Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định các kiểu đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1p và 16q trên u nguyên bào thận

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

Nghiên cứu Y học

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA XÁC ĐỊNH
CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN LẶP HOẶC MẤT ĐOẠN TẠI VỊ TRÍ 1p VÀ 16q TRÊN
U NGUYÊN BÀO THẬN
Đỗ Thị Ngọc Thùy1, Nguyễn Huỳnh Minh Quân2, Nguyễn Văn Thắng3, Bùi Chí Bảo4, Ngơ Quốc Đạt5, Trần
Thanh Tùng1,Phan Đặng Anh Thư5

TÓM TẮT
Giới thiệu: U nguyên bào thận (UNBT) là loại u thận ác tính phổ biến nhất hiện nay ở trẻ em, thường gặp ở
trẻ dưới 5 tuổi. Chẩn đoán xác định chủ yếu dựa vào kết quả xét nghiệm Giải phẫu bệnh và ngày nay việc đáp
ứng điều trị còn phụ thuộc vào những biến đổi ở cấp độ sinh học phân tử.
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA phát hiện các kiểu đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại vị trí 1p và 16q
trên khối mô vùi nến khối u thận.
Đối tượng và Phương pháp: Mơ tả cắt ngang 44 trường hợp được chẩn đốn xác định u nguyên bào thận
tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Nhi đồng 1 từ 01/2015 đến 04/2021. Sử dụng khối vùi nến thực hiện phản
ứng MLPA phân tích các kiểu đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại vị trí 1p và 16q.
Kết quả: Tuổi trung bình của bệnh nhân có u nguyên bào thận là 3,34±0,45. Tỷ lệ nam nữ 1,2. 100% bệnh
nhân có khối u ở một bên thận tại thời điểm chẩn đoán. U nguyên bào thận dạng mô học thuận lợi chiếm tỷ lệ cao
nhất (97,7%) và u nguyên bào thận dạng không thuận lợi chiếm 2,2%. Di căn hạch chiếm tỷ lệ thấp (5,2%). Bệnh
nhân được điều trị phẫu thuật ở giai đoạn 1 của bệnh chiếm đa số (52,3%), tiếp theo là giai đoạn 2 (38,6%). 19%
bệnh nhân có mất đoạn exon trên NST 1p hoặc 16q.
Kết luận: Kỹ thuật MLPA trên mẫu vùi nến có thể dùng để đánh giá tình trạng mất đoạn hay lập đoạn ở
cấp độ exon khối u nguyên bào thận tuy nhiên cần chuẩn hoá kỹ thuật và quy trình do DNA dễ bị biến tính và
đứt gãy vì quá trình xử lý và cố định mẫu.
Từ khoá: U nguyên bào thận, U Wilms, MLPA

ABSTRACT
APPLICATION OF THE MLPA ASSAY IN THE MOLECULAR DIAGNOSIS OF CHROMOSOMES 1P

AND 16Q ALTERATIONS IN NEPHROBLASTOMA
Do Thi Ngoc Thuy, Nguyen Huynh Minh Quan, Nguyen Van Thang, Bui Chi Bao, Ngo Quoc Dat,
Tran Thanh Tung ,Phan Dang Anh Thu
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 6 - 2021: 207 - 215
Introduction: Nephroblastoma or Wilms Tumor is the most common malignant kidney tumor in children,
common in children under 5 years old. Definitive diagnosis is mainly based on pathology, and recently, the
treatment and prognosis also depends on molecular alterations.
Objectives: Using FFPE Tissue-Derived DNA, we applied the MLPA technique to detect and analyze the
1

Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Nhi Đồng 1
Trung Tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TPHCM
3 Khoa Điều dưỡng và Kỹ thuật Y học, Đại học Y Dược TPHCM
4 Đơn vị Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Đồng Thành Phố
5 Bộ môn Mô Phôi - Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: TS. Phan Đặng Anh Thư,
ĐT: 0947877908
2

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Email:

207


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

loss or repeat exon at 1p and 16q of the tumor cell.
Material and Methods: Cross-sectional description of forty-four cases at Children's Hospital 1 from 1/2015
to 4/2021.
Results: The mean age of patients with nephroblastoma was 3.34±0.45. Male to female ratio is 1.2. 100% of
patients had a tumor in one kidney at the time of diagnosis. Favorable histology nephroblastoma accounted for the
highest rate (97.7%), and unfavorable nephroblastoma accounted for 2.2%. Lymph node metastasis accounts for a
low rate (5.2%). Most patients received surgical treatment at stage 1 (52.3%), followed by stage 2 (38.6%). 19%
of patients have exon deletions on chromosomes 1p or 16q.
Conclusions: The MLPA technique Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) can be used to evaluate
alterations at the exon level in nephroblastoma, but is required standardization because the DNA is susceptible to
denaturation and breakage due to the specimen fixation and processing
Keywords: Nephroblastoma, Wilms Tumor, MPLA

ĐẶT VẤNĐỀ
U nguyên bào thận (UNBT) hay u Wilms là
loại u thận ác tính phổ biến nhất hiện nay ở trẻ
em(1-3) đặc biệt thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi(4, 5),
bệnh phản ánh mối quan hệ chặt chẽ giữa dị tật
và sự phát triển khối u(6). Đặc điểm lâm sàng,
tuổi, giai đoạn và chẩn đoán mơ bệnh học giải
phẫu bệnh khá đa dạng có thể ảnh hưởng đến
cách thức điều trị; điều này đã được chứng minh
trong nhiều cơng trình nghiên cứu(7-9). Hiện nay
các dấu ấn sinh học cấp độ phân tử như phân
tích mất và lặp đoạn 1p hoặc 16q đã được đưa
vào hướng dẫn phân loại tiên lượng điều trị ung
thư theo United Kingdom Children’s Cancer
Study Group (UKCCSG)(10), tổ chức ung thư nhi
Children ‘s Oncology group (COG)(11) và
International Society of Paediatric Oncology

(SIOP)(12).
Hiện nay có nhiều kỹ thuật xác định
những thay đổi của chuỗi nhiễm sắc thể(13) như
CGH(14), FISH(15), BAC arays(16), Southern blots và
thử nghiệm LOH(17). Hầu hết những kỹ thuật này
đều có thể phát hiện đột biến mất đoạn hay lặp
đoặn ở những exon riêng lẻ(13) nhưng mỗi kỹ
thuật lại tồn tại những hạn chế riêng như tốn quá
nhiều thời gian, công suất thấp và không nhạy
với những tái sắp xếp nhỏ trong cùng 1 gen.
Chính vì lẽ đó mà chúng tơi sử dụng kỹ thuật
khuếch đại đa đoạn dò hay MLPA (Multiplex

208

Ligation-dependent Probe Amplification), dựa
vào phản ứng nối sử dụng đến 40 mẫu dò đặc
hiệu cho những chuỗi DNA khác nhau, cho kết
quả nhanh chóng với độ nhạy cơng suất cao, giá
thành thấp(18) và dễ thực hiện(13). Nghiên cứu của
chúng tôi được thực hiện với mục tiêu phân tích
các kiểu đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại vị trí
1p và 16q trên bệnh nhân UNBT bằng kỹ thuật
MLPA.

ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Bệnh nhân chẩn đoán u nguyên bào thận
được phẫu thuật lấy u trước hoá trị tại bệnh viện
Nhi đồng 1 từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 04

năm 2021.
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Tất cả các trường hợp được chẩn đoán là u
nguyên bào thận được điều trị phẫu thuật trước
tại Bệnh viện Nhi đồng 1.
Tiêu chuẩn loại trừ
Các trường hợp thiếu các thông tin hoặc
mẫu được lấy bằng phương pháp sinh thiết lõi.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca 44 trường
hợp.

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

Nghiên cứu Y học

Quy trình tiến hành nghiên cứu

Bảng 1: Phân nhóm nguy cơ theo mơ học – Phân loại
COG (24)

Bốn mươi bốn trường hợp được chẩn đoán là u
nguyên bào thận tại bệnh viện Nhi đồng 1 từ
tháng 1/2015 đến tháng 4/2015 được đánh giá,
phân tích đặc điểm mô bệnh học trên lam nhuộm
Hematoxylin và Eosin và phân nhóm theo

NWTS và COG (Bảng 1, Biểu đồ 1).

Nhóm nguy cơ
Thuận lợi
Khơng thuận lợi

Loại mơ học trước hóa trị
Mơ học thuận lợi (khơng có hình ảnh
thối sản)
Thối sản lan toả hoặc khu trú

Phân loại AREN03B2
Mô học
thuận lợi

AREN0532
Nguy cơ rất thấp
Nguy cơ trung bình

AREN0533
Nguy cơ cao
Nguy cơ trung
bình

AREN03B2
Nguy cơ
thấp

Thối sản

2 bên

AREN0321
Nguy cơ cao

AREN0534

AREN0532

Giai đoạn I/II

Giai đoạn III

Giai đoạn I
(<2t, <550g)

GĐ I+II
Khơng có LOH 1p,
16q

GĐ I+II
Có LOH 1p,
16q

Khơng có
LOH có 1p, 16q

Nguy cơ rất thấp

Nguy cơ thấp

Nguy cơ
trung bình

Nguy cơ
trung bình

LOH 1p 16q

Biểu đồ 1. Hướng dẫn phân loại nguy cơ theo COG cho UNBT
Sử dụng khối vùi nến thực hiện phản ứng
MLPA xác định các kiểu thay đổi bản sao của
bệnh nhân.
Quy trình MLPA trên mẫu mơ vùi nến
Bước 1: Thu thập các khối mô vùi nến theo
tiêu chuẩn chọn mẫu.
Bước 2: Chiết tách DNA: Sử dụng bộ kit
QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit.Thực
hiện theo đúng quy trình kỹ thuật tách chiết
DNA của nhà sản xuất cung cấp từ mẫu mô vùi
nến. Đo nồng độ DNA sau tách chiết, để đảm
bảo DNA có nồng độ trên 25ng/ L, độ tinh sạch
ở khoảng 1,8-2,0 (20).

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Nguy cơ
cao
(19)

Bước 3: Thực hiện phản ứng MLPA để nhân
bản các các exon của các gen cần nghiên cứu. Sử
dụng bộ Kit SALSA MLPA probemix P380 B1
Wilms Tumour (MRC - Holland) chứa các đoạn
dò lai đặc hiệu với các vùng trên gen, ngồi ra
cịn các đoạn nội chuẩn (đoạn gen tham khảo)
giúp kiểm chuẩn phản ứng MLPA. Sử dụng quy
trình kỹ thuật nhân bản dò MLPA, để xác định
các kiểu thay đổi bản sao trên máy PCR
eppendorf. Quy trình thực hiện phản ứng MLPA
do MRC – Holland cung cấp(20).
Bước 4: Điện di mao quản: Quy trình kỹ
thuật: thực hiện đúng quy trình thực hiện điện
di mao quản trên máy giải trình tự ABI3500 do

209


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

hãng cung cấp.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Bước 5: Phân tích kết quả: Kết quả sau khi
thực hiện điện di sẽ được phân tích tự động để
tìm đột biến mất đoạn gen nhờ vào phần mềm
GeneMarker version 1.97 (Softgenetics, State

College, PA). Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng
bảng và dạng biểu đồ sóng (Electropherogram).

Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận u
thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi (77,3%), trong đó
thường gặp nhất ở trẻ 1-2 tuổi (27,3%), có 3
trường hợp trẻ dưới 1 tuổi. Độ tuổi trung bình là
3,34±0,45; Tuổi thấp nhất trong nghiên cứu này
là 4 tháng tuổi, và cao nhất là 12 tuổi (145 tháng)
(Bảng 2). Tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ trong
nghiên cứu này là 1,2.

Phân tích và xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm SPSS 25 để phân tích số
liệu. Sử dụng tần số và tỉ lệ % để mô tả các biến
định tính (nhị giá, thứ tự, danh định). Sử dụng
trung bình và độ lệch chuẩn để mơ tả các biến
định lượng.
Y đức
Nghiên cứu đã được thông qua Hội Đồng
Khoa Học và Đạo Đức trong Nghiên cứu Y sinh
học bệnh viện Nhi Đồng 1, kèm theo giấy chứng
nhận số 549/GCN-BVNĐ1 tháng 12 năm 2020.

Bảng 2: Phân bố u nguyên bào thận theo tuổi
Nhóm tuổi
<1
1-<2
2-<3
3-<4

4-<5
5-<6
6-<12
>=12
Tổng cộng

Số lượng
3
12
8
6
5
2
7
1
44

Tỷ lệ (%)
6,8
27,3
18,2
13,6
11,4
4,5
15,9
2,3
100

Bảng 3: Đặc điểm u ngun bào thận
Tuổi Trung bình

Giới: Nam
Nữ
Vị trí u: Trái
Phải
Hai bên
Mơ bệnh học: Thuận lợi
Khơng thuận lợi
Nhóm nguy cơ: Thấp
Trung bình
Cao
Giai đoạn u
I
II
III
IV
Di căn hạch
Có
Khơng
Tổng cộng

Đặc điểm
3,34±0,45
Tỉ lệ nam/nữ =1,2

Tỉ lệ trái/phải =1,2

Thuận lợi/Không thuận lợi= 43/1

U thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi (77,3%),
trong đó thường gặp nhất ở trẻ 1-2 tuổi (27,3%),

có 3 trường hợp trẻ dưới 1 tuổi. Độ tuổi trung
bình là 3,34±0,45; Tuổi thấp nhất trong nghiên

210

Tỷ lệ (%)

47,7
52,3
0
97,7
2,3
31,8
54,6
13,6
52,3
38,6
9,1
0
5,2
94,8

N= 44

100

cứu này là 4 tháng tuổi và cao nhất là 12 tuổi (145
tháng). U thường gặp ở giai đoạn I, chiếm hơn
50% (52,3%), tiếp đến là giai đoạn II, chiếm
38,6%. Khơng có trường hợp bệnh ở giai đoạn

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

4,5 trong nghiên cứu này. Về đặc điểm mơ học,
đa số được xếp nhóm thuận lợi (nguy cơ thấp và
trung bình) chiếm 97,7%. Chỉ có 1 trường hợp
không thuận lợi (nguy cơ cao) được ghi nhận
trong thời gian nghiên cứu. Trong 38 mẫu có
phẫu thuật hạch ổ bụng có 2 trường hợp di căn
hạch lympho (5,2%), 6 trường hợp không phẫu
thuật hạch nên không đánh giá (Bảng 3).
Kết quả phân tích các kiểu đột biến mất hoặc
lặp đoạn exon tại vị trí 1p và 16p bằng phƣơng
pháp MLPA

Nghiên cứu Y học

DNA thu được dao động trong khoảng 30450ng/ L. Lượng DNA đủ để thực hiện MLPA là
25ng/mL. Tỷ số OD 260/280nm trong khoảng 1,82,0.Trong 44 mẫu vùi nến chẩn đoán UNBT được
lưu trữ và thực hiện phản ứng MLPA, có 26 mẫu
thu được kết quả, 18 mẫu không xác định được
kết quả. Những mẫu thu thập từ năm 2018 có tỷ
lệ thực hiện MLPA thành cơng hơn so với những
mẫu thu thập trước 2018 (tỷ lệ trên 66,7%). Có
05/26 bệnh nhân đã được chẩn đốn u ngun
bào thận có mất đoạn exon trên NST 1p hoặc 16q
(tỷ lệ 19%).

Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp
MPLA trên khối vùi nến cho thấy hàm lượng

Tỷ lệ mất đoạn exon
150

100
50
0

19

15

11

NST 1p hoặc 16q

NST 1p

NST 16q

Có

8
NST 1p và 16q

Khơng

Biểu đồ 2: Kết quả xác định mất đoạn exon trên vị trí 1p và 16q

Hình 1: Kết quả phân tích MLPA

Chun Đề Giải Phẫu Bệnh

211


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

Trong đó, 4/26 có mất đoạn exon ở NST số
1p (15%), 3/26 mất đoạn ở 16q (11%) và 2/26
LOH ở cả 1p và 16q (8%). Ngồi ra có 4/26 (15%)
trường hợp tăng đoạn trên 1p, đây cũng là một
yếu tố chỉ dấu có tiên lượng điều trị (Biểu đồ 2,
Hình 1). Một số gen khác có liên quan cũng được
phát hiện bằng kỹ thuật MLPA (Bảng 4).
Bảng 4: Một số gen có liên quan khác được phát hiện
bằng kỹ thuật MLPA
Gen biến đổi
WT1
TP53
IGF2
MYCN

Số lượng
2/26

5/26
0/36
5/26
2/26

Tỷ lệ
8%
19%
0%
19%
8%

Loại đột biến
Mất đoạn dị hợp tử
Tăng đoạn
Mất đoạn
Tăng đoạn
Tăng đoạn

BÀN LUẬN
Đặc điểm bệnh nhân UNBT
U nguyên bào thận là loại u thận ác tính phổ
biến nhất hiện nay ở trẻ em, độ tuổi dưới 5 là
phổ biến. Trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh
nhân lớn nhất 12 tuổi (1 trường hợp), trẻ từ 1-2
tuổi có tần suất mắc bệnh nhiều nhất (chiếm
27,3%), nghiên của tác giả Trần Đức Hậu cũng
cho thấy độ tuổi trung bình khi được chẩn đốn
là 3,05 tuổi (36,7 tháng) (21). Số liệu này phù hợp
khi so sánh giai đoạn tuổi mắc UNBT nhiều nhất

trong nghiên cứu của Hoàng Ngọc Thạch, Bệnh
viện Nhi Trung Ương năm 2013. Tuổi trung bình
là 3,34 tuổi, thấp hơn trong nghiên cứu của C
Mitchell, tuổi trung bình là 2,71 và cao hơn
trong nghiên cứu của A.F.Uba, với tuổi trung
bình là 4 tuổi(2, 10).
Tỷ lệ bệnh nhân nam/nữ là 24/20, như vậy
không có sự khác biệt trong tần suất mắc bệnh ở
nam và nữ. Trong một số nghiên cứu, tỷ lên nữ
mắc bệnh cao hơn so với nam.Nghiên của tác giả
Trần Đức Hậu cũng cho thấy độ tuổi trung bình
khi được chẩn đoán là 3,05 tuổi (36,7 tháng) (21).
Trong những nghiên cứu khác ở các nước phát
triển, không ghi nhận sự khác biệt về phân bố
theo giới tính trên bệnh nhân UNBT (22), nhưng
trong nghiên cứu của Trần Đức Hậu tỉ lệ trẻ trai/

212

trẻ gái = 1,7 (21). Tuy nhiên trong nghiên cứu của
A.F. Uba và cộng sự, tỷ lệ nữ lại nhiều hơn
nữ/nam=1,9(2).
Về vị trí khối u, trong nghiên cứu của
chúng tôi, u hiện diện một bên thận, trái hoặc
phải, không có trường hợp hai bên tại thời
điểm xác định bệnh. Theo nghiên cứu của tác
giả Hoàng Ngọc Thạch, UNBT hai bên chiếm
tỷ lệ 7%, cũng theo tác giả, nếu u xuất hện hai
bên thận trong cùng thời điểm chẩn đoán, tiên
lượng xấu hơn so với khác thời điểm(23).

Xét về đặc điểm giai đoạn bệnh lúc chẩn
đoán, đa số được chẩn đoán ở giai đoạn I, chiếm
tỷ lệ cao nhất trong nghiên cứu 52,3%, giai đoạn
II là 38,6%, giai đoạn III là 9,1%, Khơng có trường
hợp ở giai đoạn IV và V. Kết quả này phù hợp
với nghiên cứu của Hoàng Ngọc Thạch và cộng
sự, tỷ lệ giai đoạn bệnh 1,2,3,4,5 tương ứng là
41,3%, 26,09%, 26,09%,0%, 6,52%(23), còn trong
nghiên cứu của A.F.Uba 3,1%, 25%, 34,4%,37,5%,
0%(2). Theo Niedzielski và cộng sự, tỷ lệ sống cịn
khơng bệnh(EFS) ở các giai đoạn là 82.1%,
89,5%,75%, 44,4% và tỷ lệ sống toàn thể (OS) là
92,9%, 89,5%,87,5%,100%. như vậy đặc điểm giai
đoạn bệnh lúc chẩn đốn có ảnh hưởng đáng kể
đến EFS và OS của người bệnh.
Về mô bệnh học trong nghiên cứu này,
chúng tôi chỉ ghi nhận 1 trường hợp không
thuận lợi (nguy cơ cao) (2,3%) và 2/44 bệnh nhân
có di căn hạch (4,5%). Theo nghiên cứu của
Niedzielski và cộng sự của tỷ lệ di căn hạch là
7%. Như vậy tỷ lệ di căn trong nghiên cứu này
thấp hơn so với nghiên cứu khác.
Kết quả phân tích mẫu bàng phƣơng pháp
MPLA trên khối vùi nến

Đặc điểm DNA tách chiết từ mẫu mơ vùi nến
Mục đích của nghiên cứu này là ứng dụng
kỹ thuật MLPA xác định đột biến gen, vì kỹ
thuật MLPA có thể định lượng số lượng bản sao
của nhiều trình tự trong một trong một phản

ứng. Sử dụng khối vúi nến có ưu điểm là nguồn

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

mẫu nghiên cứu dồi dào, tuy nhiên, vấn đề lớn
nhất trong việc sử dụng khối vùi nến là chất
lượng DNA chiết tách được vì DNA có thể bị
đứt gãy, hư trong quá trình bảo quản hoặc kỹ
thuật chất cố định ban đầu cũng ảnh hưởng đến
chất lượng DNA trong khối vùi nến sau này(24 -25).
Quan trọng nhất trong quy trình chiết tách
DNA là phảỉ đạt độ tinh sạch, hạn chế tối đa tạp
chất vì tạp chất cịn tồn dư sau chiết tách sẽ ảnh
hưởng đến quá trình gắn mồi và khuếch đại sản
phẩm gen. Để kiểm soát q trình này, chúng tơi
đo mẫu DNA trên máy Nanodrop, độ tinh sạch
được tính theo tỷ lệ A260/280 trong khoảng 1,82,0. Các mẫu trong nghiên cứu đều đạt độ tinh
sạch cao, nếu mẫu nào chưa đạt, chúng tôi tiến
hành chiết tách lại. Trong nhiều nghiên cứu so
sánh trước đây, nhiều tác giả cũng nhận định sử
dụng bộ chiết tách kit QIAamp DNA FFPE
Tissue Kit sẽ thu được kết quả DNA tối ưu cho
kỹ thuật MLPA(16,25), do đó chúng tơi lựa chọn bộ
kit này trong nghiên cứu của chúng tôi. Mặc dù
chiết tách được mẫu DNA, độ tinh sạch của mẫu
thử, nồng độ đạt chuẩn theo theo quy định
nhưng kết quả thực hiện MLPA vẫn khơng xác

định được. Chính vì thế mà trong 44 mẫu UNBT
trong nghiên cứu, MLPA đọc được kết quả 26
mẫu, 18 mẫu không xác định được kết quả.
Những mẫu thu thập từ năm 2018 trở về sau
có tỷ lệ thực hiện MLPA thành công hơn so với
những mẫu thu thập trước 2018 (tỷ lệ trên
66,7%). Trong nghiên cứu của Alice Guyard và
cộng sự, đã tiến hành so sánh chất lượng DNA
lúc lấy mẫu và sau 5,5 năm, kết quả là lượng
DNA giảm 53% tính hiệu khuếch đại khi thực
hiện qPCR cũng giảm từ 56-15%(26). Như vậy,
thời gian lưu mẫu càng gần vời thời điểm nghiên
cứu, chất lượng và lượng mẫu DNA được đảm
bảo hơn.
Trong 26 trường hợp thực hiện phản ứng
MLPA, phát hiện 05/26 bệnh nhân đã được chẩn
đốn UNBT có LOH trên NST 1p hoặc 16q
(19%). Trong đó, 4/26 có LOH ở NST số 1p (15%),

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Nghiên cứu Y học

3/26 LOH ở 16q (11%). 2/26 LOH ở cả 1p và 16q
(8%). Kết quả nghiên cứu này cũng khá tương
đồng trong nghiên cứu của Hannah M. Phelps,
trong đó có 17 % LOH ở 16q và 12% LOH ở 1p(27).
Trong những nghiên cứu trước, LOH ở 1p và
16q cũng xác định được mối liên quan với tiên
lượng sống của người bệnh. Như vậy trong 5

trường hợp đã được chẩn đốn và xếp giai đoạn,
có thể dựa vào kết quả MLPA xác định có LOH
ở 1p và 16q làm tiêu chuẩn phân nhóm nguy cơ
trong điều trị theo COG. Căn cứ vào Biểu đồ 1,
có một trường hợp trẻ <1 tuổi, giai đoạn I, xếp lại
nhóm nguy cơ thấp, 03 trường hợp ở giai đoạn I
hoặc II được xếp vào nhóm nguy cơ trung bình
và 01 trường hợp ở giai đoạn III của bệnh được
xếp lại vào nhóm nguy cơ cao. Theo Grundy P.E
và cơng sự, EFS sau 4 năm ở nhóm nguy cơ thấp
là 91,2%, cịn ở nhóm nguy cơ trung bình là
83,9%, nhóm nguy cơ cao là 83,9%(19, 28).

Tăng số lượng bản sao trên 1q
4/26 có tăng số lượng bản sao trên 1p (15%).
Theo nghiên cứu của Hannah M. Phelps và cộng
sự, những thay đổi bất thường về gen chiếm
khoảng 30% trường hợp u nguyên bào thận(27),
NWTS và SIOP cũng đã nghiên cứu tỷ lệ sống
sót, EFS ở các giai đoạn bệnh sau khi điều trị ở
bệnh nhân có tăng đoạn trên 1q. Kết quả nhận
thấy những bệnh nhân có tăng 1p, EFS và OS sau
8 năm thấp hơn so với nhóm khơng có tăng 1q,
EFS 77% và OS 88%, trong khi EFS ở nhóm cịn
lại là 90% và 96%(27). Như vậy việc xác định tăng
số lượng số bản sao trên 1q có ý nghĩa lớn trong
việc đánh giá tiên lượng bệnh.

Bất thường ở gen TP5
Trong nghiên cứu của chúng tôi, không thấy

biến đổi mất đoạn ở gen TP53. Theo những
nghiên cứu trước đây, mất đoạn gen TP53, hiện
diện ở 50-60% UNBT dạng thoái sản lan tỏa(29).
Việc phát hiện những biến đổi ở gen TP53 bằng
phương kỹ thuật MLPA cũng có ý nghĩa trong u
nguyên bào thận dạng thoái sản lan tỏa. Trong

213


Nghiên cứu Y học

nghiên cứu của chúng tơi có một trường hợp
UNBT dạng thối sản lan tỏa, nhưng khơng phát
hiện bất thường gen TP53 trên mẫu này.

Bất thường ở gen WT

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã tài trợ kinh phí
để thực hiện đề tài, cảm ơn tập thể khoa Giải Phẫu Bệnh
bệnh viện Nhi Đồng 1 đã tạo điều kiện cho chúng tôi
tiến hành đề tài.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Gen kiềm chế u, gồm WT1 và WT2. 2/26
trường hợp có bất thường ở gen WT. Việc mất
đoạn gen WT1 liên quan đến nhiều hội chứng

như WARG, Denys Drash, BeckwithWiedemann,< WT1 là tác nhân của 2 hội
chứng WARG và Denys-Drash, những bệnh
nhân của 2 hội chứng này có nguy cơ bị u
nguyên bào thận cao: với WAGR là trên 30%
còn với Denys-Drash là 95%(30). Dome JS và
cộng sự trong nghiên cứu về gen của các bệnh
nhân hội chứng Beckwith-Wiedemann năm
2002, phát hiện gen WT2. WT2 nằm ở vị trí
11p15(31). Trên những bệnh nhân hội chứng
Beckwith-Wiedemann có u nguyên bào thận,
khoảng 5-10% bệnh nhân được phát hiện mất
dị hợp tử (heterozygosity) của đoạn gen
WT2(31). Việc nghiên cứu đột biến ở gen WT1
liên quan nhiều đến cơ chế di truyền và tiến
triển của UNBT.

1.

KẾT LUẬN

9.

2.

3.

4.
5.

6.

7.
8.

Nghiên cứu chúng tôi ghi nhận u nguyên
bào thận thường gặp ở bệnh nhân nhỏ hơn 5

10.

tuổi, nhóm tuổi 1-2 tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất. U
chủ yếu ở giai đoạn 1 (52,3%). Dạng mô học
thuận lợi chiếm ưu thế (97,7%). Thực hiện kỹ

11.

thuật MLPA phát hiện 05 trường hợp có mất
đoạn exon trên NST 1p hoặc 16q (tỷ lệ 19%). Kỹ
thuật MLPA thực hiện trên mẫu vùi nến có

12.

nhiều khó khăn hơn thực hiện trên mẫu máu
hay mẫu mô tươi do mẫu DNA bị đứt gãy nhiều
do quá trình bảo quản và cố định, có thể tạo nên

13.

những đột biến giả, cần chuẩn hố kỹ thuật và
quy trình.
Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Đại

214

14.

Szychot E, Apps J, Pritchard-Jones K (2014). Wilms’ tumor:
biology, diagnosis and treatment. Translational pediatrics.
2014;3(1):12.
Uba A, Chirdan L (2007). Childhood Wilm's tumour:
prognostic factors in north central Nigeria. West African journal
of medicine. 2007;26(3):222-5.
Stiller C, Parkin D (1990). International variations in the
incidence of childhood renal tumours. British journal of cancer.
1990;62(6):1026-30.
Matsunaga E (1981). Genetics of Wilms' tumor. Human
genetics. 1981;57(3):231-46.
Rivera MN, Haber DA (2005). Wilms' tumour: connecting
tumorigenesis and organ development in the kidney. Nature
Reviews Cancer. 2005;5(9):699-712.
Pritchard-Jones K, Kelsey A, Vujanic G, Imeson J, Hutton C,
Mitchell C (2003). Older age is an adverse prognostic factor in
stage I, favorable histology Wilms’ tumor treated with
vincristine monochemotherapy: a study by the United
Kingdom Children’s Cancer Study Group, Wilm’s Tumor
Working Group. Journal of clinical oncology. 2003;21(17):326975.
Davidoff AM (2009). Wilms tumor. Current opinion in
pediatrics. 2009;21(3):357.
Green DM, Beckwith JB, Weeks DA, Moksness J, Breslow NE,
D'Angio GJ (1994). The relationship between microsubstaging
variables, age at diagnosis, and tumor weight of children with

stage I/favorable histology Wilms' tumor. A report from the
National Wilms' Tumor Study. Cancer. 1994;74(6):1817-20.
Breslow N, Sharples K, Beckwith JB, Takashima J, Kelalis PP,
Green DM, et al (1991). Prognostic factors in nonmetastatic,
favorable histology Wilms' tumor. Results of the Third
National Wilms' Tumor Study. Cancer. 1991;68(11):2345-53.
Mitchell C, Jones PM, Kelsey A, Vujanic G, Marsden B,
Shannon R, et al (2000). The treatment of Wilms' tumour:
results of the United Kingdom Children's cancer study group
(UKCCSG) second Wilms' tumour study. British journal of
cancer. 2000;83(5):602-8.
Dome JS, Perlman EJ, Graf N (2014). Risk stratification for
wilms tumor: current approach and future directions.
American Society of Clinical Oncology Educational Book.
2014;34(1):215-23.
Vujanić GM, Sandstedt B, Harms D, Kelsey A, Leuschner I, de
Kraker J, et al (2002). Revised International Society of
Paediatric Oncology (SIOP) working classification of renal
tumors of childhood. Medical and pediatric oncology.
2002;38(2):79-82.
Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D,
Diepvens F, Pals G (2002). Relative quantification of 40 nucleic
acid sequences by multiplex ligation-dependent probe
amplification. Nucleic Acids Research. 2002;30(12):e57-e.
Kallioniemi A, Kallioniemi O-P, Sudar D, Rutovitz D, Gray
JW, Waldman F, et al (1992). Comparative genomic

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021

15.

16.

17.
18.

19.

20.

21.

22.
23.

24.

hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid
tumors. Science. 1992;258(5083):818-21.
Klinger K, Landes G, Shook D, Harvey R, Lopez L, Locke P, et
al (1992). Rapid detection of chromosome aneuploidies in
uncultured amniocytes by using fluorescence in situ
hybridization (FISH). American journal of human genetics.
1992;51(1):55.
Snijders AM, Nowak N, Segraves R, Blackwood S, Brown N,
Conroy J, et al (2001). Assembly of microarrays for genomewide measurement of DNA copy number. Nature genetics.
2001;29(3):263-4.

Devilee P, Cleton-Jansen A-M, Cornelisse CJ (2001). Ever since
Knudson. Trends in genetics. 2001;17(10):569-73.
Stuppia L, Antonucci I, Palka G, Gatta V (2012). Use of the
MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number
alterations in human genetic diseases. International journal of
molecular sciences. 2012;13(3):3245-76.
Dix DB, Fernandez CV, Chi Y-Y, Mullen EA, Geller JI, Gratias
EJ, et al (2019). Augmentation of therapy for combined loss of
heterozygosity 1p and 16q in favorable histology Wilms
tumor: A Children’s Oncology Group AREN0532 and
AREN0533 study report. Journal of Clinical Oncology.
2019;37(30):2769.
Qiaagen (2020). QIAamp DNA FFPE Advanced Handbook
Qiaagen: Qiaagen; 2020 [updated 05/2020; cited 2021 05].
/>Trần Đức Hậu (2005). Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng và
kết quả bước đầu điều trị u nguyên bào thận tại Bệnh viện
Nhi trung ương từ 1998-2005. Đại học Y Hà Nội.
Kaatsch P (2010). Epidemiology of childhood cancer. Cancer
treatment reviews 2010;Jun;36(4):277-85.
Hồng Ngọc Thạch, Phó Hồng Diệp (2013). Phân loại u thận
trẻ em và u nguyên bào thận theo SIOP 2001 tại Bệnh viện Nhi
Trung Ương từ 2019-2012. 2013;6(1):60.
Atanesyan L, Steenkamer MJ, Horstman A, Moelans CB,
Schouten JP, Savola SP (2017). Optimal fixation conditions and

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Nghiên cứu Y học

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

DNA extraction methods for MLPA analysis on FFPE tissuederived DNA. American journal of clinical pathology.
2017;147(1):60-8.
Hedegaard J, Thorsen K, Lund MK, Hein A-MK, HamiltonDutoit SJ, Vang S, et al (2014). Next-generation sequencing of
RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and
formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer
and normal tissue. PloS one. 2014;9(5):e98187.
Guyard A, Boyez A, Pujals A, Robe C, Van Nhieu JT, Allory Y,
et al (2017). DNA degrades during storage in formalin-fixed
and paraffin-embedded tissue blocks. Virchows Archiv.
2017;471(4):491-500.
Phelps HM, Kaviany S, Borinstein SC, Lovvorn HN (2018).
Biological drivers of Wilms tumor prognosis and treatment.
Children. 2018;5(11):145.
Wittmann S, Zirn B, Alkassar M, Ambros P, Graf N, Gessler M
(2007). Loss of 11q and 16q in Wilms tumors is associated with
anaplasia, tumor recurrence, and poor prognosis. Genes,
Chromosomes and Cancer. 2007;46(2):163-70.

Ooms AH, Gadd S, Gerhard DS, Smith MA, Auvil JMG,
Meerzaman D, et al (2016). Significance of TP53 mutation in
Wilms tumors with diffuse anaplasia: A report from the
children's oncology group. Clinical Cancer Research.
2016;22(22):5582-91.
Kalapurakal JA DJ, Perlman EJ et al (2004). Management of
Wilms' tumour: current practice and future goals. Lancet
Oncology. 2004;Jan;5(1):37-46.
Dome JS CM (2002). Recent advances in Wilms tumor
genetics. Current Opinion in Pediatrics. 2002;Feb; 14(1) 5-11.

Ngày nhận bài báo:
Ngày phản biện nhận xét bài báo:

19/11/2021
22/11/2021

Ngày bài báo được đăng:

08/12/2021

215