Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích 11 nor 9 carboxy THC trong máu trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ kép (LC MS MS)

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA
HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ

Đỗ Thị Hiếu

NGHIÊN CỨU, XÂY
DỰNG QUY TRÌNH
PHÂN TÍCH 11-NOR-9CARBOXY-THC TRONG
MÁU TRÊN THIẾT BỊ
SẮC KÝ LỎNG KHỐI
PHỔ KÉP (LC-MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: HÓA
HỌC


Hà
Nộ
i,
20
21


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Đỗ Thị Hiếu

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 11-NOR9-CARBOXY-THC TRONG MÁU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÝ
LỎNG KHỐI PHỔ KÉP (LC-MS/MS)
Chun ngành: Hóa học phân tích
Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN QUANG THĂNG

Hà Nội, 2021


i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là cơng trình nghiên
cứu của tơi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tơi tự tìm hiểu và nghiên cứu.
Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng
thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 30 tháng 9 năm
2021
Tác giả

Đỗ Thị Hiếu


ii
LỜI CÁM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Phan Quang Thăng,
Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.

Em xin cảm ơn các thầy, cơ giáo Khoa Hóa học, Học Viện Khoa học và
Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã dạy dỗ, truyền
đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trung tâm, Ths. Hoàng Thế Thắng,
cùng các anh chị Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình sự đã rất
nhiệt tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã hỗ trợ, là
chỗ dựa vững chắc giúp tơi hồn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 30 tháng 9 năm
2021
Học viên

Đỗ Thị Hiếu


iii
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU...............................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................3
1.1. Cần sa, các chế phẩm của cần sa và tác hại của chúng............................3
1.1.1. Giới thiệu về cần sa.............................................................................. 3
1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa.........................................................................5
1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa............................................................6
1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự
6
1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần
sa.....................................................................................................................9
1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong máu............................................. 11
1.1.7. THC-COOH........................................................................................12
1.2. Tổng quan về các phương pháp tách chiết THC-COOH trong máu......13
1.2.1. Phương pháp kết tủa protein...............................................................13
1.2.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng............................................................14
1.2.3. Phương pháp chiết pha rắn................................................................. 14
1.3. Tổng quan về một số phương pháp phân tíchTHC-COOH trong máu15
1.3.1. Sắc kí khí khối phổ (GC-MS):............................................................15
1.3.2. Sắc kí lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS)..............................................16
1.4. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH......................................................21
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC
NGHIỆM.............................................................................................................22
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu...................................................22
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu...........................................................................22
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 22
2.1.3. Mẫu nghiên cứu.................................................................................. 22
2.1.4. Nội dung nghiên cứu...........................................................................22
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị..................................................................23


iv

2.2.1. Hóa chất..............................................................................................23
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị..............................................................................24
2.3. Phương pháp thực nghiệm:....................................................................25
2.3.1.Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu..............................................25
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu......................................................................25
2.4. Thực nghiệm:......................................................................................... 26
2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS.......................26
2.4.2. Khảo sát dung môi chiết..................................................................... 28
2.4.3. Khảo sát môi trường (pH) chiết..........................................................28
2.4.4. Khảo sát độ thu hồi của phương pháp................................................ 28
2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu.......................................................29
2.5. Thẩm định phương pháp........................................................................29
2.5.1. Độ phù hợp của kệ thống sắc ký.........................................................29
2.5.2. Độ chọn lọc của phương pháp............................................................30
2.5.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn....................................................30
2.5.4. Độ đúng và độ chính xác.................................................................... 30
2.5.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.............................................31
2.6. Phân tích mẫu thực tế.............................................................................31
2.7. Phương pháp xử lý số liệu......................................................................32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................33
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên LC-MS/MS....33
3.2. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho q trình chiết............................35
3.2.1. Kết quả khảo sát dung mơi chiết.........................................................35
3.2.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH)............................................. 37
3.2.3. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp................................................39
3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu.......................................................40
3.3. Thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích THC-COOH trong mẫu
máu bằng LC-MS/MS...................................................................................41
3.3.1. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng THC-COOH trong
máu............................................................................................................... 41

3.3.1.1. Độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS.............................................41


v
3.3.1.2. Độ chọn lọc......................................................................................42
3.3.2. Xây dựng đường chuẩn và định lượng............................................... 43
3.3.3. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của
phương pháp................................................................................................. 45
3.4. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị LC-MS/MS..................45
3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế......................................46
3.6. Đánh giá đối tượng mẫu phân tích, phương pháp phân tích LC-MS/MS
và đóng góp mới của đề tài........................................................................... 48
3.6.1. Đánh giá đối tượng mẫu phân tích và phương pháp phân tích LCMS/MS..........................................................................................................48
3.6.2. Đóng góp mới của đề tài.....................................................................49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................51
Kết luận.........................................................................................................51
Kiến nghị.......................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................53


vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
THC-COOH
GC-MS

LC-MS/MS
ACN
TCA
LLE

SPE
LOQ
LOD
ESI
MRM
IS
RSD
UNODC


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự
6
Bảng 1. 2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa...........8
Bảng 1. 3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu........................................9
Bảng 1. 4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong máu bằng sắc ký khí
16
Bảng 1. 5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong máu bằng sắc ký
lỏng......................................................................................................................18
Bảng 2. 1. Chương trình pha động gradient:.......................................................27
Bảng 3. 1. Các phân mảnh, thời gian lưu và thế bắn phá của THC-COOH và
THC-COOH-d3................................................................................................... 33
Bảng 3. 2. Độ thu hồi chất phân tích trong máu tại các tỉ lệ dung môi khác nhau
36
Bảng 3. 3. Độ thu hồi chất phân tích trong máu tại các pH khác nhau...............38
Bảng 3. 4. Độ thu hồi chất phân tích trong máu................................................. 40
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của nền mẫu....................................................................41
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp....................................42
Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH...................... 44

Bảng 3. 8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực.............................47


viii

Hình 1. 1.

Cần sa trồng t

Hình 1. 2.

Hình ảnh về c

Hình 1. 3.

Sơ đồ quá trìn

Hình 1.

4.

Thiết bị sắc ký

Hình 1.

5

.Cấu trúc phân mả

Hình 3.

1. Phân mảnh m/z của (a) THC-

Hình 3.
2.
So sánh Peak
mM, (b) 5 mM và (c) 10 mM ..............................................................................
Hình 3.3. So sánh độ thu hồi tại tỉ lệ dung mơi khác nhau .................................
Hình 3.4. So sánh độ thu hồi tại các pH khác nhau ............................................
Hình 3.6. Peak ở 3 mẫu khảo sát độ chọn lọc .....................................................
Hình 3.7. Đường chuẩn xác định THC-COOH...................................................
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình phân tích THC-COOH trong máu .............................


1
MỞ ĐẦU
Ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý và sinh
lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về tâm,
sinh lý vào việc sử dụng các chất đó.
Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường khơng kiểm sốt
được hành vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh
hướng gia tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong
muốn. Đó là nguyên nhân làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm
cắp, giết người, cướp của, mại dâm, là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm
kinh tế như buôn lậu, gian lận, tham nhũng.
Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội
như thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm
Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm
Benzodiazepine, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat. Cần sa ban đầu
được sử dụng cho mục đích gây hưng phấn và mục đích y học. Đến năm 1930

bị coi là bất hợp pháp, kể từ những năm 1960 việc sử dụng nó đã tăng lên
đáng kể. Hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần sa đang ngày càng được giới
trẻ sử dụng nhiều.
Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng,
chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết
thai thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài. Từ cần sa người
ta đã phân lập được khoảng 61 chất khác nhau, với thành phần chủ yếu là
THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol), CBD (cannabidiol).
Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng tâm lý tới người sử dụng cần
sa [1, 2].
Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút. Sau khi hút 24 giờ, khoảng
50% lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% cịn lại được phân bố
trong tồn cơ thể, chủ yếu ở các mơ mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những
ngày tiếp theo. Sau khi hút cần sa, được chuyển nhanh vào hệ tuần hoàn rùi
qua phổi sang máu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH và các sản
phẩm liên hợp với một hoặc hai phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3,
4, 5]. Đây chính là các đối tượng để kiểm tra việc sử dụng cần sa.


2

Việc phân tích THC-COOH trong máu có thể thực hiện bằng phân tích
miễn dịch, sắc ký khí khối phổ (GC-MS), hay bằng sắc ký lỏng khối phổ kép
(LC-MS/MS). Tuy nhiên, phương pháp GC-MS yêu cầu chuẩn bị mẫu tốn
nhiều thời gian với việc thực hiện giai đoạn dẫn xuất mẫu, độ thu hồi của
phương pháp giảm. Việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS khắc phục được
những khuyết điểm đó và mang lại những ưu điểm là tăng độ nhạy, độ chọn
lọc và độ phân giải. Vì thế chúng tơi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký lỏng
khối phổ kép để xác định THC-COOH [1, 6].
Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người

sử dụng nó, đồng thời để phục vụ cho cơng tác giám định ma túy, đề tài này
chúng tôi tập trung “Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích 11-nor-9cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol trong máu bằng thiết bị sắc ký lỏng
khối phổ kép LC-MS/MS” nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Cần sa, các chế phẩm của cần sa và tác hại của chúng
1.1.1. Giới thiệu về cần sa
Cây cần sa (canabis sativa) có nguồn gốc từ Ấn Độ và Ba Tư, sau đó
được trồng phổ biến ở các nước ơn đới và nhiệt đới từ hàng trăm năm nay
nhằm mục đích lấy sợi hoặc sử dụng trong các lễ hội mang tính tâm linh. Tính
tới nay, các chế phẩm/sản phẩm cần sa là loại ma túy bị lạm dụng nhiếu nhất
trên thị trường ma túy lậu. Việc trồng cây cần sa hầu như diễn ra khắp mọi
nơi, và hầu như ở tất cả các nước trên thế giới. Nhựa cần sa được sản xuất tại
khoảng 65 nước trên thế giới, chủ yếu là tại các nước thuộc khu vực Bắc Phi
và Tây-Nam Á, đặc biệt là Afghanistan và Pakistan.
Châu Phi là quê hương của nước sản xuất nhựa cần sa hàng đầu thế giới
là Ma-rốc, nổi tiếng về trồng cần sa. Hầu hết nhựa cần sa bắt được ở Châu Âu
đều có nguồn gốc bn lậu từ Ma-rốc. Nhựa cần sa từ Ma-rốc có đặc điểm
đặc trưng giống với đặc điểm của nhựa cần sa từ các nước khác thí dụ như các
nước thuộc vùng đông và nam Địa Trung Hải.
Afghanistan là nước lớn thứ hai thế giới về sản xuất nhựa cần sa. Nhựa
cần sa từ Afghanistan có đặc điểm giống với nhựa từ các vùng khác của tiểu
lục địa Ấn Độ. Li-Băng đã từng có thời là một trong những nước cung cấp
nhựa cần sa hàng đầu thế giới, và nếu như khơng có những nỗ lực triệt phá
liên tục của cơ quan chức năng và chính quyền địa phương, có thể nó vẫn
đứng đầu thế giới về cung cấp nhựa cần sa.
Về cây cần sa, Châu Mỹ chiếm khoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm

2006, sau đến Châu Phi (khoảng 22%). Hầu hết cây cần sa đều được sản xuất
cho các thị trường nội địa và xuất khẩu sang nước láng giềng, cịn ít bị bn
lậu trên thế giới [2].
Bộ phận chứa hoạt chất có tác dụng lên hệ thần kinh chủ yếu ở lá, quả và
hoa (đặc biệt là phần ngọn cây). Các bộ phận này được thu hoạch riêng, phơi
khơ, ép thành bánh hoặc bó lại để sử dụng bằng cách hút, đôi khi dùng qua
đường uống. Các sản phẩm thực vật này có tên chung là marijuana, chúng có
thể khác nhau về hình thức trình bày cũng như thành phần, hàm lượng hoạt
chất. Hàm lượng hoạt chất giảm khi hạt hình thành, bởi vậy ở một số nơi


4

người ta tỉa bỏ những cây đực để ngăn cản quá trình thụ phấn tạo hạt, các sản
phẩm thu được có tên là Sinsemila [2].
Tại một số nước đã xuất hiện hiện tượng trồng trái phép cần sa trong nhà,
có thể trồng theo phương pháp thủy canh, không cần đất mà sử dụng đèn
chiếu sáng nhằm qua mặt các cơ quan an ninh cho thấy mức độ phức tạp và
khó khăn trong cơng tác điều tra phịng chống tội phạm. Cây cần sa được
trồng ngày càng nhiều trong nhà tại các nước phát triển về mặt kỹ thuật. Từ
những năm 1970, các nước trồng cần sa ở Bắc Mỹ và Châu Âu đã nghiên cứu
để tạo ra các giống cần sa có hàm lượng hoạt chất cao hơn, và thị trường về
cần sa có hàm lượng THC cao, trồng trong nhà sử dụng kỹ thuật ngăn không
cho hoa cái thụ phấn đang ngày một phát triển tại nhiều nước tiêu thụ cần sa
chính. Vào cuối thế kỷ trước, kỹ thuật ngăn không cho hoa cái thụ phấn được
áp dụng rất nhiều tại Mỹ, Canada và Hà Lan – ba nước đi tiên phong về công
nghệ nhân giống và trồng cây cần sa – báo hiệu rằng thị phần của cần sa đang
ngày một gia tăng ở nhiều nước.

Hình 1. 1. Cần sa trồng trong nhà

Cần sa được nhiều người cho là “ma túy cửa ngõ”, dẫn đến việc sử dụng
lạm dụng bất hợp pháp và được sử dụng ở rất nhiều nơi. Trong những năm
qua, việc sử dụng cần sa đã tăng lên đều đặn, cả về mặt y tế và mặt giải trí,


5

đặc biệt là ở thanh thiếu niên và sử dụng phổ biến hơn ở nam giới hơn phụ nữ.
Cần sa thường được cuộn thành điếu giống như điếu thuốc lá để hút nhằm tạo
cảm giác hưng phấn. Một điếu cần sa nhỏ có thể được bán với giá thành rất
đắt so với thuốc lá. Cần sa cịn có thể được hút bằng ống nước (bong), một
thiết bị điện tử cầm tay (vape pen), có thể được kết hợp vào trà và ấu ăn.

Hình 1. 2. Hình ảnh về cây cần sa và cần sa thường dùng trong thực tế
1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa
Trong nông nghiệp cây cần sa đã được sử dụng để lấy sợi từ lâu. Các sản
phẩm hợp pháp cần sa gồm có hạt cần sa, dầu từ hạt cần sa và tinh dầu cần sa.
Các chế phẩm từ cần sa được sản xuất với các quy trình khác nhau và
cách chuyển hóa khác nhau để nhằm mục đích bn lậu và sử dụng bất hợp
pháp, các chế phẩm và sản phẩm trái phép của cần sa gồm ba loại chính là:
Cây cần sa, nhựa cần sa và dầu cần sa do hàm lượng THC cao. Nhựa cần sa là
sản phẩm chế biến bằng cách loại bỏ hạt, sợi, hàm lượng THC đạt 2-10%.
Trên thế giới, việc sản xuất nhựa cần sa được tập trung vào hai khu vực chính
là khu vực đơng và nam Địa Trung Hải, khu vực Nam và Tây Nam Á. Hai khu
vực này sử dụng rất nhiều phương pháp để sản xuất nhựa cần sa. Tuy nhiên,
nói chung là mỗi khu vực đều sử dụng những kỹ thuật giống nhau. Sàng và
rây là một khâu quan trọng của quá trình sản xuất nhựa cần sa trong cả hai
khu vực nay [2].
Cần sa lỏng là dịch chiết lỏng của cần sa thực vật hoặc nhựa cần sa, với
dụng cụ chiết tương tự như chiết soxhlet. Các dung môi hữu cơ thường dùng

là etanol, clorofom, hexanee, ete dầu hỏa, cần sa lỏng chứa THC tới 10-30%.


6

1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa
Cần sa gây ra hàng loạt những biến đổi về tâm lý và hành động ở người
sử dụng, thường tạo ra những khối cảm, hưng phấn, nói nhiều. Nếu như
người nghiện heroin chỉ trở nên hung dữ khi lên cơn thèm thuốc thì người
nghiện cần sa có thể trở nên hung dữ ngay cả khi đang hưng phấn. Khi sử
dụng cần sa, các cơ quan cảm giác như thị giác, thính giác, xúc giác và vị giác
bị kích thích mạnh dẫn đến ảo giác, trí nhớ lẫn lộn, khơng phân biệt được quá
khứ, hiện tại. Người nghiện có thể quên đi mọi lo lắng, ưu tư, cảm thấy mình
trơi nổi, bồng bềnh, khơng quan tâm đến việc gì, khơng có mục đích rõ ràng.
Từ đó dẫn đến những trang thái bất thường về hành vi, không làm chủ được
các hoạt động của bản thân. Sử dụng cần sa lâu dài có thể bị rối loạn thần
kinh, tình dục, giảm khả năng sinh sản, gây ra trụy thai, chết thai hay rối loạn
nhiễm sắc thể. Cần sa có thể gây ra bất tỉnh, thậm chí dẫn đến tử vong.
Bên cạnh đó cần sa cũng có một vài cơng dụng dùng trong y học như
chống lại tác dụng gây nơn của các chất hóa trị liệu chống ung thư, làm thư
giãn cơ, chống co giật, hạ nhãn áp. Tuy nhiên việc sử dụng cần sa cho mục
đích y học cần được kiểm sốt chặt chẽ.
1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học
hình sự
Bảng 1. 1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình
sự
(-)-Δ9-trans-Tetrahydrocannabinol
Tetrahydrocannabinol, THC

(-)-∆9-trans-Tetrahydrocannabinolic

Acid, THCA


Cannabinol, CBN

Cannabidiol, CBD

Cannabigerol, CBG

Cannabivarin, CBV


8

Cannabichromene, CBC

-

Công thức phân tử:C21H30O2

-

Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

-

Dược lý: Kháng viêm, kháng sinh,

giảm đau, chống nấm,

Hàm lượng THC trong cần sa thực vật khoảng 0,5-5%. Các kết quả
phân tích hàm lượng THC trong cần sa thực vật ở Việt Nam khoảng 3-5%, tuy
nhiên trong một số mẫu, có thể đạt tới 10-12%.
Bảng 1. 2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa
STT
1
2
3
4
Hàm lượng THC của các sản phẩm cần sa (cây, nhựa và dầu) là tỷ lệ
của khối lượng hoạt chất THC trên khối lượng của các phần của cây cần sa sử
dụng.
Ví dụ như một nghiên cứu ở Thụy Sĩ năm 2006 cho thấy 2/3 vụ bắt giữ
cây cần sa có hàm lượng THC trong cây cần sa từ 2% đến 12 %, 2/3 số vụ bắt
giữ nhựa cần sa có hàm lượng THC từ 4% đến 21 %, tùy thuộc vào điều kiện
và kỹ thuật canh tác cụ thể, còn q trình chiết nhựa và nụ hoa cần sa có thể
cho ra sản phẩm dầu cần sa có hàm lượng THC lên tới 60% [3].


9

1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng
cần sa
Chưa có nghiên cứu nào chỉ ra thời gian chính xác để phát hiện mẫu
dương tính với người sử dụng cần sa, bởi nó phụ thuộc nhiều yếu tố như loại
mẫu, độ nhạy của thiết bị phát hiện, tần suất, liều lượng, thời gian sử dụng lần
cuối cùng, hệ thống tiêu hóa, di truyền, tình trạng trao đổi chất, hệ thống bài
tiết của mỗi cá nhân, đồng thời còn những yếu tố khác tác động vào như bệnh
tật hay sử dụng cùng lúc các loại ma túy khác. Một yếu tố quan trọng cách
bảo quản mẫu cũng ảnh hưởng đến nồng độ chất chuyển hóa cần sa trong mẫu

vì thế mẫu ln được bảo quản trong tủ lạnh sâu.
Có nghiên cứu chỉ ra rằng tìm thấy THC-COOH trong mẫu máu là 3,5
(phạm vi 2 đến 7) ngày sau khi hút thuốc lá chứa 16 mg THC và 6,3 (phạm vi
2 đến 7) ngày sau khí dùng liều 34 mg. Nồng độ THC-COOH có thể phát hiện
trong máu từ 3,5 đến 74,3 giờ dao động từ 14 đến 49 ng/ml.
Dưới đây là thời gian gần đúng có thể phát hiện trên một số loại mẫu sau
khi lấy mẫu đối với người sử dụng cần sa [4, 7, 8, 9].
Bảng 1. 3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu

Mẫ

Người sử
một

Người sử
thường
Có thể kiểm tra nước tiểu, huyết tương, nước bọt, mẫu tóc, hơi thở để
phát hiện cần sa trong cơ thể người sử dụng. Vì tất cả các loại mẫu phẩm sinh
học nêu trên đều có những hạn chế cố hữu khác nhau trong việc đo lường thời
gian, thời lượng, tần suất và cường độ sử dụng ma túy, mẫu lựa chọn phụ
thuộc vào hoàn cảnh và các vấn đề phân tích đặc biệt. Để xác nhận việc lạm
dụng cần sa thì phân tích trong nước tiểu là cơng cụ hữu ích. Tuy nhiên trong
một số trường hợp để giải thích các tác động cấp tính sau khi lạm dụng cần sa,
trong trường hợp đối tượng cố tình hay căng thẳng q khơng thu được nước
tiểu và khi cần các yếu tố giải thích nồng độ THC và các chất chuyển hóa của


10

nó trong máu trong các trường hợp giải phẫu pháp y. Vì vậy, việc xét nghiệm

máu được thực hiện với chi phí rẻ hơn, việc lấy mẫu nhanh chóng, thời gian
phát hiện sớm và xử lý mẫu cũng dễ dàng hơn so với mẫu tóc, nước bọt và hơi
thở. Ngồi ra, để phân biệt giữa trường hợp sử dụng 1 lần/ không thường
xuyên với trường hợp sử dụng thường xuyên bằng cách phân tích THCCOOH trong máu vì thời gian bán hủy trong huyết tương của THC-COOH và
tích tụ trong máu dài với những người sử dụng thường xuyên. Lấy mẫu máu
sẽ thuận lợi trong việc phát hiện nhanh đối với trường hợp nghi ngờ vừa sử
dụng, phù hợp điều kiện tại các phịng thí nghiệm giám định Hóa học của các
tỉnh thành trong cả nước cũng như Viện Khoa học hình sự của Bộ cơng an
hiện nay [10].
Thời gian để phát hiện được cần sa phụ thuộc rất lớn vào tần suất sử
dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên (trên một lần một tuần),
dạng chuyển hóa của THC là THC-COOH trong máu nồng độ có thể đạt hàng
trăm ng/ml [4].
Xét nghiệm máu có thể dựa trên sự phát hiện THC-COOH, một dạng
chuyển hóa của THC, nó là thành phần mang hoạt tính dược lý chính của cần
sa. Các nghiên cứu trên cơ thể người chỉ ra rằng, 80-90% tổng số THC được
bài tiết trong vòng 5 ngày [11]. Trong huyết tương nồng độ THC cao nhất sau
khi hút một liều thường rơi vào 2 ng/ml trong 4-6 giờ, và có thể phát hiện sau
vài phút.
Hoạt chất THC có thể hấp thu qua niêm mạc đường tiêu hóa, tuy nhiên
tốc độ chậm và thất thường, mức độ hấp thu thường chỉ đạt 6-20% qua đường
tiêm tĩnh mạch, 18 qua đường hút. Do đặc tính ưa mỡ cao nên THC có thể
phân bố rộng rãi trong tồn bộ cơ thể. THC chuyển hóa ở phổi nếu dùng bằng
cách hút, ở gan nếu uống.
Mặc dù trong cần sa có trên 60 chất Cannabis được tìm thấy nhưng hoạt
chất chính tạo ra tác dụng của cần sa là THC, CBN và CBD. Để xác định việc
sử dụng cần sa, cần thiết phải kiểm tra dạng chưa chuyển hóa của các chất
cannabinoid chính là THC, CBN, CBD. Tuy nhiên lượng chất chưa chuyển
hóa này trong máu rất thấp, với THC chỉ khoảng 0,005-0,01 liều sử dụng, và
chỉ đào thải trong vòng vài giờ [2, 8, 9]. Bởi vậy hiện nay đối tượng giám

định chủ yếu là sản phẩm chuyển hóa của THC là THC-COOH.


11

1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong máu
1.1.6.1. Cấu tạo THC
-

Cơng thức phân tử: C21H30O2

-

Cơng thức cấu tạo:

1.1.6.2. Tính chất vật lý THC
Ở dạng tinh khiết, THC ở trạng thái rắn kết tinh khi lạnh, dạng nhớt và
dính khi ấm.
-

-

Tan rất ít trong nước nhưng tan tốt trong hầu hết các dung môi hữu cơ.

-

Khối lượng phân tử: M = 314,46 g/mol.

-

Nhiệt độ sôi: 157°C

-

Độ tan trong nước: 0,0028 mg/ml ở 20°C

1.1.6.3. Tính chất hóa học và sự chuyển hóa THC
THC tan nhiều trong hầu hết các dung mơi hữu cơ, đặc biệt là chất béo
và rượu. THC không bền với nhiệt độ cao và ánh sáng, dễ cháy. Nó tác dụng
với oxoaxit hay axit cacboxylic tạo ra este và nước. Nó có thể bị oxy hóa
thành anđehit hoặc xeton dưới điều kiện khác nhau.
Khi sử dụng cần sa, hoạt chất chính trong cần sa là THC bị hấp thụ vào
cơ thể. THC được đồng hóa nhanh chóng sau khi tiếp xúc, bởi vì bản chất hịa
tan trong chất béo cao của nó được phân phối đến mơ mỡ, gan, phổi và lá
lách. Sau đó, nó từ từ được quay trở lại máu và chuyển hóa, gây ra một thời
gian tương đối dài chy kì bán rã cuối. Biến đổi sinh học enzym gan tạo ra
nhiều chất chuyển hóa với C-11 là chính. THC chứa một nhóm –OH được
chuyển hóa trong gan, qua q trình hydro hóa nhóm –CH 3 tạo thành hợp chất
hoạt động thần kinh 11-hydroxy-D9-tetrahydrocannabinol (THC-OH), thông


12

qua q trình oxy hóa một nhóm –OH xúc tác bởi các enzyme Cytochrome
P450 (CYPs) trong gan tạo thành 11-nor-D9-tetrahydrocannabinol-9carboxylic acid (THC-COOH)ở dạng khơng hoạt động chứa một nhóm –
COOH, hợp chất quan trọng nhất để tiến hành phân tích. Sau đó THC-COOH
chứa 2 nguyên tử Hydro linh động, tác dụng với axit glucuronic trong cơ thể
người thành dạng muối của axit glucuronic, được bài tiết vào nước tiểu chủ
yếu dưới dạng liên hợp axit glucuronic. Q trình chuyển hóa được thể hiện
Glucuronide

qua sơ đồ sau [4, 8, 9]:

Hydro hóa

Oxy hóa

Hình 1. 3. Sơ đồ q trình chuyển hóa THC trong
máu 1.1.7. THC-COOH
THC-COOH được hình thành trong cơ thể do q trình oxy hóa THC bởi
các enzyme của gan, tạo thành một hợp chất tan được trong nước và chiếm
20% dưới dạng glucuronic khi bài tiết qua đường nước tiểu [7].
Công thức phân tử: C21H28O4
Khối lượng phân tử: 344,451 g/mol


13

Công thức cấu tạo:

Thời gian bán hủy: 5,2-6,2 ngày
Do đặc điểm cơng thức cấu tạo có 2 ngun tử H + linh động của nhóm –
OH và nhóm –COOH nên THC-COOH có các phản ứng hóa học đặc trưng
của nguyên tử H+.
1.2. Tổng quan về các phương pháp tách chiết THC-COOH trong máu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp phân
tích đó là phương pháp xử lý mẫu
Trong nền mẫu dịch sinh học (mẫu máu, nước tiểu), hàm lượng protein
có ảnh hưởng rất lớn tới kết quả phân tích THC-COOH. Hiện nay, để xử lý

mẫu sinh học, người ta hay áp dụng 3 kỹ thuật cơ bản đó là: Kết tủa protein,
chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn [8, 9]. Trong các nghiên cứu về phân tích
THC-COOH trong mẫu máu, các tác giả thường sử dụng kết hợp các kỹ thuật
xử lý mẫu nhằm loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, tăng hiệu suất thu hồi.
1.2.1. Phương pháp kết tủa protein
Kết tủa (tủa) protein là phương pháp đơn giản để chiết các chất phân tích
khỏi nền mẫu. Tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học bao gồm: dung
môi hữu cơ, muối vô cơ, axit và nhiệt độ. Để xử lý mẫu huyết tương nhằm
phân tích THC-COOH, giải pháp loại bỏ protein thường được sử dụng là
acetonitrile (ACN) và TCA (axit trichloroacetic).
Kỹ thuật tủa protein có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện và tốn ít dung
mơi. Tuy vậy, kỹ thuật tủa protein do chỉ có thể loại bỏ được phần protein và
peptid nên mẫu sau khi xử lý có nhiều thành phần tạp chất có thể làm tăng áp
suất ngược trên hệ thống sắc ký ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột phân tích và


14

gây nhiễu đường nền, ảnh hưởng đến kết quả xác định nồng độ chất có trong
mẫu khi phân tích.
Trong q trình phân tích, định lượng THC-COOH, phải kết hợp phương
pháp kết tủa protein với phương pháp chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn để làm
giảm sự ảnh hưởng của nền mẫu, đồng thời làm tăng độ nhạy của phương
pháp.
1.2.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
Chiết lỏng - lỏng là quà trình chiết mà hai pha đều ở trạng thái lỏng.
Trong đó, một pha chứa chất phân tích X i thường là pha nước (pha ban đầu
của mẫu có chất Xi) cịn pha kia là dung mơi chiết, chất chiết (thường là dung
mơi hữu cơ).
Đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp kết tủa protein kết hợp

phương pháp chiết lỏng – lỏng để tách chiết THC – COOH ra khỏi nền mẫu
sinh học. Phương pháp chiết này rất đơn giản, hiệu quả khá tốt và dịch chiết
chủ yếu được phân tích bằng các phương pháp sắc ký.
Phương pháp chiết lỏng – lỏng (LLE) là một phương pháp đơn giản,
nhanh chóng để tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu là dịch sinh học. Với nền
mẫu phức tạp như huyết tương thì việc loại bỏ protein, địi hỏi kỹ thuật xử lý
mẫu tốt hơn đó là kỹ thuật chiết pha rắn (SPE).
1.2.3. Phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp thụ pha
rắn với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố
của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau. Kỹ thuật SPE dựa vào sự phân
bố giữa một pha lỏng (nền mẫu hoặc dung dịch chất phân tích) và một pha rắn
(chất hấp phụ). Các chất phân tích có thể được hấp phụ vào pha rắn hoặc giữ
lại trong pha lỏng khi nó đi qua pha rắn. Khi hai pha cân bằng, chúng có thể
tách ra nhờ gạn, lọc, ly tâm hoặc một q trình khác tương tự. Nếu chất phân
tích bị hấp thụ trên bề mặt pha rắn, chúng có thể được rửa giải bằng cách sử
dụng dung môi phù hợp.
Quy trình chiết SPE bao gồm 4 bước chính:
- Hoạt hóa cột bằng các dung mơi hoặc dung dịch đệm thích hợp.