Thẩm định phương pháp phân tích hplc định lượng cao bạch quả

Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

1.

Mục đích
-

Phơng pháp xác định hàm lợng flavonoid toàn phần trong tiêu
chuẩn chất lợng thành phẩm viên nén bao phim éloge ginkgo đợc
xây dựng theo USP30 chuyên luận viên nén, để thẩm định phơng pháp trên. Chúng tôi tiến hành xác định: Độ đúng, độ lặp lại,
tính tơng thích của hệ thống, tính đặc hiệu của phơng pháp.

2.

Đối tợng và phơng pháp

2.1. Đối tợng:
-

Chuẩn Quercetin: ĐCVKN TPHCM, hàm lợng 91,34% (nguyên trạng),
SKS: QT104050609, Nớc: 8,51%.

-

Chuẩn Kaempferol làm việc, hàm lợng 95,9% (nguyên trạng), SKS:
110861 - 200808.

-

Chuẩn Isorhamnetin làm việc, hàm lợng 100,0% (nguyên trạng),
SKS: 110860 - 200806.

-

Viên nén bao phim éloge ginkgo. Số lô: 3001201, HD: 19/03/2014.

-

Viên nén bao phim éloge ginkgo Placebo có công thức tá dợc nh
sau: (công thức tá dợc cho 1 viên nén 40mg):
+
+
+
+
+
+
+
+

+

Lactose
Tinh bét mú
Talc
Tartrazin
HPMC
Ponceau 4R
Titan oxyd
Magnesi stearat
PEG 6000

75 mg
145 mg
4 mg
0,035 mg
2,1 mg
0,035 mg
0,45 mg
2 mg
0,5 mg

2.2. Phơng pháp: Định lợng bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao đà mô tả trong

tiêu chuẩn cơ sở viên nén bao phim éloge

ginkgo
-

Cột

: C18, 250ì 4,6 mn; 20àm.

-

Detector

: 270 nm.

-

Tốc độ dòng

: 1,5 ml/phút.

-

Thể tích tiêm

: 20àl.

QCPP018.01

Kiểm tra

Trang
/

Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

3.

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

Pha động : Dung dịch acid phosphoric 0,5% : Methanol (50:50).
Tiến hành và kết quả

3.1. Độ đúng
-

Nguyên lý: Độ đúng đợc xác định theo phơng pháp thêm, bằng
cách thêm đồng thời những lợng chất chuẩn Quercetin, Kaempferol,
Isorhamnetin

đà biết vào mẫu viên nén bao phim éloge ginkgo

placepo tại 80% ( kho¶ng 0,16mg/ml, 0,16mg/ml, 0,04mg/ml),

100% (kho¶ng kho¶ng 0,2mg/ml, 0,2mg/ml, 0,05mg/ml) và 120%
( khoảng khoảng 0,24mg/ml, 0,24mg/ml, 0,06mg/ml) nồng độ
định lợng bằng phơng pháp đà nêu trên. Độ đúng là tỉ lệ (%) giữa
lợng tìm thấy và lợng thêm vào.
3.1.1.
-

Chuẩn bị các dung dịch:

Dung dch chun Quercetin:
+ Cân 27,40 mg Quercetin chuẩn hoà tan vừa đủ 25ml bằng
methanol.

-

Dung dch chun thêm Quercetin (ASQ):

-

Dung dch chun thêm ASQ1: Cân 83,4 mg quercetin n chuẩn
hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol.

-

Dung dch chuẩn thêm ASQ2: Cân 110,5 mg quercetin chuẩn
hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol.

-

Dung dịch chuẩn thêm ASQ3: Cân 144,5 mg quercetin chuẩn

hoà tan vừa đủ 50ml bằng methnol.

-

Dung dch chuẩn Kaempferol:
+ Cân 16,50 mg kaempferol chuẩn hoà tan vừa ®đ 25ml
b»ng methanol.

-

Dung dịch chuẩn thªm Kaempferol (ASK):

-

Dung dịch chuẩn thêm ASK1: Cân 83,4 mg kaempferol chuẩn
hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol.

-

Dung dch chuẩn thêm ASK2: Cân 99,1 mg kaempferol chuẩn
hoà tan vừa đủ 50ml bằng methanol.

-

Dung dịch chuẩn thêm ASK3: Cân 118,2 mg kaempferol chuẩn
hoà tan vừa đủ 50ml b»ng methanol.

-

Dung dÞch chn Isorhamnetin:

QCPP018.01

KiĨm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

+ Cân 15,70 mg Isorhamnetin chuẩn hoà tan vừa đủ 100ml bằng
methanol.
-

Dung dch chun thêm Isorhamnetin (ASI):

-

Dung dch chun thêm ASI1: Cân 40,90 mg Isorhamnetin chuẩn
hoà tan vừa đủ 100ml bằng methanol.

-

Dung dch chuẩn thêm ASI2: Cân 47,20 mg Isorhamnetin chuẩn
hoà tan vừa đủ 100ml bằng methanol.

-

Dung dịch chuẩn thêm ASI3: Cân 55,9 mg Isorhamnetin chuẩn
hoà tan vừa đủ 100ml bằng methanol.

-

Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 2,0 ml chuÈn quercetin, hót 3,0
ml kaempferol, hót 3,0 ml isorhamnetin vào bình định mức 10ml
thêm methanol đến vạch, lắc đều.

-

Dung dịch mẫu éloge ginkgo Placebo: Cân 1 lợng hỗn hợp tá dợc khoảng 500,0mg vào bình định mức 100ml.
Cách pha

Lợng cân
Dung dịch
01.01
01.02

01.03
02.01
02.02
02.03
03.01
03.02
03.03
-

Khối lợng hỗn hợp tá dợc
(mg)
511,0
510,3
508,6
507,5
505,6
506,7
508,1
509,2
502,7

Thêm 40ml methanol, lắc
siêu âm 3 phút, thêm 40ml
acid hydrocloric 1,5N, lắc
siêu âm 10 phút, để nguội
thêm methanol vừa đủ
100ml, lắc đều.

Dung dịch thử 01: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ1, ASK1, ASI1, vào
bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc đều.

-

Dung dịch thử 02: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ2, ASK2, ASI2, vào
bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc đều

QCPP018.01

Kiểm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

-

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

Dung dịch thử 03: Lần lợt hút 10,0 ml chuẩn ASQ3, ASK3, ASI3, vào
bình định mức 100ml, thêm dung dịch éloge ginkgo Placebo tơng ứng tới vạch, lắc đều

-

Dung dịch trắng: Hút 10,0ml dung dịch éloge ginkgo Placebo,
pha loÃng thành 100,0ml với methanol.

-

Lọc các dung dịch trên qua màng lọc 0,45àm. Lần lợt tiêm các dung
dịch: chuẩn hỗn hợp, trắng và thử 01, thử 02, thử 03 vào hệ thống
sắc ký lỏng, ghi sắc đồ

3.1.2.
-

Kết quả:

Quercetin

Chuẩn
Thử
01.01
Thử
01.02
Thử
01.03
Thử

02.01
Thử
02.02
Thử
02.03
Thử
03.01
Thử

Diện tích

Lợng thêm

Lợng tìm thấy

peak

vào 100ml

trong 100ml (A,

(B, mg)

mg)

------------------

----------------------

----------------------

-

-

-

15,12

99,21

15,09

98,99

4082108

15,09

99,00

5396833

19,95

98,79

19,93

98,74

19,90

98,57

26,18

99,21

26,18

99,19

5417249
4090810
4081721

5393717

15,24

20,19

5384912
7084151
7082684

26,39

Lợng tìm thấy

X (%)

03.02
QCPP018.01

Kiểm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

Thử

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

7101204

03.03

26,25

99,45

Trung bình:

99,02

S

0,28

RSD (%):

0,28

Khoảng tin cậy với độ chính xác 95%

98,8 99,2

o Công thức:
+ Lợng quercetin tìm thÊy trong 100ml dung dÞch: A( mg ) =
S T × mC × 2 × 100 × HLC
S C × 25 ì 10

+ Phần trăm thu hồi: X ( % ) =
-

A
ì 100
B

Kaempferol.

Chuẩn
Thử
01.01
Thử
01.02
Thử
01.03
Thử
02.01
Thử
02.02
Thử
02.03
Thử
03.01
Thử
QCPP018.01

Diện tích

Lợng thêm

Lợng tìm thấy

peak

vào 100ml

trong 100ml (A,

(B, mg)

mg)

------------------

----------------------

----------------------

-

-

-

15,85

99,06

16,01

100,04

4520458

15,99

99,94

5355434

18,94

99,71

18,99

99,94

18,86

99,26

22,32

98,44

22,34

98,53

5367828
4480510

4525071

5367828

16,00

19,00

5331355
6308520
6314439

22,67

Lợng tìm thấy X
(%)

Kiểm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc

Ninh

03.02
Thử
03.03

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

6314439

22,34

98,53

Trung bình:

99,27

S

0,63

RSD (%):

0,63

Khoảng tin cậy với độ chính xác 95%
98,8 99,8
+ Lợng kaempferol tìm thấy trong 100ml dung dịch: A( mg ) =
S T ì mC × 3 × 100 × HLC
S C × 25 × 10

+ Phần trăm thu hồi: X ( % ) =
-

A
ì 100
B

Isorhamnetin.

Chuẩn
Thử
01.01
Thử
01.02
Thử
01.03
Thử
02.01
Thử
02.02
Thử
02.03
Thử
03.01

Thử
03.02
Thử
QCPP018.01

Diện tích

Lợng thêm

Lợng tìm thấy

peak

vào 100ml

trong 100ml (A,

(B, mg)

mg)

------------------

----------------------

----------------------

-

-

-

4,07

99,50

4,06

99,38

512439

4,02

98,18

602252

4,72

99,99

4,71

99,79

4,74

100,32

5,54

99,03

709076

5,56

99,40

704530

5,52

98,76

601062
519320
518731

601062

4,09

4,72

604283
706414

5,59

Lợng tìm thÊy
X (%)

KiÓm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

03.03
Trung bình:

99,37

S

0,65

RSD (%):

0,65

Khoảng tin cậy với độ chính xác 95%
98,9 99,9
+ Lợng isorhamnetin tìm thấy trong 100ml dung dịch:
A( mg ) =

+ Phần trăm thu hồi: X ( % ) =

S T × mC × 3 × 100 × HLC
S C × 100 × 10
A
× 100
B

3.2. Độ lặp lại
-

Nguyên lý: Định lợng flavonoid toàn trong viên nén bao phim eloge
ginkgo 6 lần, với nồng độ nh đà mô tả trong TCCS, tính độ chính
xác của phơng pháp thông qua giá trị trung bình và độ lệch
chuẩn tơng đối.

-

Thực hiện và kết quả:
+ Cân 20 viên nén, xác định khối lợng trung bình. Nghiền thành
bột min.
+ mtb= 270,5mg
Cách pha

Lợng cân mT (mg)
Chuẩn hỗn
hợp
Thử
Thử
Thử
Thử
Thử
Thử

01
02
03
04
05
06

--------------

Xem phần độ đúng mục 3.1.1

311,2

Vào bình định mức 50ml , thêm 20ml

315,5
324,9
344,9
348,7
378,7

MeOH, lắc siêu âm 3 phút, thêm 20ml HCl
1,5N lắc siêu âm 10 phút, để nguội đến
nhiệt độ phòng, thêm methanol đến vach,
lắc ®Ịu. Läc qua giÊy läc thêng, läc qua
mµng läc 0,45µm vào vial, đun trong cách
thủy 1h, làm nguội trong nớc đá, để nguội
đến nhiệt độ phòng. Tiêm sắc ký, tính
tổng diện tích pic của 3 flavonoid chính
(quercetin,

kaempferol,

và

isorhamnetin).

Hàm lợng flavonoid toànphần tÝnh theo
QCPP018.01

KiÓm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo
quercetin trong mỗi viên.

-

Kết quả
Tổng diện tích peak

Hàm lợng X (mg/Viên)

5417249

Chuẩn

Thử 01
Thử 02
Thử 03
Thử 04
Thử 05
Thử 06

-------------------------10,85
10,94
10,87
10,74
10,91
10,93

2457598
2512677
2571397
2696374
2768483
3012292
Trung bình:

10,87

S

0,07

RSD (%):

0,67

Khoảng tin cậy với xác suất 95%
-

Công thức tính: X ( mg / Vien ) =

∑

10,78 - 10,94

S T × mC × HLC × mtb × 2,51 × 2 ì 50
S C xmT ì 25 ì 10

3.3. Tính đặc hiệu
-

Trên sắc ký đồ các dung dịch: Trắng, chuẩn hỗn hợp và dung dịch
thử éloge ginkgo mục độ đúng 3.1 cho thấy:
+ Trên sắc đồ của dung dịch trắng không xuất hiện các peak
tại các thời diểm rửa giải của quercetin, kaempferol,
isorhamnetin, cũng nh các thời điểm khác.
+ Peak chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử có thời gian lu
và phổ tử ngoại trùng với peak chính trên sắc ký đồ của dung
dịch chuẩn hỗn hợp ( quercetin, kaempferol, isorhamnetin).
+ Nh vậy công thức bào chế cũng nh các điều kiện phân tích
của Công ty LD dợc phẩm Eloge France Việt Nam không ảnh hởng tới sự rửa giải cũng nh thứ tự rửa giải của các thành phần
chính (Flavonoid) trong viên nén bao phim Eloge Ginko.

3.4. Tính thích hợp hệ thống

-

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp phần độ đúng mục 3.1 vào
hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao, ghi lại sắc đồ.

QCPP018.01

Kiểm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

-

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

Kết quả:
Diện

Thời

Diện

Thời

Diện tích

Thời gian

tích

gian lu

tích

gian lu

peak

lu

peak

querce

peak

kaempf

(isorham

isorhamn

(querc

tin

(kaemp

erol

netin)

etin

etin)

(phút)

ferol)

(phút)

12,792

5367828

25,935

601062

28,883

12,574

5355434

25,472

602252

28,390

12,739

5331355

25,730

604283

28,644

12,574

5355434

25,472

602252

28,390

12,792

5367828

25,935

201062

28,883

12,739

5331355

25,730

604283

28,644

12,702

5351539

25,712

602532

28,639

(phút)

Chuẩn

541724

01
Chuẩn

9
539683

02
Chuẩn

3
538491

03
Chuẩn

2
539683

04
Chuẩn

3
541724

05
Chuẩn

9
538491

06
Trung

2
539966

bình:

5

S

14626,9

0,1

16587,9

0,2

1456,7

0,2

0,27

0,80

0,31

0,87

0,24

0,77

RSD
(%):
-

Kết luận:
+ Phơng pháp xác định hàm lợng flavonoid toàn phần trong tiêu
chuẩn chất lợng thành phẩm viên nén bao phim éloge ginkgo
có tính đặc hiệu cao.
+ Phơng pháp có độ chính xác cao, với hàm lợng trung bình
10,87mg/viên và độ lệch chuẩn tơng đối 0,67%.
+ Độ đúng của phơng pháp là 99,02% và độ lệch chuẩn tơng

đối 0,28% của quercetin, 99,27%; 0,63% cđa kaempferol,
99,37%; 0,65% cđa isorhamnetin.
+ TÝnh thÝch hỵp hƯ thống đạt yêu cầu so với USP30.

QCPP018.01

Kiểm tra

Trang
/


Công ty Liên doanh Dợc
Phòng KTCL
phẩm

éloge France Việt
Nam
Khu CN Quế Võ - Bắc
Ninh

Thẩm định phơng pháp
định lợng flavonoid
toan phần trong viên
nén bao phim éloge
ginkgo

TP. Kiểm tra chất lợng

Ds. Lê Văn Tó

QCPP018.01

KiĨm tra

Trang
/