Tài liệu TINH SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH pptx

IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
TINH SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH
o0o
I. Giới thiệu chung
1. Kháng thể
1.1. Định nghĩa (1)
Kháng thể là các gamma globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng
liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó. Kháng thể còn được gọi là
globulin miễn dịch (immunoglobulin), viết tắt là Ig, vì khi chạy điện di miễn dịch thì
kháng thể nằm ở vùng globulin.
Hình 1: Điện di
protit huyết tương
1.2. Cấu trúc của kháng thể miễn dịch (1), (2)
Tất cả các kháng thể là một phân tử đối xứng, đều có cấu trúc giống nhau gồm 4
chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ ký hiệu là L và 2 chuỗi nặng ký hiệu là H, giống nhau đôi
một, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S).
1
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
(a)
(b)
2
(c)
(d)
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Hình 2 (a,b,c,d): Cấu trúc của một phân tử kháng thể
1.2.1. Chuỗi nhẹ L (light)
Mỗi chuỗi nhẹ là một chuỗi polypeptid cấu tạo bởi khoảng 214 axit amin, được
đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành hai vùng:
- Vùng hằng định C (constant: hằng định): nằm ở sau, có loại và trình tự axxit
amin không thay đổi.
- Vùng thay đổi V (variable: thay đổi): nằm phía trước, có loại và trình tự axit

amin thay đổi tùy theo từng loại kháng thể. Đặc biệt, trong vùng V có một vùng mà loại
và trình tự axit amin rất hay thay đổi gọi là vùng siêu biến. Mỗi loại kháng thể đơn dòng
có một vùng siêu biến khác nhau.Có hai loại chuỗi nhẹ khác nhau: chuỗi kappa và chuỗi
lamda. Trong phân tử kháng thể hai chuỗi nhẹ giống nhau (hai chuỗi kappa hoặc hai
chuỗi lamda).
1.2.2. Chuỗi nặng H (heavy)
Chuỗi nặng có cấu tạo tương tự chuỗi nhẹ: chuỗi polypeptid gồm khoảng 440 axit
amin, được đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành ba hoặc bốn
3
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
vùng tùy theo từng chuỗi nặng: các vùng C gồm CH1, CH2, CH3 (và CH4), vùng V và
vùng siêu biến. Mỗi loại kháng thể đơn dòng có một vùng siêu biến khác nhau.
Có 5 loại chuỗi nặng khác nhau: chuỗi gamma, chuỗi alpha, chuỗi muy, chuỗi
delta và chuỗi epsilon. Trong phân tử kháng thể hai chuỗi nặng giống nhau.
1.2.3. Sự liên kết giữa các chuỗi
Hai chuỗi nặng nối với nhau bằng các cầu nối disulfua (S - S), số cầu nối disulfua
thay đổi tùy từng chuỗi. Chuỗi nhẹ nối với chuỗi nặng cũng bằng các cầu nối disulfua.
Trên chuỗi nặng, giữa CH1 và CH2 là vùng bản lề. Nhờ vùng bản là này mà phân
tử kháng thể có thể khép lại hoặc mở ra 0-180 độ làm cho phân tử kháng thể dễ dàng
gắn với các quyết định kháng nguyên tương ứng.
1.2.4. Các mảnh của kháng thể
Các men tiêu đạm như papain, pepsin có thể cắt phân tử kháng thể ra thành các
mảnh. Papain cắt phân tử kháng thể ngay trước vùng bản lề cho ra 2 mảnh Fab và 1
mảnh Fc. Pepsin cắt phân tử kháng thể sau cùng bản lề cho ra 1 mảnh F (a’b’) 2 và một
mảnh Fc’.F (fragment: mảnh), ab (antigen binding: gắn kháng nguyên), c (cristallisable:
kết tinh được)
1.2.5. Vị trí kết hợp kháng nguyên, hóa trị kháng thể
Hai vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể tạo thành
vị trí kết hợp với quyết định kháng nguyên tương ứng. Mỗi phân tử kháng thể nguyên vẹn
có hai vị trí kết hợp, gọi là hóa trị hai. Mảnh Fab có một hóa trị, mảnh F(a’b’) 2 có hóa trị

hai.Do phân tử kháng thể có hóa trị hai, kháng nguyên có nhiều quyết định kháng
nguyên, nên phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể có thể tạo thành mạng lưới
Marrack.
1.2.6. Các lớp kháng thể
- Tên của các lớp:
Kháng thể dịch thể được chia thành năm lớp: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Tên của
lớp dựa theo tên của chuỗi nặng.
Bảng 1. Tên các chuổi nặng và chuổi nhẹ của các lớp Ig
Các lớp còn được chia thành dưới lớp:
4
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 trong đó các chuỗi nặng lần lượt là gamma 1, gamma 2,
gamma 3, gamma 4.
IgA: IgA1, IgA2 tùy theo chuỗi nặng là alpha 1 và alpha 2.
- Đặc điểm về cấu trúc của các lớp:
● IgG ở dạng monome đơn phân tử, trọng lượng là 150000 (chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda
là 25000, chuỗi nặng gamma là 50000).
● IgA có 2 dạng: dạng monome đơn phân tử, trọng lượng là 160000, dạng dime nhị phân
thường có trong dịch tiết gọi là IgA tiết (slgA, secretoire: tiết).
● Igm thường ở dạng ngũ phân trọng lượng là 900000.
● IgD ở dạng đơn phân tử trọng lượng 175000.
● IgE ở dạng đơn phân tử trọng lượng là 190000.
Các immunoglobulin khác nhau về chuỗi nặng: về tỉ lệ % gluxit và đặc biệt là khác
nhau ở đoạn Fc liên quan đến chức năng của từng immunoglobulin.
Bảng 2: Tính chất
của các lớp kháng
thể
5
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
1.3. Đặc điểm, chức năng của kháng thể (1)

1.3.1. Đặc điểm của kháng thể
1.3.1.1. Tính kháng thể
Tính kháng thể là khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng, đặc
hiệu có nghĩa là kháng thể do kháng nguyên nào kích thích tạo ra thì chỉ kết hợp với
kháng nguyên ấy mà thôi. Tính kháng thể là đặc điểm quan trọng nhất của kháng thể.Tuy
nhiên đôi khi xảy ra phản ứng chéo giữa kháng thể và kháng nguyên không tương ứng do
kháng nguyên này có cấu trúc gần giống với kháng nguyên đã kích thích tạo ra nó. Phản
ứng chéo cho hình ảnh dương tính giả trong phản ứng miễn dịch.
Vị trí gắn với kháng nguyên nằm ở đoạn Fab, giữa các CDR của mỗi cặp chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ. Như vậy mỗi phân tử kháng thể nguyên vẹn có hai vị trí gắn với
kháng nguyên, gọi là có hóa trị hai. Kháng thể dạng dime có hóa trị 4, kháng thể dạng
pentame có hóa trị 10. Nhờ kháng thể có hóa trị hai trở lên mà kết hợp kháng nguyên-
kháng thể có thể tạo ra được mạng lưới Marrack.
Đoạn F(a’b’)
2
cũng có hóa trị hai nên có thể được sử dụng thay thế phân tử kháng
thể nguyên vẹn trong một số phản ứng miễn dịch khi cần tránh những tác dụng riêng của
đoạn Fc.
1.3.1.2. Tính kháng nguyên
- Tính kháng nguyên của phân tử kháng thể là khả năng kích thích cơ thể khác tạo ra
kháng thể kháng lại chính nó. Lý do là phân tử kháng thể bản chất là một loại protit có
trọng lượng phân tử đủ lớn, đủ tiêu chuẩn là một kháng nguyên đối với cơ thể khác.
Kháng thể kháng lại kháng thể được gọi là anti-lg.
- Phân biệt 3 nhóm kháng nguyên trên phân tử kháng thể:
+ Nhóm kháng nguyên isotyp: Các quyết định kháng nguyên isotyp giống nhau ở
mọi cá thể trong cùng một loài và nằm trên vùng hằng định của chuỗi nặng và chuỗi
nhẹ.Các lớp dưới kháng thể IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD và IgE có
các quyết định kháng nguyên isotyp khác nhau.
+ Nhóm kháng nguyên allotyp: Các quyết định kháng nguyên allotyp giống nhau
ở một số cá thể trong cùng một loài và nằm rải rác trên vùng hằng định của chuỗi nặng và

chuỗi nhẹ.
6
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
+ Nhóm kháng nguyên idiotyp: Các quyết định kháng nguyên idiotyp đặc trưng
cho từng cá thể và nằm trên vùng thay đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Mỗi quyết đinh
kháng idiotyp được gọi là idiotop, tập các idiotop gọi là idiotyp.
1.3.2. Chức năng của kháng thể
1.3.2.1. Chức năng do vùng hằng định Fc đảm nhiệm
- Cố định bổ thể: Phân tử kháng thể thuộc các lớp và dưới lớp IgM, IgG1, IgG2,
IgG3 sau khi kết hợp với kháng nguyên thì sự tương tác giữa các đoạn Fc của chúng làm
bộc lộ vị trí cố định bổ thể trên CH2, nhờ đó thành phần C1q của bổ thể đến bám vào,
dẫn đến hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển (xem phần Bổ thể).
- Truyền qua rau thai: Do đặc điểm cấu tạo của đoạn Fc của phân tử kháng thể
thuộc lớp IgG, nhất là dưới lớp IgG1, IgG3, IgG4, kháng thể có thể được truyền từ mẹ
qua thai nhi, tạo đáp ứng miễn dịch thụ động cho trẻ sơ sinh trong khoảng sáu tháng đầu
tiên.
- Gắn trên bề mặt tế bào: Các phân tử kháng thể thuộc các lớp và dưới lớp IgE,
IgG1, IgG3, IgG4 có khả năng gắn trên bề mặt các tế bào mast và bạch cầu ái kiềm thông
qua các receptor đối với đoạn Fc của chúng (FcR). Do vậy khi có kháng nguyên đến
kết hợp với kháng thể trên bề mặt các tế bào này thì sẽ dẫn tới hai quá trình: (1) quá trình
giải phóng các chất sinh học có sẵn trong các hạt của tế bào như histamin, serotonin; (2)
quá trình tổng hợp từ phospholipit màng tế bào tạo ra các chất như là PAF,
leucotrien, prostaglandin, thromboxan gây quá mẫn nhanh (xem chương Rối loạn miễn
dịch).
- Gây hiện tượng opsonin hóa (opsonisation): Các đại thực bào và bạch cầu đa
nhân trung tính có receptor đối với đoạn Fc của các kháng thể thuộc lớp IgG và IgM.
Khi các kháng thể này kết hợp với các kháng nguyên vi khuẩn, thì các đoạn Fc của
chúng thu hút các FcR của đại thực bào và bạch cầu đa nhân trung tính, làm cho những tế
bào thực bào này dễ tiếp cận vi khuẩn hơn.
Cũng theo cơ chế trên, các tế bào NK (natural killer: tế bào giết tự nhiên) nhờ có

FcR đối với đoạn Fc của lớp kháng thể IgG nên dễ tiếp cận và tiêu diệt tế bào đích hơn.
Hiện tượng này gọi là hiệu ứng ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity: độc tế
bào phụ thuộc kháng thể).
1.3.2.2. Chức năng do vùng thay đổi V đảm nhiệm
- Nhận diện kháng nguyên: Chức năng này đã được trình bày trong phần tính
kháng thể. Thông qua phản ứng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng mà kháng
nguyên (1) trung hòa kháng nguyên hòa tan như độ tố vi khuẩn; (2) ngưng kết thành các
thành phần hữu hình như vi khuẩn; (3) ngăn cản vi khuẩn bám vào màng nhầy niêm mạc
đường hô hấp và tiêu hóa (tác dụng của slgA).
- Truyền tín hiệu: Sự nhận diện kháng nguyên tạo tín hiệu cho lympho B tái phân
bố các kháng thể bề mặt mở đầu cho quá trình trình diện kháng nguyên của lympho B.
7
Hình 3: Vị trí các điểm chức năng trên phân tử IgG
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Mỗi chuỗi nhẹ có 2 gấp khúc và mỗi chuỗi nặng có 4 gấp khúc. Mỗi gấp khúc có
khoảng 60 axit amin. Edelman (1970) cho rằng chức năng vùng gấp khúc VH và VL là
hợp tác với nhau để tạo nên bề mặt của vị trí kết hợp với kháng nguyên. Các vùng gấp
khác làm nhiệm vụ trung gian cho các chức năng của kháng thể (gắn với bổ thể, gắn với
thụ thể của các tế bào thực bào). (3)
1.4. Kháng thể đơn dòng (2)
Trong tự nhiên, kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định (kháng nguyên đa giá),
do đó sẽ kích thích cơ thể tạo thành không phải một mà là một phức hợp kháng thể.
Muốn nhận một loại kháng thể trong phức hợp ấy thì phải tiến hành tách tinh khiết. Năm
1975 Milstein và Kohler đã tiến hành lai bằng con đường dung hợp tế bào ung thư tuỷ và
tế bào lympho B. Tế bào ung thư có khả năng phân chia nhanh nhưng không tạo thành
kháng thể, ngược lại tế bào B có khả năng hình thành kháng thể nhưng không có khả
năng phân chia vì chúng là tế bào tận cùng của quá trình biệt hoá.
Tế bào lai có được ưu điểm của cá hai tế bào trên: vừa phân chia rất nhanh vừa có
khả năng tổng hợp kháng thể.
Tiến hành pha loãng liên tục trong giếng của phiến nhựa vi lượng cho đến khi mỗi

giếng chỉ có một tế bào. Từ một tế bào đơn chỉ sản xuất một dòng kháng thể thuần khiết.
Do vậy kháng thể đơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào B sinh ra để chống lại một
quyết định kháng nguyên.
Kỹ thuật kháng thể đơn dòng đã được áp dụng rộng rãi để thay thế dần một số
phương pháp huyết thanh thông thường như xác định hocmon trong đánh giá chức năng
nội tiết, xác định protein chấn đoán ung thư, xác định nồng độ thuốc trong máu với độ
nhạy cao gấp nhiều lần so với các biện pháp thông thường. Có thể đưa thuốc đến tận mục
tiêu cần tiêu diệt như là tên lửa đạo đạn. Thuốc sẽ được phóng thích liên tục để diệt các tế
bào ung thư. Kỹ thuật đơn dòng cũng được dùng để xác địng doping trong thể thao.
2. Kháng nguyên
2.1. Định nghĩa (3)
Kháng nguyên (antigen) là tất cả các chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ
thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá
trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp những phân tử đặc biệt gọi là kháng thể
8
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
(dịch thể hay kháng thể tế bào) và chúng có đặc tính liên kết đặc hiệu với kháng nguyên
đó. Tóm lại, kháng nguyên là chất gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và phản ứng với
các sản phẩm của đáp ứng đó.
Bằng chứng độc nhất nói lên một chất đúng là một kháng nguyên khi chứng minh
được có đáp ứng miễn dịch chống lại nó.
9
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
2.2. Các đặc tính của kháng nguyên (1)
2.2.1.Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên
Tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên phụ thuộc vào các yếu tố sau :
2.2.1.1. Tính “lạ” của kháng nguyên
Một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch càng cao khi sự khác biệt giữa cơ thể
nhận va kháng nguyên càng nhiều hay nói cách khác kháng nguyên càng “lạ” với cơ thê
nhận bao nhiêu thi khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu.

Ví dụ: Albumin của gà hay chim có tính sinh miễn dịch cao hơn albumin bò khi cùng đưa
vào cơ thể loài dê.
Tuy nhiên cần lưu ý rằng các kháng nguyên protein của cơ thê này cũng có thể
kích thích một cơ thê khác cùng loài sản xuất kháng thể nếu kháng nguyên protein đủ lạ
đối với protein của cơ thể nhận. Hơn nữa trong một số trường hợp bệnh lý thì thành phần
của chính cơ thê cũng có thể gây ra đáp ứng tạo kháng thể chống lại nó, ngươi ta gọi
những thành phần này là “tự kháng nguyên”.
2.2.1.2. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên
Các kháng nguyên thuộc loại protein và polysaccarid có tính sinh miễn dịch cao
khi dùng dưới dạng hòa tan và cả khi chúng nằm trong một cấu trúc phức hợp, ví dụ vỏ vi
khuẩn.
Các kháng nguyên là lipid, steroid và axit nucleic có tính sinh miễn dịch yếu
hoặc không có tính sinh miễn dịch.
Kháng nguyên càng phức tạp về cả cấu tạo lẫn kích thước thì chúng càng có thể
kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh. Ví dụ: các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn,
virus ,các tế bào). Các phân tử protein lớn (hemoxyamin) cũng có tính kháng nguyên
mạnh.
Trên cấu trúc của kháng nguyên có những vị trí chịu trách nhiệm chính trong việc
kích thích tạo kháng thể và kết hợp với kháng thể khi xảy ra phản ứng kết hợp kháng
nguyên - kháng thể. Những vị trí này được gọi là những quyết định kháng nguyên
(determinant antigen) hay epitop. Kháng nguyên càng phức tạp càng có nhiều epitop, do
đó tính sinh miễn dịch càng cao.
Ngòai thành phần hóa học ra, cấu trúc lập thể và khả năng tích điện của các phân
tử kháng nguyên cũng có ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch. Có lẽ sự tích điện có vai trò
trong việc chọn lọc các tế bào lympho có thụ thể đặc hiệu tương ứng. Còn cấu trúc lập
thể có ảnh hưởng đến mức độ chuyên hóa của kháng nguyên trong cơ thể nhân (khi bị
chuyên hóa các kháng nguyên sẽ để lộ thêm các quyết định kháng nguyên).
2.2.1.3. Cách gây miễn dịch và liều kháng nguyên
Hầu hết các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn, hồng cầu, viris hoặc các polymer
lớn) khi đưa vao cơ thể nhận bằng đường tĩnh mạch hoặc tiêm bắp với liều khác nhau đều

có thể dễ dàng kích thích tạo kháng thể. Trong khi đó, nhiều kháng nguyên là protein
hòa tan phải có một quy trinh gây miễn dịch thích hợp hoặc phải cần một chất hỗ trợ mới
10
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
gây được đáp ứng tốt. Chất hỗ trợ đó được gọi là tá chất, loại thường được dùng là tá chất
Freund gồm hỗn dịch vi khuẩn lao chết trộn trong nước và dầu.
Một số nghiên cứu cho thấy tá chất có tác dụng làm tăng chức năng của đại thực
bào và tế bào lympho T hỗ trợ.
2.2.1.4. Khả năng đáp ứng của cơ thê
Đây là một yếu tố quan trọng : cùng một kháng nguyên nhưng các cơ thể khác
nhau có những đáp ứng ở nhiều mức độ khác nhau. Vì thế Landsteiner đã phân biệt hai
khái niệm: tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch, trong đó:
Tính sinh miễn dịch = Tính kháng nguyên + Khả năng đáp ứng của cơ thể nhận
2.3. Tính đặc hiệu của kháng nguyên
Tính đặc hiệu của một đáp ứng miễn dịch là do:
- Mỗi kháng nguyên có một cấu trúc đặc hiệu riêng.
- Khả năng nhận biết một cách đặc hiệu của các tế bào lympho do có thụ thể cho từng
loại kháng nguyên.
Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc của cả phân tử kháng
nguyên quyết định mà do những quyết định kháng nguyên (epitop ) quyết định.
Epitop có hai chức năng:
- Kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên đó.
- Làm vị trí để kháng thể hoặc tế bào lympho T mẫn cảm có thể gắn vào một cách đặc
hiệu.
Một kháng nguyên protein phức tạp có thể có nhiều quyết định kháng nguyên
khác nhau do đó mà nó có thể kích thích tạo ra nhiều loại kháng thể khác nhau cùng một
lúc. Tùy theo kháng nguyên có thể phản ứng cùng lúc với một hoặc nhiều kháng huyết
thanh chứa kháng thể do nó tạo ra mà người ta gọi là kháng nguyên đơn giá hay kháng
nguyên đa gía . (Trong các phản ứng huyết thanh học chỉ có các kháng nguyên đa giá mới
có khả năng tạo ra mạng lưới kết tủa hoặc ngưng kết với các kháng thể tương ứng ).

Phản ứng chéo (Cross - reaction): Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất cao tuy vậy
trong thực tế hai kháng nguyên khác nhau có thể có phản ứng chéo với nhau. Nguyên
nhân của phản ứng chéo là do trên hai kháng nguyên này có hai epitop giống nhau hoặc ít
nhất là tương tự nhau.
Phản ứng chéo dễ xảy ra với các kháng nguyên polysaccharid và cũng xảy ra với
các kháng nguyên protein (vi dụ: albumin trứng gà và albumin trứng vịt ).
Trong thừc nghiệm chúng ta có thể loại trừ phản ứng chéo bằng phương pháp hấp
thụ. Ví dụ: ta biết kháng huyết thanh kháng A thường cho phản ứng chéo với kháng
nguyên B nên khi làm phản ứng tìm kháng nguyên A thì kết quả dễ sai lạc do tìm nhầm
cả B. Như vậy trước khi tìm A ta cho ủ kháng huyết thanh kháng A với kháng nguyên B,
những phân tử nào cho phản ứng chéo sẽ tạo phức hợp vơi B. Sau đó loại bỏ phức hợp
này bằng ly tâm ta sẽ có kháng huyết thanh kháng A tinh khiết không còn phản ứng chéo
vơi B.
II. Tinh sạch ái lực miễn dịch
11
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
1. Mục đích (4)
Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và
sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia
tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu. Trên thực tế có nhiều
phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực
(Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch ( Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo
( Cross-linking).
Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng nguyên với kháng thể. ở
đây người ta dùng chất mang (Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để
kết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theo các protein khác tương tác
với protein nghiên cứu (kháng nguyên). Các protein kết tủa cùng sẽ được tách ra để
nghiên cứu (Harlow,E.,P.Whyte and S.J.Elledge.1993:Cell,75:805-816).
Mục đích của phương pháp tinh sạch ái lực miễn dịch:
- Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh

- Kiểm tra sự có mặt của KN
2. Tính chất yêu cầu của kháng thể
Kháng thể phải tinh khiết.
3. Các bước tiến hành (3)
3.1. Gắn kháng thể lên giá (5)
3.1.1. Sử dụng phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp
sắc ký ái lực (affinity Chromatography).
Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào
chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương
tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế
(inhibitor) cạnh tranh. Trong trường hợp hai chất kháng nguyên và kháng thể có ái lực
liên kết đặc hiệu với nhau, người ta thay thế vị trí chất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên
và kháng thể để nghiên cứu từng loại giống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu
của chúng. Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một
enzyme hoặc protein ta nghiên cứu. Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục
vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose.
* Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion
sephadex. Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này là
vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein
enzyme.
12
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO-
Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp,
chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác
thì chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách
thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme
khỏi cột ở trạng thái sạch.
3.1.2. Gắn kháng thể hoặc kháng nguyên lên giá bằng phương pháp Elisa (7)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme

ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong
mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu
như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các
sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên -
kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen chưa biết được gắn trên một bề mặt.
(2) Kháng thể - antibody biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được
gắn kết với enzyme.
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín
hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng thể -
kháng nguyên. Sự hiện diện của phức hợp kháng thể - kháng nguyên sẽ quyết định cường
độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như
lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên
chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm
(polystyrene microtiter plate).
- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một
kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng
nguyên có thể xảy ra.
Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm
biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng
kháng nguyên thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết
cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ
được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể
không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa"

13
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ
chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể -
kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay
các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của
ELISA.
3.1.3. Một số cách thực hiện gắn kháng thể hoặc kháng nguyên lên giá (7)
3.1.3.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:
- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa).
Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này
dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu
chưa biết.
- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên
chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.
- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin
huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn).
Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ
của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa.
Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với
protein của huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với
bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát
hiện KN đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh
quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất

kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh
tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich
ELISA hạn chế được nhược điểm này.
3.1.3.2. Sandwich ELISA:
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và
bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):
(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt.
(3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi
(5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán
14
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
(6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu
cho kháng thể sơ cấp ở bước 5)
(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.
(8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa
điện.
(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua đó xác
định sự có mặt và hàm lượng kháng thể.
3.1.3.3. ELISA cạnh tranh
(1) "Ủ" kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên.
(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên.
(3) Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng kháng nguyên
càng lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do
"cạnh tranh".
(4) Thêm kháng thể thứ cấp kháng thể của kháng thể ở bước 1). Kháng thể thứ cấp
gắn với enzym.
(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín
hiệu màu.

Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng
yếu.
Một số trường hợp, enzym được gắn với kháng nguyên chứ không phải kháng thể.
15
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
3.2. Phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể (3)
3.2.1. Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể
Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liên kết lý
hóa sau:
* Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander-Wals.
* Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ giữa nhóm amin và
nhóm carboxyl.
* Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau
* Lực kỵ nước
Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa
học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên và kháng
thể.
3.2.2. Phản ứng ngưng kết - Agglutination test
3.2.2.1. Nguyên lý
Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi khuẩn). Khi
găp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt
thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp.
Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu
với kháng nguyên tương ứng. Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể đặc
hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do
mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những
đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc
những cụm bông lơ lửng.
Các phản ứng ngưng kết thường đơn giản, dễ làm, có độ nhạy cao, không tốn kém,
được sử dụng rộng rãi, nhưng có nhược điểm là khó đạt trình độ chính xác cao, thường

hay cho phản ứng dương tính giả.
16
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
17
Hình 4: Phản ứng ngưng kết
A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một
xác vi khuẩn
B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi
khuẩn
C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
3.2.2.2. Các loại phản ứng ngưng kết
3.2.2.2.1. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Là phản ứng có tính chất định tính, thường sử dụng kháng nguyên đã biết và
nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh.
Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau đó nhỏ vào
một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, sau đó vài phút đọc kết quả, nếu trong huyết
thanh có kháng thể tương ứng, thì kết hợp kháng nguyên kháng thể tạo thành đám ngưng
kết, nếu kháng nguyên được nhuộm màu, thì đám ngưng kết có màu cụm lại, xung quanh
nhạt màu hơn.
3.2.2.2.2. Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm
Là phản ứng vừa có tính định tính vừa có thể định lượng được hàm lượng kháng
thể.
Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống cho vào một lượng không đổi huyết thanh có
độ pha loãng khác nhau theo cơ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16 ) hoặc theo cơ số 10 (1/10,
1/100, 1/1000, 1/10.000 ) sau đó cho vào mỗi ống nghiệm một lượng tương đương kháng
nguyên, để ở nhiệt độ thích hợp theo yêu cầu của phản ứng, sau 30 phút hoặc vài giờ đọc
kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết. Hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng cao nhất mà
ở đó vẫn xảy ra hiện tượng ngưng kết.
3.2.2.2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động

Khi dùng một kháng nguyên hòa tan để phát hiện một kháng thể tương ứng trong
phản ứng ngưng kết, phải cần đến tế bào mang, người ta thường dùng hồng cầu, hạt chất
dẻo như hạt latex, bentonit.
Nguyên lý: Làm cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên hữu hình,
bằng cách gắn kháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu đóng vai trò là giá đỡ cho
kháng nguyên, khi kháng nguyên đã gắn trên hồng cầu thì kháng nguyên đó trở thành
kháng nguyên hữu hình và phản ứng ngưng kết xảy ra dễ dàng.
Có nhiều phương pháp để gắn kháng nguyên hòa tan trên bề mặt hồng cầu. Có thể
xử lý bằng các hóa chất như a xít tanic, benzidin, các muối crom, glutaraldehyd các hóa
chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu và nhóm chức còn lại gắn với kháng
nguyên.
18
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Khi có phản ứng xảy ra, nghĩa là khi có kháng thể tương ứng với kháng nguyên,
thì các kháng thể sẽ nối các kháng nguyên lại và các kháng nguyên đã gắn với hồng cầu
hoặc đã hấp phụ vào các hạt chất dẻo, tạo nên sự ngưng kết nhìn thấy rõ ràng.
Hình 5: Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
3.2.3. Phản ứng kết tủa (Precipitation test)
Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong phản ứng
này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể tương ứng, cũng là chất
hòa tan trong huyết thanh.
Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra, sự kết
tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được.
Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH, các ion môi
trường điện giải
3.2.3.1. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng
3.2.3.1.1. Phản ứng kết tủa vòng
Là phản ứng có tính chất định tính.
Dùng ống nghiệm loại nhỏ, cho kháng nguyên hòa tan vào trước, sau đó dùng
pipet đã hút huyết thanh có kháng thể tương ứng, để đầu mút pipet vào sát đáy ống

nghiệm rồi nhỏ từ từ cho kháng thể vào, với một lượng tương đương, kháng thể sẽ đội
kháng nguyên lên (vì là kháng nguyên hòa tan nên nhẹ hơn kháng thể).
Để yên trong vòng 15-20 phút sẽ thấy xuất hiện vòng kết tủa màu trắng ở chỗ tiếp
xúc giữa lớp kháng nguyên và kháng thể, nếu kháng nguyên và kháng thể tương ứng
(hình 6a).
19
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Người ta thường dùng kháng thể dịch thể chuẩn đã biết để chẩn đoán kháng
nguyên chưa biết với điều kiện kháng nguyên đó phải được chiết xuất thành dung dịch
hòa tan.
Phản ứng kết tủa vòng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán, gọi
là phản ứng kết tủa của Ascoli (hình 6b).
20
Hình 6b. Phương pháp làm phản ứng Ascoli
Hình 6a. Phản ứng kết tủa vòng
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
3.2.3.1.2. Phản ứng kết tủa trong ống nghiệm
Là phản ứng vừa có tính định tính, vừa có tính định lượng.
Dùng một loạt ống nghiệm, cho huyết thanh đều vào các ống nghiệm đó, sau đó
cho kháng nguyên vào với lượng từ ít đến nhiều.
Kết quả sẽ thấy có kết tủa xảy ra càng rõ tại những ống có kháng nguyên vừa đủ
với kháng thể, còn ở những ống có thừa kháng nguyên thì kết tủa không xảy ra.
3.2.3.1.3. Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc
Cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau trong môi trường thạch và quan sát
đường kết tủa.
Hình 7: Miễn dịch khuếch tán
đơn (A) và miễn dịch khuếch tán
kép (B) trong ống nghiệm
Nguyên lý: Lợi dụng tính chất khuếch tán của chúng về phía nhau, rồi gặp nhau,
kết hợp với nhau bão hòa và kết tủa ở vùng có tỷ lệ tương ứng đồng đều giữa kháng

nguyên và kháng thể.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch ống nghiệm (Kỹ thuật Oudin):
Có thể chia làm hai loại: Phản ứng kết tủa khuếch tán đơn và kép.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn.
Thạch đã trộn sẵn kháng thể (hoặc kháng nguyên) rồi cho vào trong ống nghiệm
trước, sau đó cho lên mặt thạch một lượng dung dịch kháng nguyên (hoặc kháng thể).
Kháng nguyên (hoặc kháng thể) sẽ khuếch tán vào trong thạch đi xuống phía dưới
và sẽ gặp kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã có trong đó kết hợp, bão hòa, và kết tủa
thành đường màu trắng.
21
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Nếu dùng nhiều đôi kháng nguyên và kháng thể khác nhau trong cùng một ống
nghiệm để chẩn đoán thì sẽ xuất hiện nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác
nhau theo từng cặp kháng nguyên-kháng thể tương ứng.
3.2.3.1.4. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép
Cho kháng thể vào trước, rồi cho vào trên kháng thể một lớp thạch bình thường:
(không chứa kháng nguyên, kháng thể). Sau đó cho lên mặt thạch dung dịch kháng
nguyên hòa tan (hoặc là ngược lại).
Kháng nguyên bên trên sẽ khuyêch tán xuống dưới và đi vào trong thạch, và
kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên cũng đi vào trong thạch, gặp nhau ở một nơi nào
đó, kết hợp bão hòa và kết tủa.
Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch trên phiến kính hoặc trên đĩa petri, khi
thạch đông đặc, đục các lỗ tròn nhỏ có kích thước và khoảng cách bằng nhau, tthường
đục một cụm 6 lỗ, 1 lỗ trung tâm và 5 lỗ xung quanh.
Nhỏ vào lỗ trung tâm kháng nguyên hoặc kháng thể chuẩn đã biết, còn các lỗ xung
quanh nhỏ kháng thể hoặc kháng nguyên cần chẩn đoán, chúng sẽ khuếch tán về phía
nhau và xuất hiện vạch kết tủa, nếu kháng nguyên và kháng thể tương ứng.
Hình 8: Định hiệu giá kháng nguyên, kháng thể
22
I. Định loại kháng nguyên

1 - Kháng thể đã biết
2, 3, 4, 5 - kháng nguyên chưa biết
6 - kháng nguyên tương ứng
Phản ứng dương tính
II. Định loại kháng thể
1- Kháng nguyên đã biết
2, 3, 4, 5 - kháng thể chưa biết
6 - kháng thể tương ứng
Phản ứng âm tính
I. Định hiệu giá huyết thanh
1 - Kháng nguyên
2, 3, 4, 5, 6 - Kháng thể pha loãng
lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32
II. Định hiệu giá kháng nguyên
1 - Kháng thể
2, 3, 4, 5, 6 - Kháng thể pha loãng
lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Hình 8: Thí nghiệm định loại kháng nguyên, kháng thể
Hình 9: Định loại kháng nguyên, kháng thể
Hình 10: Phản ứng kết tủa khuyếch tán làm
trên đĩa lồng
(Theo Ian R.
Tizard. 2004)
23
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
Hình 11: Hiện tượng hai kháng nguyên: Không đồng nhất (A); đồng nhất (B); đồng nhất
một phần (C) phát hiện bằng phản ứng Ouchterlony
Nhận định kết quả được căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp sau:
Các lỗ chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các

đường kết tủa sẽ gặp nhau và nối liền nhau.
Nếu hai lỗ chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác của
kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức là các kháng nguyên không có
liên quan với nhau.
Nếu 2 lỗ chứa kháng nguyên có liên quan một phần cùng có chung một nhóm
quyết định X (KN XY và KNXZ) phản ứng với một hỗn hợp kháng thể chống XY, sẽ tạo
ra 2 đường kết tủa gặp nhau, nhưng một đường dài và một đường ngắn hơn (giống hình
cựa gà).
3.2.3.1.5. Phương pháp điện di miễn dịch (Electrophoresis)
Là phương pháp cải tiến của phương pháp kết tủa khuếch tán trong thạch nhưng sử
dụng điện trường để cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau, phương pháp này thực
hiện qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1, tách rời từng thành phần kháng nguyên trước bằng
điện di. Giai đoạn 2, miễn dịch khuếch tán, đặt huyết thanh có chứa kháng thể vào rãnh
dọc theo trục đi, kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán để gặp nhau và kết tủa.
3.3. Tách kháng nguyên ra khỏi kháng thể (6)
Kháng thể trích ra từ huyết thanh, huyết tương của động vật hữu nhũ hoặc từ bề
mặt cấu trúc tế bào hybridoma thường bị lẫn với các protein khác. Bằng cách bổ sung
muối ammonium sulfate ( Al
2
(SO
4
)
3
) hoặc sodium sulfate ( Na
2
SO
4
) với hàm lượng
thích hợp sẽ kết tủa được IgG. Nhiều phương pháp hóa học thích hợp để giải quyết vấn
đề này, ví dụ như phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch với cột ái lực miễn dịch kết hợp

với đánh dấu phóng xạ, enzyme hoặc biotin để lôi kéo các protein. Các IgG tinh khiết rất
bền vững, được bảo quản lâu dài và có thể phân phối, chuyển đổi giữa các phòng thí
nghiệm. Trong phương pháp này, Al
2
(SO
4
)
3
được sử dụng phổ biến hơn.
Đối với kháng nguyên cũng là một glycoprotein nên có thể áp dụng phương pháp
này để tách kháng nguyên ra khỏi kháng thể.
3.3.1. Trường hợp sử dụng Al
2
(SO
4
)
3
3.3.1.1. Nguyên liệu
- Hòa tan, bổ sung thêm một lượng dư (NH
4
)
2
SO
4
vào nước cất (khoảng 950g
trong 1lit) và tiến hành khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng, làm lạnh xuống 4
0
C, sau đó kết
hợp với các tinh thể muối và dự trữ ở 4
0

C.
- Dung dịch đệm PBS ( phosphate – buffered saline ) gồm 0,14M NaCl, 2,7 mM
KCl, 1,5 mM KH
2
PO
4
, 8,1 Mm Na
2
HPO
4
, được bảo quản ở 4
0
C.
3.3.1.2. Phương pháp tiến hành
24
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION
- Chuẩn bị trước Al
2
(SO
4
)
3
bão hòa ít nhất 24h trước khi hòa tan để chưng cất, sau
đó dự trữ ở 4
0
C.
- Ly tâm 10000g
av
huyết thanh hoặc huyết tương ở 4
0

C từ 20 – 30 phút.
- Làm lạnh dịch huyết thanh hoặc huyết tương ở 4
0
C và khuấy chậm. Bổ sung với
nồng độ cuối cùng từ 35 – 45 % và tiến hành khuấy đảo ở 4
0
C trong 1 – 4h. (Pha 2,7g
Al
2
(SO
4
)
3
vào 10ml nước sẽ được dung dịch bão hòa 45%).
- Ly tâm 2000-4000g
av
trong 15 – 20 phút ở 4
0
C. Gạn bỏ chất nổi trên bề mặt và
tháo lấy các pellet (viên tròn nhỏ), cẩn thận trút ngược xuống một mảnh giấy lụa.
- Hòa tan 10 – 20 % chất kết tủa ở thể tích ban đầu trong dung dịch đệm PBS hoặc
chất nền khác., dùng que khuấy trộn hỗn hợp và sau đó cho vào ống pipet Pasteur. Khi
hệ đã phân tán hoàn toàn, bổ sung thêm 25 – 50 % dung dịch đệm PBS và tiến hành thẩm
tách. Chất kết tủa sẽ được thu nhận và dự trữ ở 4 – 20
0
C nếu không có nhu cầu dùng
ngay.
3.3.2. Trường hợp sử dụng Na
2
SO

4
3.3.2.1. Nguyên liệu
Yêu cầu là Na
2
SO
4
phải ở dạng tinh thể.
3.3.2.2. Phương pháp tiến hành
- Ly tâm dịch huyết thanh 10000g
av
trong 10 – 20 phút, gạn lọc lấy các pellet, làm
ấm ở 25
0
C và tiến hành khuấy.
- Bổ sung Na
2
SO
4
rắn với tỉ lệ 1,8g/10ml khuấy đảo ở 25
0
C, trong 30 phút, 1h.
- Ly tâm 2000-4000g
av
trong 30 phút ở 25
0
C.
- Gạn bỏ các chất nổi bề mặt, tháo lấy các pellet, sau đó tái hòa tan trong PBS 25 –
50 % so với thể tích ban đầu.
3.4. Điều kiện ảnh hưởng
 Thời gian ly tâm

 Tốc độ ly tâm
 Nhiệt độ ly tâm
 Môi trường dung dịch đệm
 Chất khởi đầu phản ứng kết tủa
3.5. Chú ý trong quá trình thực hiện (6)
♦ Nếu có hàm lượng lipid dư nhiều trong dịch đem tách IgG, thì ta phải ly tâm 20
phút, 2000g
av
trước khi bổ sung muối Na
2
SO
4
hoặc Al
2
(SO
4
)
3
.
♦ Nếu sử dụng Al
2
(SO
4
)
3
35% sẽ kết tủa được IgG tinh khiết nhưng không kết tủa
hết hoàn toàn IgG hiện diện trong huyết thanh, nếu sử dụng Al
2
(SO
4

)
3
45% sẽ kết tủa
hoàn toàn IgG nhưng sẽ làm nhiễm bẩn một số protein khác, chẳng hạn như albumin.
Nếu sử dụng (NH
4
)
2
SO
4
có thể sẽ cải thiện được hơn bằng cách lập lại các quá
trình kết tủa, nhưng có thể gây ra một vài biến tính. Thực hiện kết tủa với (NH
4
)
2
SO
4
45% là nồng độ lý tưởng để làm chất bắt đầu cho các phương pháp tinh sạch khác như:
trao đổi ion, sắc ký ái lực, và tinh sạch FPLC.
25