoa học c ng nghệ Việt Nam) đã gi p đ em
trong qu trình thực hiện đ tài.
Em xin trân trọng cảm ơn của mình đến c n bộ giảng viên ộ m n Sinh
học-Học viện Y ư c học c truy n Việt Nam đã tạo đi u kiện gi p đ em
trong suốt qu trình học tập, hồn thiện luận văn này.
Cảm ơn thầy c , anh ch Phòng c ng nghệ Y-Sinh (Trung tâm Ph t triển
c ng nghệ cao, Viện HLKHCNVN) đã tận tình gi p đ và tạo đi u kiện cho
em hoàn thành đ tài
Cuối c ng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn b đã lu n ủng hộ và
gi p đ em trong qu trình em làm đ tài này.

Hà Nội, th ng 05 năm 2016
Học viên

Ph Thị Th nh H n

MỤC ỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
MỞ ẦU.................................................................................................................. 1

1. Lí do chọn đ tài............................................................................................1
2. Mục tiêu.........................................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI I U
1.1. Chi Trung quân Ancistrocladus..................................................................3
1.1.1. Phân loại học...........................................................................................3
1.1.2. Sơ lư c v chi Trung Quân......................................................................3
1.2. Đa dạng di truy n chi Trung Quân.............................................................6
1.3.Tình hình nghiên cứu chi Trung Quân ở Việt Nam....................................7
1.4. Đ nh gi đa dạng di truy n bằng phương ph p sinh học phân tử..............8
1.5. Các chỉ th

NA trong đ nh gi đa dạng di truy n.....................................8

1.5.1. Chỉ th đa hình trình tự đoạn DNA..........................................................8
1.5.2. Chỉ th đa hình trình tự DNA.................................................................11
1.5.3. T ng quan hệ gen..................................................................................12
1.5.4. T ng quan v chỉ th ITS và MatK trong đ tài.....................................14
1.5.5. Phương ph p xây dựng cây ph t sinh chủng loại trong nghiên cứu.......17
CHƯƠNG 2: VẬT LI U V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U.
2.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................18
2.2. Hóa chất, thiết b........................................................................................19
2.3. Phương ph p nghiên cứu..........................................................................19
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu.....................................................19
2.3.2. Phương ph p t ch

NA t ng số từ lá....................................................19


2.3.3. Phương ph p nhân đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR......................................20
2.3.4. Tinh sạch sản ph m PCR...................................................................................23
2.3.5. Gắn sản ph m PCR vào vector t ch dòng pT257 R/T.................................23
2.3.6. iến nạp NA plasmid vào tế bào E. coli H5α.............................................24
2.3.6. T ch chiết

NA plasmid.......................................................................25

2.3.7. Phương ph p điện di kiểm tra kết quả..................................................26
2.3.8. Phương ph p phân tích trình tự nucleotide và phân tích cây phát sinh
chủng loại..............................................................................................26
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
3.1. Kết quả tách DNA t ng số........................................................................28
3.2. Kết quả nhân c c đoạn chỉ th bằng phương ph p PCR.......................29
3.3. Kết quả gắn sản ph m PCR vào vector tách dòng pTZ57 R/T................30
3.4. Kết quả x c đ nh trình tự..........................................................................34
3.5. Kết quả phân tích đa dạng di truy n của Trung quân nghiên cứu............34
3.6 Thảo luận...................................................................................................49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận..........................................................................................................52
Kiến ngh..........................................................................................................52
TÀI LI U THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ANH S CH C C CH VI T T T

Amp

Ampicillin

bp

base pair

CTAB

Cetyl Trimethyl Amoni Bromid

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

ETDA

Ethylenediamine tetra acetic acid

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactoside

ITS

Internal Transcribed Spacer

ISSR

Inter Simple Sequence Repeat

LB

Luria and Bertani

MatK

Maturase K

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

rpm

Revolutions per minute

RNase

RiboNuclease

SDS

Natri Dodecyl Sulfat

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Melting temperatures (Nhiệt độ nóng chảy)

Kb

Kilobase


UV

Ultraviolet

VNTR

Variable Number Tandem Repeat (Đoạn lặp lại kế tiếp)

X- gal

5-bromo-4chloro-3indolyl-β-D-glactopyranoside


DANH SÁCH CÁC H NH
Tên hình

Trang

Hình 1.1. Cây Trung quân A. conchinchinensis Gagnep............................................4

Hình 1.2. Cây Trung quân A. tectorius (Lour.)Merr...................................................4
Hình 1.3. Cây Trung quân A. wallichii Planch...........................................................5
Hình 1.4. Cây Trung qn A. scanders Planch...........................................................5
Hình 2.1. Cấu trúc vector tách dịng pTZ57 R/T.....................................................24
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA t ng số các mẫu Trung quân........................................28
Hình 3.2. Ảnh điện di sản ph m PCR mẫu Trung quân bằng m i MatKF-MatKR 29
Hình 3.3. Ảnh điện di sản ph m PCR mẫu Trung quân bằng m i ITS1-ITS4.

30

Hình 3.4. Đĩa nu i cấy xuất hiện khu n lạc xanh (khơng khoanh trịn) và trắng
(khoanh trịn) trên m i trường có kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG....................31
Hình 3.5. Kết quả điện di sản ph m PCR bằng m i M13F/R của trình tự đoạn ITS
đã đư c gắn vào vector tách dịng pTZ57 R/T.........................................................32
Hình 3.6. Kết quả điện di sản ph m PCR bằng m i M13F/R của trình tự đoạn MatK
đã đư c gắn vào vector tách dịng pTZ57 R/T.........................................................33
Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại thiết lập dựa trên trình tự đoạn ITS của 12 mẫu
Trung quân nghiên cứu cùng 40 mẫu Trung quân tham khảo trên ngân hàng
GenBank..................................................................................................................36
Hình 3 8. Cây phát sinh chủng loại thiết lập dựa trên trình tự đoạn gen MatK của 12
mẫu Trung quân nghiên cứu cùng 32 mẫu Trung quân tham khảo trên ngân hàng
GenBank..................................................................................................................37
Hình 3.9. Trình tự đoạn ITS mẫu Trung quân..........................................................44
Hình 3.10. Trình tự đoạn gen MatK mẫu Trung quân..............................................46


DANH MỤC BẢNG
Tên bản

Trang

Bảng 2.1. Danh sách mẫu Trung quân.............................................................18
Bảng 2.2. Các m i đư c sử dụng trong các phản ứng.....................................21
Bảng 2.3. Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl...........................21
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn gen MatK...............22
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân trình tự đoạn ITS............22
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp m i M13F/R.......22
Bảng 2.7. Thành phần cho phản ứng lai ghép.................................................24
Bảng 3.1. Bảng thống kê các trình tự trên ngân hàng Genbank có tỷ lệ tương
đ ng lớn nhất với các trình tự phân tích..........................................................40
Bảng 3.2. Độ tương đ ng v trình tự nucleotide của đoạn gen MatK giữa các
mẫu Trung quân nghiên cứu............................................................................41
Bảng 3.3. Độ tương đ ng v trình tự nucleotide của đoạn ITS giữa các mẫu
Trung quân nghiên cứu....................................................................................41


MỞ ẦU
1. Lí do chọn đề tài

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong
phú với ước đo n khoảng 12.000 lồi, trong đó
số lồi đã đư c ghi nhận là 11.000 lồi thực vật
bậc cao có mạch (Viện ư c liệu, 2004). Sự đa
dạng v số lư ng và chủng loại c ng đi u kiện sinh
trưởng của ch ng đã làm giàu ngu n tài nguyên
cây làm thuốc tại Việt Nam với khoảng 30% t
ng số loài thực vật đư c sử dụng trong các bài
thuốc truy n thống. Kết quả đi u tra ngu n tài
nguyên dư c liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001–
2005 của Viện dư c liệu (2006) cho biết Việt

Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và
nấm đư c dùng làm thuốc; trong đó, nhóm thực
vật bậc cao có mạch có 3.870 lồi (Viện ư c
liệu, 2006). Đây là ngu n tài nguyên thiên nhiên
to lớn đối với con người đặc biệt là trong y học,
đư c d ng để chăm sóc và chữa bệnh cho mọi
người nhất là nước ta có truy n thống lâu đời d
ng cây con làm thuốc. Tuy nhiên, trước tình
hình khai thác và tận thu quá mức, nhi u loại cây
dư c liệu b thu hẹp khu vực phân bố và đứng
trước nguy cơ biến mất trong tự nhiên. Do vậy,
nghiên cứu đa dạng sinh học của các cây dư c
liệu là hết sức cần thiết, nhằm tạo cơ sở để đ nh
giá ti m năng của ch ng cũng như có phương án
bảo t n, quản lý và khai thác h p lý. Từ trước
đến nay, các nghiên cứu đa dạng sinh học các
loài thực vật Việt Nam chỉ tập trung nghiên cứu
v hình thái. Tuy nhiên, số lư ng lồi thực vật tại


Việt

Chi Trung quân (Ancistrocladus) phân

Nam

bố ph biến tại Châu Phi, Ấn Độ và v ng Đ ng

phon

Nam , là loại thực vật có chứa nhi u h p chất

g

alkaloid gi tr v y học, trong đó h p chất

phú,

dimeric naphthylisoquinon alkaloids hay cịn

nhi

gọi là michellamnes

u

có khả năng ức chế sự sinh trưởng của virus

loài

gây suy giảm mi n d ch ở người HIV ở mức

có

độ in vivo (McMahon et al., 1997). Ngồi ra,

hình

nhi u h p chất kh c t ch từ chi Trung quân có ti

th

i

m năng kh ng khu n, chống oxy hóa và ức chế

tươn

sinh trưởng của tế bào u tủy ( ringmann et al.,

g đối

2012). Nhi u nghiên cứu cho thấy c c lồi

giốn

Trung qn

g
nhau
gây
khó
khăn
cho
phân
loại
thực
vật.
o
đó,

đánh
giá
đa
dạng


kh c nhau có thành phần c c chất hóa học kh c nhau, đặc biệt là nhóm alkaloid
có ti m năng y - dư c (Meimberg et al., 2010). Hơn nữa, ph alkaloid thu đư c từ
loài
A. conchinchinesis ở Việt Nam kh kh c biệt so với ph c ng loài đã c ng bố
trên thế giới (Nguy n et al., 1996; 1997). Trên thực tế, những nghiên cứu đa
dạng di truy n chi Trung quân trên thế giới và tại Việt Nam cịn rất ít. Nhằm
tạo cơ sở cho những nghiên cứu v khả năng sử dụng của c c loài thuộc chi
Trung quân, chúng t i đ xuất đ tài “N hiên cứu đ d n di truyền ột số ài
thuộc chi Trun quân (Ancistrocladus) ở Việt N ”
2. Mục tiêu
Đ nh gi đa dạng di truy n và đ nh lồi dựa trên đoạn trình tự ITS (r
NA) và đoạn gen MatK (cp NA) của c c mẫu Trung quân thu đư c từ ba mi n
ắc-Trung- Nam.


Ch n 1. TỔNG QUAN T I I U
1.1. Chi Trung quân (Ancistrocladus)
1.1.1. Ph n i học
Chi Trung quân (danh pháp khoa học: Ancistrocladus) đư c xếp vào giới
Plantae (thực vật), ngành Magnoliophyta (thực vật có hoa), lớp Magnoliopsida
(thực vật hai l mầm). Trong hệ thống phân loại APG II (Angiosperm Phylogeny
Group II) 1998 cũng xếp chi Trung quân trong bộ C m chướng (Caryophyllales)
và họ Ancistrocladaceae (Philippe Cuennoud et al., 2002)
1.1.2. S ợc về chi Trung quân (Ancistrocladus)

Ancistrocladus thuộc họ Ancistrocladaceae, phân bố chủ yếu tại c c quốc
gia thuộc khu vực nhiệt đới, chủ yếu thuộc châu Phi, Tây Ấn, Srilanka và Đ ng
Nam . Tất cả c c loài thuộc chi Trung quân đ u là dạng dây leo, cành có móc. L
mọc sole, hình ngọn gi o, mép l nguyên. Hoa lư ng tính, xếp thành cụm hoa ch
y. L đài 5, khi kết quả thì ph t triển thành c nh k m theo quả. C nh hoa 5, xếp
vặn. Nh 5-10 trong đó có 5 nh ngắn hơn. ầu có 1 , 1 nỗn mọc ở gốc. Quả kh
ng mở, có c nh, hạt gần trịn (Gereau, 1997). Danh lục c c lồi thực vật Việt
Nam (tr. 440) mơ tả 3 lồi trong chi Trung quân g m A. conchinchinensis
Gagnep., A. tectorius (Lour.) Merr., và A. wallichii Planch Merr (Nguy n Tiến
ân chủ biên, NX Đại học Quốc gia). Trong danh lục cây cỏ Việt Nam, A.
scanders (Lour.) Merr là loài thứ tư đư c t c giả Phạm Hoàng Hộ đã m tả (tr.
339-340). C c loài này mọc hoang dã và phân bố rải r c ở c c v ng n i Việt Nam
tập trung ở khu vực Tây Nguyên, Đ ng Nai, Kiên Giang (Phạm Hoàng Hộ,
2003).


Hình 1.1. Ancistrocladus conchinchinensis Gagnep
(Ngu n: )

Hình 1.2. Ancistrocladus tectorius (Lour.) Merr
(Ngu n: />

Hình 1.3. Ancistrocladus Wallichii Planch
(Ngu n: )

Hình 1.4. Ancistrocladus scandens (Lour.) Merr
(Nguồn: )


Đã từ lâu, l và thân Trung quân đư c nhi u cộng đ ng v ng Châu Phi và

Đ ng Nam sử dụng trong những bài thuốc tr bệnh như trong bài thuốc chữa sốt
rét và kiết lỵ ở Th i Lan (Ruangrungsi et al., 1985); chữa c c bệnh gan ở
Malaysia (Ong et al., 2012) hay chữa đau nhức xương và b i b sức khỏe đặc
biệt là cho phụ nữ sau sinh ở Việt Nam (Đỗ Tất L i, 2005). Tại Ghana và
Cameron, cây Trung quân có t c dụng tr sốt, đau răng hay bệnh sởi (Elujoba et
al., 2005). Gần đây, các nhà khoa học đã t ch đư c nhi u h p chất quý từ cây
Trung quân, đi u này đã phần nào giải thích tính đa c ng dụng của chi này (
ringmann et al., 2012).
Ngồi ra, Trung qn cịn có t c dụng bảo vệ rừng đặc biệt là l . L cây
Trung quân rất xanh tươi và đặc biệt là khó cháy; do đó cịn đư c sử dụng như
ngu n nguyên liệu l p nhà trong thời kỳ chiến tranh bom đạn c liệt mà người dân
Việt Nam kh ng bao giờ quên.
1.2. d n di truyền củ chi Trun qu n
Mặc d có chung cấu tạo l với c c móc câu, hình dạng l c c c thể trong
chi Trung quân rất đa dạng nên việc đ nh lồi dựa vào hình th i gặp nhi u
hạn chế (Van Steenis, 1948). Việc x c đ nh loài trong chi Trung quân, đặc
biệt là khu vực Đ ng Nam còn nhi u bàn cãi. Gereau (1997) đã m tả hình th i
của 25 lồi trong chi Ancistrocladus Wallichii, trong đó 9 lồi đư c tìm thấy
tại v ng khí hậu nhiệt đới ở châu . Tới nay, khoảng 30 loài thuộc chi
Ancistrocladus đã đư c m tả trong danh lục, trong đó có 14 lồi tìm thấy ở
Châu . Khu vực Đ ng Nam đư c cho là có mức đa dạng loài Trung quân
cao. Tuy nhiên, do những nhận đ nh đầu tiên của Van Steenis (1948) v một
loài Trung quân A. tectorius (Lour) Merr duy nhất ở Đ ng Nam và việc
nghiên cứu đa dạng hình th i và di truy n trên đối tư ng thực vật này không
đư c ch trọng, nên hầu như những mẫu Trung quân thu đư c tại khu vực Đ
ng Nam đ u cho là thuộc loài A. tectorius. Trên thực tế, Taylor (2005) đã m
tả thêm 2 loài mới trong “A. tectorius complex” trước đây nâng t ng số loài
trong complex này lên tới 6 g m là A. extensus Wall. ex Planch., A.
pinangianus Wall. ex Planch., A. conchinchinensis Gagnep., A. harmandii

Gagnep., A. hainanensis Hayata Icon., và A. carallioides Craib ull với đi u
kiện sinh trưởng


rất đa dạng. Nghiên cứu đa dạng di truy n và đa dạng hóa học cho thấy có
mối liên quan giữa v ng đ a lý và thành phần h p chất naphthylisoquinoline
alkaloid giữa c c lồi Trung qn. Ví dụ như trong mẫu Trung quân thu đư c
tại phía Nam Malaysia, isoquinon kh ng liên kết với naphthalene. Cấu tr c
này kh c biệt so với c c isoquinon phân t ch từ loài tương tự tại khu vực kh c
thuộc Đ ng Nam nhưng lại giống cấu tr c của h p chất isoquinon thu đư c từ
loài A. korupensis tại Châu Phi. Ph của c c h p chất alkaloid thu từ c c mẫu
Trung quân tại Việt nam cũng có nhi u điểm kh c so với ph alkaloid trong c
c nghiên cứu trước đó (Nguyen et al., 1996: 1997). Khi so s nh trình tự một
số gen lục lạp như trnK hay sử dụng c c phương ph p đ nh gi đa hình di truy
n gen nhân như interal transcribed spacers (ITS) và trình tự inter- simple
sequence repeat (ISSR) ba nhóm mẫu Trung quân thu đư c tại 3 v ng đ a lý kh
c biệt tại Đ ng Nam , Ấn Độ và Tây Phi cho thấy độ đa dạng di truy n cao.
Trên cây phát sinh chủng loại, mẫu tại 3 v ng đ a lý trên tạo thành 3 nhóm
riêng biệt. Tuy nhiên độ đa dạng dựa trên chỉ th phân tử trnK intron hay ITS
trong từng nhóm lại tương đương với hai nhóm cịn lại; riêng độ đa dạng dựa
trên chỉ th ISSR của nhóm Trung quân Đ ng Nam , di truy n phân tử ISSR
cho thấy c c lồi Trung qn phía ắc và phía Nam tạo thành những tập h p
kh c nhau. Hệ số x c đ nh (coefficient of determination: R2) của từng chỉ th
phân tử trnK, ISSR và ITS tương ứng là 0.499, 0.372 và 0.212; cho thấy
mức đa dạng di truy n của chi Trung quân tại Đ ng Nam là rất cao
(Meimberg et al., 2010).
1.3. Tình hình nghiên cứu chi Trung quân t i Việt Nam
Cây Trung quân đư c nhân dân biết đến như những v thuốc chữa đau nhức
xương và b i b sức khỏe đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh ở Việt Nam (Đỗ Tất L i,

2005). Trong nghiên cứu phối h p giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam) và Đại học Halle (CHL Đức) các h p chất thuộc nhóm
alkaloid g m 6-O-methylhamateine, hamatinine, 6-O-methylhamatinine,6-Odemethy-7-epi-ancistrobrevineD, 7-epi-ancistrobrevine D và 6-O-demethyl-8-Omethyl-7-epi-ancistrobrevine D từ lồi A. cochinchinensis đã đư c cơng bố tách


chiết thành cơng tại Việt Nam. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu tại khoa ư c thuộc
trường Đại học Y – ư c Thành phố H Chí Minh g m Phạm Đ ng Phương, Trần Hùng
đã có những nghiên cứu v khảo s t t c động độc tính tế bào của các thành phần
alcaloid và naphthoquinon trong 3 loài Ancistrocladus ở Việt Nam. Đến nay, tại Việt
Nam rất ít đ tài nghiên cứu v sự đa dạng di truy n của chi Trung quân và đ tài này
cũng góp phần cho khai thác và sử dụng b n vững ngu n tài nguyên thực vật này ở
nước ta.
1.4. ánh iá đ d ng di truyền bằn ph n pháp sinh học phân tử
Đa dạng di truy n là những kh c nhau v mặt di truy n giữa c c quần thể
thực vật nói chung và cây tr ng nói riêng. Sự đa dạng xảy ra ở ba mức độ: đa
dạng di truy n (là những thay đ i gen và kiểu gen), đa dạng loài (là sự phong ph
của loài) và đa dạng sinh th i (là tất cả c c loài và m i trường sống của ch ng)
(Nguy n Đức Thành, 2016).
C c chỉ th v hình th i như: màu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh
trưởng, sự biến đ i sắc tố rất hữu ích cho c c nhà chọn giống. Ưu điểm của
chỉ th này là kh ng tốn kém và đ ng trội. Tuy nhiên, như c điểm của của chỉ
th này hạn chế v số lư ng, b ảnh hưởng bởi yếu tố m i trường và giai đoạn
ph t triển (Nguy n Đức Thành, 2016). Với sự ph t triển của c c kỹ thuật sinh
học phân tử, c c chỉ th NA đang đư c sử dụng rộng rãi trong phân tích đa
dạng di truy n ở tất cả c c loài từ vi sinh vật tới con người. NA t n tại trong
mọi tế bào sinh vật, có thể nghiên cứu trực tiếp hệ gen của sinh vật kh ng b
ảnh hưởng bởi yếu tố m i trường và giai đoạn ph t triển của cây. Sử dụng chỉ
th NA có thể truy đư c ngu n gốc c c dạng sinh vật sống và kể cả đã chết.
Có hai loại chỉ th NA đư c d ng trong đ nh gi đa dạng di truy n: chỉ th v đa
hình đoạn NA (ví dụ như chỉ th ISSR, RFLP) và chỉ th v đa hình trình tự

NA.
1.5. Các chỉ thị DNA tr n đánh iá đ d n di truyền
1.5.1. Chỉ thị đ hình trình tự đ n DNA


Chỉ th đa hình chi u dài đoạn NA chủ yếu dựa vào c c đột biến thêm đoạn
hoặc mất đoạn trên đoạn đích của genome ở v ng biểu hiện kiểu hình (exon) và
cả


v ng kh ng biểu hiện kiểu hình (intron) của c c loài động, thực vật. Trong chỉ th
này, số lư ng và kích thước c c băng vạch NA đư c nhân lên bằng PCR hay đư c
phân cắt bởi c c enzyme cắt sẽ là cơ sở để đ nh gi mức độ đa dạng của đối tư ng
nghiên cứu. C c kĩ thuật ph biến để đ nh gi đa dạng di truy n dựa trên chỉ th này
có thể kể đến như: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom Amplified
Polymorphic DNA), SSR (Simple sequence repeat).
1.5.1.1. Kĩ thuật RFLP
Kỹ thuật RFLP nghiên cứu tính đa hình chi u dài của c c phân đoạn đư c cắt
bởi các enzyme giới hạn (Nguy n Nghĩa Thìn, 2008). Kỹ thuật này dựa trên đặc
điểm của các enzyme giới hạn khác nhau nên khi thực hiện phản ứng cắt DNA các
đi u kiện thích h p phân biệt trên điện di đ . C c đoạn cắt còn đư c gọi là “dấu vân
tay” đặc trưng cho từng phân tử DNA.
RFLP có ưu điểm là chỉ th đ ng trội cho phép phân biệt đư c c thể đ ng
h p và d h p. ản đ di truy n sử dụng chỉ th RFLP có tính chính x c cao,
thường đư c sử dụng trong nghiên cứu sự kh c biệt trong cấu tr c bộ gen của
c c c thể, các loài. Kh ng chỉ có ứng dụng trong nghiên cứu NA genome mà
RFLP còn giúp cho sự ph t hiện ra c c biến d của NA lục lạp một c ch d dàng
hơn. evos et al. (2003) đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truy n loài
Dactylohira (Orchidaeace) ở Châu Âu bằng chỉ th RFLP, kết quả cho thấy có

biến d cao ở hệ gen lục lạp. Tuy nhiên như c điểm của phương ph p này là
qui trình thực hiện phức tạp, tốn thời gian, và yêu cầu có DNA lớn, c ng
việc phân tích cần đến đ nh dấu phóng xạ đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ
thuật này (Nguy n Nghĩa Thìn, 2008).
1.5.1.2. Kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) đư c hiểu là
sự đa dạng của c c đoạn NA đư c nhân lên có đ nh hướng sau khi b cắt bởi hai
enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn NA làm khu n cho phản ứng
khuếch đại PCR.


Ưu điểm của phương ph p trên là khuếch đại có chọn lọc một lư ng lớn các
đoạn NA đa hình trong một phản ứng PCR, phù h p cho việc phân tích đa dạng
giữa các quần thể có quan hệ gần nhau và kh ng cần biết trước trình tự NA của
gen cần nghiên cứu. Cũng dựa vào chỉ th AFLP, Nguy n Th Kim Liên và cs,
(2009) phát triển chỉ th STS dựa trên phân đoạn AFLP liên kết với một số tính
trạng hình thái r trong chọn dòng lúa ch u hạn. Aggarwal et al. (1999) đã sử
dụng chỉ th AFLP để nghiên cứu phát sinh chủng loại ở lúa. Tuy nhiên như c
điểm là quy trình dài, phức tạp, tốn nhi u thời gian thực hiện (Nguy n Nghĩa
Thìn, 2008).
1.5.1.3. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAP dựa trên kỹ thuật PCR, bằng c ch sử dụng những m i
ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu
nhiên những đoạn NA có trình tự b sung với trình tự của c c primer. C c đoạn
m i oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của
mạch khu n
NA trong khoảng c ch có thể khuếch đại đư c (dưới 3000bp) sẽ cho ra những
đoạn NA có kích thước kh c nhau sau khi khuếch đại. Sự có mặt của c c sản
ph m NA kh c nhau chứng tỏ đã có một sự tương đ ng hồn tồn hay một phần
giữa NA bộ gen và m i. C c m i d ng trong RAP thường ngắn vì vậy d dàng

tìm đư c c c đoạn tương đ ng trên mạch đơn NA bộ gen.
Ưu điểm kỹ thuật trên là đ nh gi toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại tính đa
hình cao do vậy có thể phát hiện nhanh tính đa dạng di truy n. (Nguy n Nghĩa Thìn,
2008). Nguy n Đức Thành và cs, (2009) sử dụng chỉ th RAP đ nh gi đa dạng di
truy n loài Sao mạng (Hopea reticulate Tardicu) dựa trên phân tích một số chuỗi
DNA lục lạp. Tuy nhiên, như c điểm do m i sử dụng trong kỹ thuật RAPD khơng
đặc hiệu nên có rất nhi u băng khó phân tích, khó lặp lại ở các phịng thí nghiệm
khác nhau. Ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các chỉ th trội do đó kh ng phân biệt đư c
các cá thể d h p tử với các cá thể đ ng h p tử (Nguy n Đức Thành, 2016)
1.5.1.4. Kỹ thuật SSR


Kỹ thuật SSR hay còn gọi là Microsatellites, nghiên cứu sự đa dạng những
đoạn DNA ngắn có trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide. C c đoạn này có


khuynh hướng chiếm các vùng DNA không mang mã (vùng d nhi m sắc như: tâm
động hoặc đầu mút nhi m sắc thể), một vài đơn v SSR (như CA) có thể đư c lặp
lại bốn lần, một số đơn v khác lại đư c lặp lại từ hai đến ba mươi lần. Các trình tự
lặp lại đơn giản rất ph biến ở hệ gen động và thực vật, mật độ các trình tự dao
động rất lớn. Ch ng đư c phân bố trong hệ gen và có tính đặc trưng cho từng loài.
Ưu điểm của phương ph p này cho tính đa hình cao, có thể phân biệt đư c sự
sai khác mà kh ng x c đ nh đư c bằng các chỉ th kh c như RA P và RFLP. Hơn nữa,
phản ứng trùng h p chuỗi PCR d thực hiện và sử dụng các m i SSR có trình tự đặc
trưng vì thế đ ng tin cậy khi phát hiện cùng một locus đặc trưng, nên cung cấp nhi u
thơng tin rất có ích cho việc phát hiện sự thay đ i của các trình tự hiếm. Nguy n Th
Minh Nguyệt và cs, (2013) cũng đã sử dụng chỉ th SSR để đ nh gi đa dạng di truy n
tập đoàn l a chụi hạn của Việt Nam. Sử dụng chỉ th SSR, Nguy n Th Phương Đoài
và cs, (2010) nghiên cứu đa dạng di truy n tập đoàn l a nương bản đ a Việt Nam.
Tuy nhiên như c điểm là mỗi loại m i chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình. Hơn

nữa, để xây dựng các cặp m i SSR đặc hiệu cần tách dịng và đọc trình tự một số lư
ng lớn c c đoạn DNA genome có chứa các trình tự lặp lại này. Kỹ thuật này tạo ra
chỉ th trội, không phân biệt đư c đ ng h p tử và d h p tử (Nguy n Đức Thành, 2016)
1.5.2. Chỉ thị đ hình trình tự DNA
Chỉ th đa hình trình tự nucleotide chủ yếu dựa vào những đột biến điểm tại v
trí nhất đ nh của các gen ở trong nhân hay trong tế bào chất của sinh vật. Loại chỉ
th này đư c chứng minh là có đa hình cao hơn nhi u so với các loại chỉ th dựa vào
đa hình chi u dài sản ph m PCR (Kwok et al, 1996; Kruglyak, 1997; Cho et al,
1999). Đối với những chỉ th này, sự thay đ i v trình tự nucleotide sẽ là cơ sở đ nh
giá quan hệ di truy n giữa các cá thể hay nhóm cá thể trong lồi và quần thể. Để xác
đ nh các chỉ th này, cặp m i nhân đư c thiết kế từ 2 đầu trên đoạn gen đích của các
cá thể trong quần thể hoặc các cá thể giữa các quần thể. Đa hình trình tự nucleotide
của đoạn trên gen đích là cơ sở để đ nh gi đa dạng di truy n, khác biệt di truy n,
quan hệ chủng loại của c c loài. C c gen đích đư c sử dụng để nghiên cứu quan hệ


di truy n của các loài hoặc trong loài thường là barcoding gen trong nhân cũng như
ở c c cơ quan tử như lục lạp hoặc ty thể. Trần Mỹ Linh và cs, (2014) cũng nghiên
cứu trình tự đoạn DNA chỉ th trên gen ribosome 18S của một số loài Hải Miên
(Porifera: Demospongiae) tại khu bảo t n biển đảo C n Cỏ, tỉnh Quảng Tr . Cũng
dựa vào đa hình trình tự, Nguy n Phương Thảo và cs, (2015) nghiên cứu đa dạng di
truy n tập đoàn c c giống sắn (Manihot esculenta CrantZ) dựa vào đa hình trình tự
gen GBSSS1. Tuy nhiên, hạn chế của loại chỉ th này là phải biết trước đư c trình
tự của gen đích của chính đối tư ng nghiên cứu hoặc các lồi có quan hệ chủng loại
gần với đối tư ng nghiên cứu. Từ trình tự gen đích, c c cặp m i đư c thiết kế để
nhân bản bằng PCR. Ngồi ra, thời gian và chi phí để đọc trình tự các sản ph m
PCR cũng là hạn chế lớn của loại chỉ th này.
Tóm lại, mỗi loại chỉ th và mỗi phương ph p để tìm ra các chỉ th đó đ u có
những ưu điểm và như c điểm nhất đ nh. Tùy mục đích nghiên cứu cụ thể và trên
những đối tư ng nhất đ nh người ta có thể sử dụng phương ph p và chọn chỉ th

thích h p. Để nghiên cứu quan hệ di truy n trong loài, giữa các loài hay trong quần
thể và giữa các quần thể, c c phương ph p dựa vào nhân bản PCR như RAP ,
ISSR…hoặc phân tích đa hình trình tự DNA của một hay một số gen đích đang
đư c áp dụng rộng rãi trên nhi u đối tư ng khác nhau. Tuy nhiên, kết h p 2-3 loại
chỉ th phân tử để giải quyết quan hệ di truy n của đối tư ng nghiên cứu sẽ đảm bảo
kết quả chính x c hơn.
1.5.3. Tổng quan về hệ gen
Hệ gen (genome) là tập h p chứa tồn bộ thơng tin di truy n đảm bảo hoạt
động sống của tế bào, cơ thể đư c mã hóa trong DNA (ở một số virus có thể là
RNA). Hệ gen bao g m những vùng chứa gen lẫn những đoạn không phiên mã (ở vi
khu n và virus hệ gen g m những vùng chứa gen). Đa số, hệ gen vi khu n phân bố
trên một NST dạng vòng khép kín và có kích thước nhỏ. Đối với sinh vật nhân thực,
99% hệ gen nằm trong nhân tế bào và phần còn lại nằm trong một số bào quan như
ty thể, lục lạp (Võ Th Thương Lan, 2008). Hệ gen của sinh vật nhân thực
(Eukaryotae) bao g m: hệ gen nhân (Nuclear genome), hệ gen ty thể (Mitochondrial