Tài liệu Báo cáo " Liệu pháp Gene Dùng Adenovirus gián tiếp tạo ra kháng thể HER-2" pptx

Nhóm 10:
Liệu Pháp Gene Dùng Adenovirus Gián Tiếp Tạo Ra
Kháng Thể HER-2
Thành viên nhóm:
Phan Thị Phương Thanh:0615114
Phan Thị Hồng Thanh: 0615113
Phan Thanh Hùng: 0515073
Vũ Đình Kỳ: 0615056
Giáo Viên hướng dẩn:
Trần Hoàng Minh Tú
Bùi Bảo Ngọc
Nội Dung Bài Báo

Giới thiệu

Sơ lược về HER-2 và Adenovirus

Thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm

Thảo luận
Mục Đích

Sử dụng Adenovirus la gián tiếp để đưa gene kháng ung thư
buồng trứng

So sánh liệu pháp dùng Adenovirus với một số liệu pháp
khác
HER-2 Là Gi?


HER-2 là thụ thể trên màng tế bào thượng bì

Thuộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là
EGFR

Bản chất là một glycoprotein xuyên màng

Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể số 17

Thúc đẩy tăng sinh, sinh mạch tế bào
Tế Bào Thượng Bì Và Thù Thể HER-2
Thụ Thể HER-2 trên
màng tể bào thượng bì
Mô hình tế bào và thụ thể HER-2
Adenovirus

tất cả các Adenovirus đều không có vỏ, đường kính
60-90nm.

genome của adenovirus là phân tử DNA sợi kép
không phân đoạn

Bộ gene của adenovirus có thể mang gene mục
tiêu >30kb

Không gắn vào bộ gene tế bào vật chủ nhưg có
thể biểu hiện gene


Adenovirus gây ra bệnh cảm cúm
Mô hình sâm nhập của Adenovirus vào tế bào chủ
Xuyên màng
Tạo vỏ bọc bằng vật chất tế bào vật chủ
Gắn lên thụ thể màng nhân
Bơm vật liệu di truyền
Nhóm 10: shptyd
Nhóm 10: shptyd
Fig. 1. Full-length trastuzumab antibody expression cassette using IRES.
Schematic illustration of adenoviral vector pDC315 with expression cassette
inserteda t E1 region. Antibody light andheavy chains, with separate signal peptide,
are linkedb y IRES. VL, variable region of light chain; CL, constant region of light
chain;VH, variable region of heavy chain; CH, constant region of heavy chain;
SP, signal peptide.
Nguyên liệu

Trastuzumab thương mại: một loại kháng thể
đơn dòng đã được thương mại hóa.

Vector pDC315, pBGHE3.

Protein tái tổ hợp Erb-2/Fc Chimera.

Các loại kháng thể.
Các dòng tế bào

HEK293: dòng tế bào thận phôi người.

SKOV-3: tế bào ung thư buồng trứng

người (HER-2+).

BT549: tế bào bình thường (HER-2-).

L-02: tế bào gan người bình thường.
Phương pháp và kết quả
Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab

Tế bào L-02 cho vào môi trường 10%huyết thanh
thai bò.

Ủ trong lò ủ ẩm (t=24h, t0=37
0
C, CO
2
=5%).

Chuyển tế bào vào môi trường không huyết thanh.

Tế bào được làm nhiễm với Ad5-Tab có nồng độ
cao.
Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab

Sau 2h, chuyển tế bào vào môi trường 5% huyết
thanh thai bò.

Thu hoạch các tế bào nổi (vào ngày thứ 3 và thứ 7).
ELISA

Kháng thể đơn dòng mAb anti-human IgG1

chuột làm bất động kháng thể tạo ra do Ad5-
Tab.

mAb tiếp hợp với horseradish-peroxidase.

Đọc bằng Microplate reader với bước sóng
450nm.
Sơ đồ
Kháng thể tạo ra từ Ad5-Tab
(trong tế bào L-02).
mAb
horseradish-peroxidase
Nhóm 10: shptyd
Fig. 2. In vitro antibody expression in Ad5-TAb -infected L-02 cells.The
L-02 cells were infectedw ith Ad5-TAb at a multiplicity of infection of 10.
Cell culture supernatants were harvestedat different time points after
infection for protein analysis. A, ELISA analysis of supernatants of Ad-TAb
- infected L-02 cells.
Western Blot

Các tế bào: dịch nổi, huyết thanh chuột,
trastuzumab thương mại điện di trên SDS-
PAGE 12%.

ở điều kiện khử và không.

Chuyển protein trên gel polyacrylamid lên
màng nitrocellulose.

Dò với goat anti-human IgG1 (H+L)

polyclonal (gắn với horseradish peroxidase).
Sơ đồ
Điện di
SDS-PAGE 12%
Khử
Không khử
Màng
nitrocelluse
dò
Các bản sao kháng
thể dê kháng IgG1
người.
Gắn horseradish peroxidase
X-RAY
Huyết thanh chuột, Trastuzumab, Ad5-Tab
Nhóm 10: shptyd
Fig. 3. Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of
commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb – or
Ad5-LacZ - infected L-02 cells under nonreducing (B) and
reducing (C) conditions
Nhóm 10: shptyd
Fig. 2. In vitro antibody expression in Ad5-
TAb - infected L-02 cells.The L-02
cells were infectedw ith Ad5-TAb at a
multiplicity of infection of 10. Cell culture
supernatants were harvestedat different time
points after infection for protein
analysis. A, ELISA analysis of
supernatants of Ad-TAb -infected L-02
cells. Columns, mean; bars, SD.Western

blot analysis of commercial trastuzumab
and supernatants from Ad5-TAb - orAd5-
LacZ - infected L-02 cells under
nonreducing (B) andr educing (C)
conditions.
Nhóm 10: shptyd
Fig. 4. Specific binding of anti-
HER-2 antibody expressed
byAd5-TAb.Two cell
lines SKOV-3 and BT549 are
chosen for this binding
specificity determination. Cell
culture supernatant from Ad5-
TAb - infectedL-02 cells was
used, and commercial
trastuzumab was usedas
control. Immunofluorescent
microscopy analysis for the
specific binding of anti-
HER-2 antibody to HER-2. A to
B, BT549 incubatedw ith
supernatant and trastuzumab,
respectively. C to D, SKOV-3
incubatedw ith trastuzumab and
culture supernatant, respectively.
Nhóm 10: shptyd
Fig. 5. Affinity constant of anti-HER-2 antibody. Indirect ELISA was applied for
estimation of the antibody binding capacity.The proper working concentration of
anti-HER-2 antibody were shown to be in the range of 1 ×10
-

5

to 5.0 ×10
-
5
mg/
mL, andt hen 2.5 × 10
-
5
mg/mL was appliedf or the determination of affinity
constant. Straight slope is the affinity constant of the antibody.
Nhóm 10: shptyd
Fig. 6. Anti-HER-2 antibody expression level in the serum of SKOV-3-inoculated
nudemice. Ad5-TAbwas given through the tail vein at the dose of 2 × 10
9
plaque-forming units per mouse at early stage.Mice were bleda t days 3, 7, 10, 14,
21, 28, and3 5, and then serum antibody concentrations were determined by
indirect ELISA on HER2-coated 96-well plates and detected with horseradish
peroxidase - conjugated mouse anti-human IgGmonoclonal antibody. Points,
mean (ng/mL); bars, SD.Ten mice were analyzeda t each time point.