Đề tài : Ứng dụng của vi sinh vật trong sản xuất bột ngọt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM
MÔN VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

Đề tài :

Ứng dụng của vi sinh vật

bột ngọt
Giảng viên hướng dẫn : Vũ Thị Lâm An
Nhóm 5 :

Mai Phương Anh_11156020
Dư Thị Giàu_11156029
Đào Thị Tâm Hạnh_11156005
Võ Thị Thảo Ly_11156043
Võ Hồng Phụng_11156052
Lê Thị Thảo_11156115

trong sản xuất



Nội dung

I.
II.
III.

Giới thiệu sơ lược về bột ngọt
Quy trình sản xuất bột ngọt
Tổng quan về quá trình lên men

1.Chủng loại, nguồn gốc vi sinh vật phân lập từ tự nhiên
2.Phương pháp đột biến tạo chủng vi khuẩn tổng hợp thừa L-AG
2.1. Cơ chế phân tử của việc tổng hợp thừa L-AG ở C. Glutamicum
2.2. Cải biến di truyền
3.Q trình ni giống và nhân giống
4.Lên men
4.1. Bản chất của quá trình
4.2. Môi trường lên men glutamic acid
4.3. Điều kiện lên men glutamic acid
4.4. Quá trình lên men
5.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

IV. Một số ứng dụng khác của Corynebacterium glutamicum
TÀI LIỆU THAM KHẢO


I. Giới thiệu sơ lược về bột ngọt

1.

Lịch sử của bột ngọt:
 Cách đây hàng ngàn năm người Nhật Bản đã sử dụng rong lá Laminaria japonica làm một loại gia vị
hảo hạng. Hoạt chất của loại rong lá này làm cho thức ăn có hương vị đậm đà.

Rong lá Laminaria japonica


 Ơng Kikunae Ikeda đã khám phá ra hoạt chất
trích ly từ rong biển là monosodium glutamate –
muối của acid glutamic. Ơng đã đặt tên cho vị

đó là umami (vị này khác các vị cơ bản: mặn,
ngọt, chua, đắng)

Kikunae Ikeda


 1909 acid glutamic được sản xuất bằng cách thủy phân các nguồn protein chứa nhiều acid glutamic
nhưng hiệu suất rất thấp.
 1957 Kinoshita phát hiện vi khuẩn có khả năng tổng hợp và tiết acid glutamic với hàm lượng khá cao.
 1962 Kinoshita trình bày cơ chế lên men từ Corynebacterium glutamicum một cách hồn chỉnh.
 Từ đó đến nay, hàng loạt nhà máy lên men acid glutamic đã và đang được xây dựng tại hơn 20 nước trên
thế giới (Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam...)


Có nhiều cách gọi tên khác nhau: MSG, monosodium glutamat, muối L-Glutamic acid Monosodium, Monosodium Lglutamat.

Công thức cấu tạo của Acid Glutamic

Công thức cấu tạo của Natri Glutamat


 Tính chất Natri Glutamat:
•Hình dạng vật lý: tinh thể rắn
•Màu: trắng pha lê
•Tan trong nước và rượu
•Nhiệt độ nóng chảy: 2320C
•Nồng độ hịa tan: 100mg chất/100ml nước
•pH: 7.0 (0,2% dung dịch)
•Tính ổn định: ổn định dưới điều kiện bình thường.

Bên cạnh bọt ngọt truyền thống, cịn có một số chất được gọi là siêu bột ngọt ( IMP và GMP). Chất này tạo vị
umani cao gấp khoảng 10 lần so với bột ngọt thường. Nó được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm như mì ăn liền,
hạt nêm,…

Disodium 5’ - inosinate


Vai trị của acid glutamic:
•Acid glutamic rất cần cho sự sống, là loại amino acid đóng vai trị quan trọng trong quá trình trao đổi chất của người và
động vật, trong việc xây dựng protein, xây dụng các cấu trúc của tế bào.

•Đảm nhiệm chức năng tổng hợp nên các amino acid khác như alanin. Cystein, prolin,…
•Tham gia vào phản ứng chuyển amin, giúp cơ thể tiêu hóa nhóm amin và tách NH3 ra khỏi cơ thể.
•Được dùng làm thuốc chữa các bệnh thần kinh và tâm thần, bệnh chậm phát triển ở trẻ em, bệnh bại liệt.
•Làm nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số hóa chất quan trọng.


II. Quy trình sản xuất bột ngọt


Nguyên liệu có bột

Thuỷ phân bởi HCl
Dịch đường

Bổ sung dưỡng chất

Phối chế dịch lên men

Khử trùng ở nhiệt độ cao

Lên men

Chủng vi khuẩn đột biến


Trao đổi ion

NaOH

Dịch acid glutamic

Dich glutamat natri

Cô đặc-kết tinh

Sấy khô

Phân loại-đóng gói


III. Tổng quan về quá trình lên men
1. Chủng loại, nguồn gốc vi sinh vật phân lập từ tự nhiên
Corynebacterium glutanicum, Brevibacterium lactofermentus, Micrococus glutamicus.

Nhưng chủ yếu nhất vẫn là chủng Corynebacterium glutamicum

Conrynebacterium glutamicum

Giống vi khuẩn thuần khiết này được lấy từ ống thạch nghiêng tại các cơ sở giữ giống, sau đó được cấy truyền, nhân sinh
khối trong môi trường lỏng.

Khối lượng sinh khối được nhân lên đến yêu cầu phù hợp cho quy trình sản xuất đại trà.
Trước khi nhân, cấy, môi trường lỏng phải được thanh trùng bằng phương pháp Pasteur.
Chủng vi khuẩn giống phải có khả năng tạo ra nhiều acid glutamic, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh, có tính ổn định
cao trong thời gian dài, chịu được nồng độ acid cao, môi trường nuôi cấy đơn giản, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất.


 Đặc điểm, hình thái sinh lý
•Trực khuẩn thẳng hoặc cong
•Gram dương
•Kích thước tế bào 0,6-1,2 micromet
•Khơng có bào tử
•Khơng có tiêm mao nên bất động
•Có khả năng oxi hóa acid glutamic ra ketoglutarat thấp nhất
•Hoạt tính glutamate hydrogenase cao
•Vi khuẩn phát triển trên môi trường cần biotin

Hiện nay, Corynebacterium glutamicum đang được sử dụng phổ biến trong công nghiệp, hầu hết đều là chủng đột biến.


2. Phương pháp đột biến tạo chủng vi khuẩn tổng hợp thừa L-AG
2.1. Cơ chế phân tử của việc tổng hợp thừa L-AG ở C. Glutamicum

Ở vi sinh vật có tính chất tự điều hịa và cân đời.

Do vậy cần sử dụng các phương pháp chọn lọc và tác động tới cơ chế di truyền của vi sinh vật để chúng
tổng hợp một lượng amino acid dư thừa so với nhu cầu và bài tiết nó ra mơi trường.

Qua nhiều nghiên cứu cho thấy chúng ta phải thay đổi 2 yếu tố ở C. glutamicum dẫn đến việc tổng hợp
thừa L-AG và L-AG đượ tiết ra ngồi mơi trường : thay đổi chuỗi phản ứng tổng hợp L-AG và thay đổi
tính thấm của màng tế bào.


Thay đổi chuỗi phản ứng tổng hợp L-AG: Tác nhân hạn chế biotin và bổ sung chất hoạt độ bề mặt

Chu trình Krebs sinh tổng hợp L-AG


Thay đổi cấu trúc của màng tế bào: Tác nhân hạn chế biotin và bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc kháng sinh

Bổ sung chất hoạt động bề mặt
Và hạn chế biotin

Thay đổi cấu trúc protein màng
GluE, được mã hóa bởi gen NCgl
1221

Cơ chế tác động tới màng tế bào vi khuẩn của các
tác nhân


2.2 Cải biến di truyền

A) Thay đổi chuỗi phản ứng tổng hợp L-AG bằng cách giảm hoạt tính ODHC

 Điều kiện này được thực hiện bằng cách loại bỏ gene OdhA. Chủng vi khuẩn thiếu gene OdhA sẽ không mã hóa tạo enzyme
ODHC và sẽ tổng hợp thừa L-AG ngay dưới những điều kiện bình thường, khơng cần hạn chế biotin hoặc bổ sung hoạt tính bề mặt.

 Phương pháp tạo chủng vi khuẩn khuyết gene OdhA:
•Nhân đoạn gene chứa OdhA bằng PCR
•Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gene OdhA
•Phần gene cịn lại được gắn vào plasmid bằng ligaza
•Đưa plasmid vào vi khuẩn


B) Điều chỉnh khả năng bán thấm của màng tế bào

•

Điều chỉnh khả năng bán thấm của màng tế bào bằng cách cải biến gene NCgl1221 mã hóa protein màng GluE.

Khuếch đại gene bằng PCR, qua đó gia tăng sự bài tiết L-AG. Tuy nhiên, với cách cải biến này vẫn còn những tác nhân
hạn chế biotin, bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc penicillin để kích thích bài tiết L-AG.

•

Đột biến gene q trình bài tiết L-AG diễn ra mà không cần bổ sung các tác nhân. Tạo thể đột biến bằng cách nhân dòng
đoạn gene NCgl1221, sau đó cắt đoạn gene bằng một số loại enzyme giới hạn khác nhau và gắn vào plasmid. Tiến hành
chọn lọc những chủng đột biến có khả năng bài tiết L-AG mà khơng cần có tác nhân.

Tại Việt Nam đang sử dụng chủng vi khuẩn Khuyết gene OdhA và Đột biến gene GluE.


3. Q trình ni giống và nhân giống


Người ta sử dụng ống giống thạch nghiêng để giữ cho ống khơng bị thối hố và biến dạng, khả năng sinh tổng hợp acid

o
glutamic với mức độ không đổi, thuần hoá, huấn luyên và lựa chọn giống tốt. Thường giống được bảo quản ở 5 - 7 C, khi cấy
o
chuyền để chúng sinh sản tốt ta phải qua giai đoạn hoạt hoá giống bằng cách để ống nghiệm trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 - 32 C
trong thời gian 30 phút đến 1 giờ.

Môi trường thạch nghiêng:
Pepton 1%
Cao thịt bò 1%
NaCl tinh chế 0,5%
Thạch 2%


Nhân giống cấp 1
Môi trường :
Glucoza tinh khiết 2,5%
Rỉ đường 0,25%
Nước chấm 0,3%
MgSO (đá pha 10%) 0,04%
4
2+
2+
(Mn , Fe )SO 2g/lít
4
Urea 0,5%
B1 pha 150g/lít 1,5ml/1lít
pH 6,7

Điều kiện nhân giống :
Bình tam giác 1 lít, chứa 250 ml mơi trường

Ni trên máy lắc tốc độ 90 - 96 vịng/phút
Thời gian ni cấy 16 - 18 giờ
o
Nhiệt độ nuôi cấy 30 - 32 C.

Chỉ tiêu giống cấp 1:
pH 6,5
OD 0,64 - 0,74
Đường còn lại 0,12 - 0,28%
Trạng thái giống: Béo, khoẻ, đều sắp xếp chữ V.


Nhân giống cấp 2
 Môi trường :
Glucoza tinh khiết 3,5%
MgSO 0,04%
4
H PO + KOH 0,1%
3 4
Nước chấm 0,5%
Rỉ đường 1%
Urea 0,8%
Dầu lạc 0,1%
B1 0,03g/100ml
pH 6,5 - 6,7

Điều kiện nhân giống :
Nồi lên men V= 50 lít đựng 35 lít
o
Thanh trùng thiết bị 130 /30 phút

o
Thanh trùng môi trường 120 /20 phút
Lượng cấy giống 2%
o
Nhiệt độ nuôi cấy 30 - 32 C
Thơng khí: 1 phút đưa 0,5 lít khơng khí vào 1 lít mơi trường
Khuấy trộn đều 340 vịng/phút
Thời gian nhân giống 8 - 9 giờ

Chỉ tiêu giống cấp 2 :
pH 7,1 - 7,2
OD 0,6 - 0,7
Đường còn lại 2%
Trạng thái giống: Béo, khoẻ.