Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất

1

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công
tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện
cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.
Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của q trình trao đổi chất của
một số loài nấm mà chủ yếu là lồi Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong
đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ở mức vi
lượng.
Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis,
rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất
giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó,
hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn.
Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin
nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con.
Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì
aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong mơi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy,
việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong
thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết.
Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch,
cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc
kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều
thao tác, tăng thất thoát trong các cơng đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực
miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh
sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên
và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác khơng có được; quy
trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu
cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích.
Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng

khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều so
với các aflatoxin khác.


2

Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài
Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho
hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1.
Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính,
cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật ni, hơn nữa cấu trúc hố học lại khá
tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên
cứu.
Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS.
TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tơi
tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do
Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”.
1.2 Mục đích
Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch.
1.3 Yêu cầu
Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch trong việc bắt aflatoxin G1:
• Độ nhạy của cột
• Độ lặp lại của cột

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cương về aflatoxin


3

2.1.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi
mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận mà nguyên nhân
không được biết rõ. Do đó, người ta gọi là bệnh “X” của gà tây.
Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò
ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đã nhanh chóng
tìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họ
cũng thấy rằng bệnh này khơng những xảy ra đối với gia cầm mà cịn với cả gia súc,
đặc biệt là heo, bê, cừu…
Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan,
các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên các
hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm nấm
Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất
bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus và toxin có nghĩa
là chất độc).
Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con đường
polyketide của một số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50%
chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4], Aspergillus
nomius; ngoài ra cịn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai trò gây bệnh
trong thực tế. Ở A. flavus và A. parasiticus, con đường sinh tổng hợp aflatoxin liên
quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa bởi 25 gen tập trung thành nhóm
trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19].

(1)
(2)
Hình 2.1: A. flavus (1) [20] và A. parasiticus (2) [21].


4

Việc khám phá ra aflatoxin đã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập
trung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ của
con người và động vật.
2.1.2 Phân loại
Có thể nói Sargeant (1962) là người có cơng xác định các độc tố này. Chúng
là các chất có cấu trúc hố học rất gần nhau và có khung hố học giống với dẫn xuất
của cumarin nên gọi là flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, 2
nhân furan và 1 vòng lacton [11].
Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4].
Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1, AFB2,
AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV: B: Blue;
G: Green). Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có 1 nhóm
chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton.
O
O
F
O

L

P

C
O
AFB1

O

O

OMe

O
F
O

O
O

L

C
O
AFG1

OMe

F: Vịng furan
C: Vịng cumarin
L: Vịng lactone
P: Vịng pentenone

Hình 2.2: Cấu trúc hố học của AFB1 và AFG1.
Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm và
trong cơ thể động vật.
 AFB2 và AFG2 là dẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1.
 AFB2a và AFG2a là dẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1.
 AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa,
thận và gan động vật.
 Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol),

dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1, AFQ1…


5
O

O

O

O

O

O

O

OMe

O

OMe

AFG2
O

O

O

O

O

OMe

AFB2a

O

O
O

O

O

OH

O

O

AFB2

HO

O

O

HO

O
OH

OMe

OMe

AFG2a

O

O

O

O

O

O

AFM1

O

O

O

OMe
AFM2

Hình 2.3 : Cấu trúc hố học của các aflatoxin.

2.1.3 Tính chất hóa lí
Aflatoxin dễ bị huỷ bởi những chất kiềm, nhưng tương đối bền với nhiệt. Ở
nhiệt độ cao hơn 100oC chỉ khử được phần nào aflatoxin.
Aflatoxin ít tan trong nước, tan trong các dung môi phân cực như:
chloroform, acetonitril, aceton, methanol…
Aflatoxin khơng tan trong những dung mơi hịa tan chất béo như n-hexan,
ether ethylic, ether dầu hoả…
Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng bước sóng 440 nm
khi kích thích bởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10].
Các đặc tính lí hóa được trình bày trong phụ lục 1.
2.1.4 Tác động sinh học
Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con
người. Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa
tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm
lượng chất độc ăn phải.


6

Hấp thu qua đường tiêu hoá là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1 vào
cơ thể với 3 kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan trong lipid và vận
chuyển nhờ protein mang. Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ

liên kết với các tế bào máu hoặc protein huyết tương (90% ở dạng liên kết với
albumin). Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở
gan [11]. Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp:
O

O

DNA adducts

O H

O

OH

O

O
O
O
AFB1-8,9-epoxide
O

O

O

O

O

O
AFB1-dhd

OMe
O

Protein adducts

O

O

O

O

O

O

O

OMe
O

OH

OMe

O

AFB1

O

O

HO

O
Aflatoxicol

O

HO
HO

O

OMe

O

CH3

O
AFP1

O

O

O

GLUCURONIDE
Conjugates

O

O
OH

OMe

O

O
AFM1

AFB2a

OMe

O

O

OMe

AFQ1

Milk

Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hố cuả AFB1 [13].

Các chất chuyển hóa được cơ thể cố gắng bài thải, như: AFM1 và AFM2 qua
sữa; AFP1 và AFQ1 qua nước tiểu.
Đáng kể, dưới xúc tác của hệ enzyme monooxygenase trong cytochrome P450
(CYP 450) rất phong phú ở tế bào gan, chất tạo thành là AFB1-8,9-epoxide được coi
như chất biến dưỡng có hoạt tính rất cao, có thể gắn với các đaị phân tử (DNA, RNA và
protein) làm rối loạn hoạt động bình thường của tế bào (Swenson, 1975).


7

2.1.4.1 Độc tính cấp của aflatoxin
Nhiễm độc cấp tính khi ăn phải một lượng lớn aflatoxin. Thú non mẫn
cảm hơn thú trưởng thành, gia cầm mẫn cảm hơn gia súc, được biểu hiện theo thứ tự
sau:
Vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà > chó > heo > bị > ngựa > cừu
(Allcroft, 1962) [11].
Tính gây độc cấp thể hiện qua liều gây chết 50% (LD50).
Bảng 2.1: LD50 của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật
(Ciegler, 1975) [2]
Loài động vật

LD50

(Xếp theo thứ tự

(mg/ kg thể trọng)

mẫn cảm)
Vịt con
Heo
Cá hồi
Chó
Chuột lang
Cừu
Khỉ
Chuột cống
Gà
Chuột bạch

0,3-0,6
0,6
0,8
1,0
1,4-2,0
2,0
2,2
5,5-17,9
6,3
9,0

Theo bảng trên và bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD50 trên
động vật (xem phụ lục 2), có thể thấy aflatoxin thuộc nhóm độc tố cực độc. Triệu chứng
nhiễm độc thể hiện qua sự tổn thương ở gan và triệu chứng thần kinh như nằm liệt và co
giật. Chết có thể xảy ra đột ngột sau một thời gian ngắn, thường dưới 72 giờ. Giải phẫu
bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu ở phổi

[11]. Nguyên nhân gây chết là do gan bị huỷ hoại rất nhanh (necrosis) theo cơ chế phân
tử:


8
O

O

O

O

O
enzyme

O

O

OMe

HO

Gan
HO

AFB1

O

O
AFB1-dhd
acid

R2

N C=O
O
H OH
H
H O
R1 C N C
H
R3
CH N

R4

N C=O
H

O

O

O
O

Shiff's base

OMe

base (pH=7,4)

O
H OH
O C
H O

protein

C
H

OMe

O

CH
O

OMe

Di-aldehyd resonance hybrid

Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5]

Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo
thành kiềm Shiff (Shiff’s base). Các kiềm Shiff có thể ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA
dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động ở gan bị rối loạn tạo nên tình

trạng nhiễm độc cấp tính.
Như vậy, AFG1 cũng có thể tạo thành kiềm Shiff do cũng mang liên
kết đơi ở vị trí 8,9 ở đầu cùng trên vòng furan. Liên kết này được bão hoà trong cấu trúc
của AFB2 và AFG2, do đó, khơng thể trực tiếp tạo thành kiềm Shiff nên mang tính độc
ít hơn so với AFB1 và AFG1[5].
2.1.4.2 Độc tính mãn
Thường xảy ra nhiều hơn so với nhiễm độc cấp tính và có tác động dài
hơn do cơ thể có thể chịu đựng được một mức nào đó trong khẩu phần.
Khi có sự nhiễm độc mãn tính, các triệu chứng thấy được là kém ăn và
chậm lớn; gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết. Khi kiểm tra vi thể
thì xuất hiện sự thối hố tế bào biểu mơ, thối hố mỡ gan, tế bào lympho bị thâm
nhiễm. Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan. Nếu nhiễm aflatoxin trong thời
kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2]. Năm
1988, IARC đã xếp AFB1 vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, đặc
biệt là ung thư gan [22]. Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin trong 89 ngày sẽ thấy xuất hiện


9

ung thư gan sau một năm. Tại Việt Nam đã có cơng trình nghiên cứu tìm aflatoxin trong
dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát đều có hàm lượng từ 1,1 – 3,5 ppb [13].
Cơ chế phân tử của nhiễm độc mãn tính:
OMe
O

O

O
O

DNA
O
O

O

OMe

AFB1-8,9-exo epoxide

O

O

OH
O

OH

O3PO

+
N

HN
H2N

O

O

O

AFB1-N7-Gua

AP Site

N

N

OMe

O
-

O3PO

OPO3

O

OPO3

AFB1-N7-Gua
DNA Adduct

O

O

O

O

H2N
AFB1-FAPY
DNA Adduct

OH
N

HN

H
N

N

O

CHO

O
-

O3PO

OPO3

Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001) [14].

AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA ở vị trí N7 của một
guanine. Do cầu nối glycoside mất ổn định, nhóm purine có thể bị tách khỏi DNA. Hoặc
khả năng khác là vòng imidazole trong cấu trúc purine bị mở ra thành cấu trúc
formamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định và tồn tại trong điều kiện sinh học. Các
điểm đột biến do AFB1 thường nhận thấy là sự đảo chuyển GC TA (dị hốn). Điểm
nóng của đột biến đã được phát hiện là ở vị trí thứ ba trong đơn vị mã (codon) 249 của
gen p53. Gen này mã hố cho một phosphoprotein có hoạt tính tăng cường hoặc kiềm
chế phiên mã của một số gen có chức năng kiểm sốt chu trình nhân lên của tế bào, để
ngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, có thể dẫn đến hình thành u. Khi
cấu trúc DNA bị biến đổi, tế bào phản ứng lại bằng cách thể hiện nhiều phosphoprotein
p53 để ức chế sự sao chép của DNA bị biến đổi. Nếu thời gian sửa chữa lại DNA kịp


10

thời (do một số enzyme) trước khi DNA biến đổi được sao chép, bảo tồn di truyền được
ổn định. Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếp đều làm tăng mức
protein p53 tế bào. Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53 bị biến đổi, mất
hoạt tính, hậu quả là tế bào tăng trưởng khơng kiểm sốt dẫn đến hình thành khối u
(Bennett và Klich, 2003) [14]. Liên quan giữa nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV), ung thư
tế bào gan và vai trò của p53 cũng đã được khảo sát và nghiên cứu nhiều. Với bệnh
nhân trong nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gan cao hơn 3 lần so
với trường hợp âm tính. Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặt HbsAg trong huyết
thanh, tỉ lệ này là 6 lần cao hơn bệnh nhân âm tính HbsAg. Và nếu xuất hiện cả AFB1N7-Gua và HbsAg, tỉ lệ này cao gấp 60 lần [14].
2.1.5 Sự hiện diện của aflatoxin trong thực phẩm
Theo tài liệu của FAO, khơng có thực phẩm nào được xem như an toàn tuyệt
đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn từ lúc
cây trồng cịn ở ngồi đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận chuyển. Và

theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên thế giới bị nhiễm độc tố vi
nấm [4]. Hầu hết các số liệu liên quan cho thấy sự nhiễm aflatoxin thường xảy ra nhất ở
đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạt khác như gạo, lúa mì, đậu
nành, hạt bông vải… Theo Carlos A. Muro-Cacho (2004), sự tiêu thụ aflatoxin của con
người từ 0 – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200 ng/kg/ngày [15].
Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho sự phát triển vi nấm
và sản sinh độc tố trong thực phẩm, nhất là aflatoxin. Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm
được đặt ra nhằm hạn chế những thiệt hại về kinh tế (gây chết đàn vịt, gà, lợn…) cũng
như bảo đảm an tồn thực phẩm cho người, vì những dạng chuyển hóa của aflatoxin cịn
độc tính vẫn có thể hiện diện trong gan, sữa, trứng, là những thức ăn hằng ngày của
người.
2.1.6 Giới hạn về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc
Aflatoxin hiện diện trong thực phẩm như là một sự nhiễm bẩn tự nhiên nên
con người khơng thể kiểm sốt để ngăn chặn chúng. Dựa vào nhiều yếu tố như: số liệu
giám sát, sự phân bố aflatoxin trong thực phẩm, dữ liệu về độc chất học, phương pháp
phân tích và tiêu chuẩn cho phép của các quốc gia có quan hệ mua bán với nhau mà
từng quốc gia, từng khu vực trên thế giới ra các quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin
tổng cộng tối đa cho phép trong các loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau.


11

Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14]
Loaị thực phẩm
Sữa nước
Sữa bột
Sữa nước
Sữa bột
Dầu ăn và các chất béo
Thực phẩm

Thực phẩm

Đối tượng sử dụng
Trẻ em < 3 tuổi
Trẻ em < 3 tuổi
Thông dụng
Thông dụng
Trẻ em và thiếu niên
Các loaị

Giới hạn (ppb)
0,03
0,3
0,05
0,5
5
1
10

Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm
hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm ban
hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT.
Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam
STT
1
2
3

Tên độc tố vi nấm
Aflatoxin tổng số hoặc B1

Aflatoxin M1
Các độc tố vi nấm khác

Sản phẩm

Giới hạn nhiễm tối

Thức ăn
Sữa
Thức ăn

đa cho phép (ppm)
10
0.5
35

Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm.
Loại vật nuôi
AFB1 (ppb) AFT tổng (ppb)
≤ 20
≤ 30
Gà con từ 1-28 ngày tuổi
≤ 30
≤ 50
Nhóm gà cịn lại
≤ 10
Vịt con từ 1-28 ngày tuổi
Khơng có
≤ 10
≤ 20

Nhóm vịt cịn lại
≤ 10
≤ 30
Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tuổi
≤ 100
≤ 200
Nhóm lợn cịn lại
≤ 20
≤ 50
Bị ni lấy sữa
(Ban hành theo quyết định số 104/2001 QD-BNN của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn ngày 31-10-2001).
2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin

2.2.1 Phương pháp sinh vật học
Phương pháp này đã được sử dụng đầu tiên, chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm
của một số loài sinh vật được thử nghiệm với aflatoxin. Đây là phương pháp định tính
hay bán định lượng, không chuyên biệt đối với từng độc tố nhưng đơn giản và dễ thực
hiện.


12

Thử nghiệm độc tính trên phơi gà (Chicken Embryo Bioassay): Chiết mẫu
bằng chloroform cơ đặc có nồng độ khoảng 200-300 ng/ml, sau đó tiêm vào buồng khí
hoặc lịng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tính và ấp trong 5 ngày, phơi gà sẽ chết
trong vịng 2 ngày nếu có aflatoxin. Thử nghiệm này đã được đưa vào tiêu chuẩn AOAC
[10].
Ngồi ra, độc tính của aflatoxin cịn được thử nghiệm trên vịt con mới sinh,
ấu trùng của loài giáp xác, tế bào động thực vật nuôi cấy, trên vi khuẩn Bacillus

megaterium, trên cá hồi…[10]
2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lí
Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính
xác và có tính chun biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùng
chủ yếu trong các phịng thí nghiệm.
Các giai đoạn cơ bản:
Lấy mẫu

Chiết aflatoxin

Tinh chế aflatoxin

Cô đặc mẫu

Phát hiện và định lượng aflatoxin

2.2.2.1Lấy mẫu
Mục đích: Lấy mẫu đại diện cho lơ hàng hay đối tượng khảo sát.
Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần
phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác
nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích
hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào
loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu.
2.2.2.2 Chiết aflatoxin


13

Mục đích: Tách aflatoxin cần tìm từ khối mẫu gồm nhiều chất
phức tạp.

Sự lựa chọn dung môi cho việc chiết mẫu tuỳ thuộc vào tính chất
hóa học của aflatoxin cũng như tính chất của các thành phần khác.
Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung
môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo
trước khi tiến hành chiết aflatoxin.
Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân
cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với
các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform,
hay methanol. Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môi với một lượng
nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất. Trong khi độ hồ tan của aflatoxin trong
nước thấp, dung mơi có nước có thể thấm vào các mơ ưa nước làm cho sự chiết tách
hữu hiệu hơn.
Q trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phịng bằng cách lắc
thơng thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút.
Một số phương pháp chiết:
•

Chiết bằng dung mơi chloroform-Phương pháp EEC
(European Economic Community)

• Chiết bằng dung mơi methanol
- Phương pháp BF (Best Food)
- Phương pháp VICAM

2.2.2.3Làm sạch mẫu
Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng
aflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũng như
việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột.
Các kĩ thuật làm sạch


Tủa các tạp chất không mong muốn: thường dùng để làm
sạch các dịch chiết có nguồn gốc thực vật. Các hoạt chất


14

dùng là các muối kim loại nặng, ví dụ Pb(CH3 COO)2,
AgNO3, Zn(CH3 COO)2, CuCO3…


Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu
chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone
hay methanol) vào dung mơi khác (ví dụ như chloroform).



Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được
phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu
quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột
chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo
sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các
aflatoxin ở hàm lượng thấp. Thể tích đưa vào cột rất ít
(1-3ml), khả năng loại tạp rất cao, thích hợp cho phân tích
bằng HPLC [12]. Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất
không phân cực như: C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl,
florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ
chế kỵ nước khơng có tính chọn lọc, phân giải kém trong
nhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ
lệ nhỏ so với tạp chất [14].

2.2.2.4 Cô đặc mẫu

Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách
cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi
chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Cặn được hịa tan vào một lượng thể tích nhỏ
trước khi qua giai đọan xác định.
2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng

Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc
phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua
lớp sắc kí. Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do
các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng.

Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin.


Phương
pháp sắc

Nguyên tắc

Ưu điểm

Nhược điểm

15

(Minicolumn) Sắc kí cột nhỏ

kí
Cột thủy tinh hay PE có Ø= 5-6 -

tốn ít thời gian: -

là phương pháp bán

mm, dài khoảng 20 cm được nhồi các

15-30 phút.

định

lớp chất có tính hấp phụ độc tố: -

khơng cần thiết bị

nhằm đánh giá sơ bộ.

alumina, silicagel và florisil. Calcium

phức tạp, đắt tiền.

sunphate có tính giữ nước được nhồi

-

nhanh

kém nhạy, mức phát

Cho mẫu chiết vào cột, chảy qua

có thể dùng tiện

hiện khá cao: 20 ppb.

lợi

ở hai phía đầu.
cột nhờ trọng lực. Lớp chất hấp phụ

-

lượng

Không phân biệt các

trên

hiện -

trường
-

AFT khác nhau.

thích hợp ở các

sẽ giữ AFT lại và ta phát hiện được

nước đang phát

khi cho cột chiếu dưới đèn UV λ=

triển

365 nm, có vết huỳnh quang màu
xanh tím ở lớp florisil. So sánh với
một cột chuẩn chứa lượng AFT đã

(TLC) Sắc kí lớp mỏng

biết, ta có thể đánh giá mẫu chứa AFT
ít hay nhiều hơn so với chuẩn.
Pha tĩnh là một lớp mỏng chất có
tương

được phết lên một bản mỏng (nhôm

giản

lượng.

thường sử dụng -

kết quả phụ thuộc vào

nhất ở các nước

người phân tích.

cần khảo sát được cho chạy qua lớp

đang phát triển và -

độ chính xác khơng

mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản.

trong các phòng

cao do lệ thuộc vào

thí nghiệm.

mắt

mỏng thành các đốm với thể tích -

khá rẻ tiền so với

Densitometer cho độ

thường là 2, 5, 10 µl; đốm chuẩn cũng

HPLC.

chính xác cao hơn

được nhỏ lên cùng bản mỏng. Sau đó, -

Độ nhạy khá cao:

nhưng khơng thơng

bản mỏng được cho vào dung mơi

0,5-5 ppb.

dụng cho các phịng

khai triển để các đơn chất trong hỗn -

kĩ thuật TLC 2

thí

hợp có thể tách rời nhau khi di

chiều cho kết quả

phương.

chuyển bằng lực mao quản.

(TLC

tính hấp phụ, thường là silicagel, -

rất tốt và mức -

sai số khoảng 30%.

hoặc nhựa).

-

Pha động là dung môi chứa chất

Dịch chiết được chấm lên bản

đối

đơn -

Việc phát hiện và định lượng tiến

nghiệm

đọc.

địa

thấp, có thể so

máy densitometer hay mắt để so sánh

người

phát hiện cũng

hành dưới tia UV có λ= 365nm. Dùng

mang tính bán định

sánh với HPLC.

cường độ sáng của các đốm mẫu và
đốm chuẩn, từ đó suy ra nồng độ

Sắc kí lỏng cao áp

aflatoxin trong mẫu.

Vì AFT có độ phân cực thấp nên thích -

tự

hợp cho HPLC pha đảo. Cột sắc kí

nhiều thao tác.

pha tĩnh có độ phân cực thấp sẽ có ái
lực lớn với AFT, sẽ giữ hết AFT trên

-

động

hóa -

thiết bị đắt tiền.
tốn thời gian

khả năng phân -

dung môi, hợp chất

giải và phát hiện

chlor gây ô nhiễm


16

2.2.3 Phương pháp miễn dịch học
Phương pháp này dựa trên nguyên lí kết hợp đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể. Vì aflatoxin là một phân tử nhỏ (hapten) nên nhiều phương pháp
miễn dịch học thông thường (chẳng hạn “ELISA kẹp” (sandwich ELISA)) tỏ ra không
hiệu quả.
Để phát hiện aflatoxin, một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện
nay là phương pháp ELISA cạnh tranh (competitive ELISA), hoạt động theo quy tắc:
AFT cần xác định cạnh tranh với một lượng cố định (AFT – enzyme) để liên kết đặc
hiệu vào kháng thể đã được gắn trên pha rắn (polystyrene). Sau đó, các AFT - enzyme
bị giữ lại được xác định bằng cách thêm vào một cơ chất có tính đổi màu khi phản ứng
với enzyme. Cường độ màu tạo ra được đo bằng quang phổ kế, máy đọc (Elisa reader)
hoặc bằng mắt. Nồng độ AFT - enzyme càng thấp thì nồng độ AFT trong mẫu càng cao.
Thơng thường, người ta tạo một đường chuẩn (standard curve) và kết quả tính tốn dựa
trên kết quả đo lường cường độ màu của mẫu.

Phương pháp này nhằm sàng lọc cùng một lúc nhiều mẫu. Ưu điểm của
phương pháp là thực hiện dễ dàng; việc phân tích nhiều mẫu cùng lúc sẽ làm giảm chi
phí cho xét nghiệm. Tuy nhiên, độ nhạy và khả năng lặp lại của phương pháp cịn kém.
Do đó, một phương pháp khác ra đời: phương pháp dùng sắc kí ái lực miễn dịch
(Immunoaffinity Chromatography) để đồng thời cơ đặc và tinh chế aflatoxin của mẫu
cần thử nghiệm.
2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch
Qui trình phân tích aflatoxin của các phương pháp đề cập trên phải qua nhiều giai
đoạn chiết xuất, làm sạch và cơ đặc. Việc định tính và định lượng aflatoxin dễ bị sai số
do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thốt trong các cơng đoạn.
Hơn nữa, với nhu cầu ngày càng lớn của công nghệ thực phẩm, yêu cầu về chất
lượng cuộc sống ngày càng tăng, qui định về tiêu chuẩn an toàn thực phẩm ngày càng
trở nên nghiêm ngặt; đặc biệt, trong giao dịch quốc tế, với nhu cầu về độ tin cậy cao
trong các kết quả phân tích, thì một kĩ thuật sắc kí mới ra đời, đó là sắc kí ái lực miễn
dịch (IAC), sử dụng kháng thể đặc hiệu với aflatoxin(s) mang nhiều ưu điểm mà các
phương pháp hóa lí khơng có được:
•

Mang tính chọn lọc, có khả năng loại trừ các tạp chất để đạt kết quả xét
nghiệm đáng tin cậy. Ưu điểm này được xem là tiến bộ nhất.


17

• Tỉ lệ thu hồi aflatoxin có tính thuyết phục rất cao.
•

Rất đơn giản

• Thời gian phân tích nhanh

•

Sử dụng ít dung môi hữu cơ (chloroform...) nên thân thiện với mơi trường.

•

Việc cơ đặc và tinh chế aflatoxin xảy ra đồng thời. Aflatoxin tinh chế không
kèm theo tạp chất như với các cột hoạt động theo qui tắc lí hóa.

• Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất là 1 năm.
•

Việc đọc kết quả dễ dàng, ít bị nhầm lẫn cho kết quả dương tính giả.

Bên cạnh đó, AFB1 là aflatoxin phổ biến nhất, có tính độc cao nhất và ln xuất
hiện trong bất kì quy định về mức nhiễm aflatoxin trong thực phẩm nào. Do vậy, kháng
thể dùng trong sắc kí ái lực cần có tính đặc hiệu cao nhất đối với AFB1.
Từ những cơ sở trên, việc sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt AFB1 đã được thực
hiện và hoàn thành tại Viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh gồm những bước:

Tạo huyết thanh thỏ kháng aflatoxin B1

Tinh chế kháng thể

Cộng hợp kháng thể lên giá thể

(Xem chi tiết ở phụ lục 3).
 Tạo huyết thanh thỏ kháng AFB1

Với bản chất là hapten, khơng có đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, khơng tạo

kháng thể được nên aflatoxin phải cộng hợp với một protein giá, là albumin huyết thanh
bị (BSA). Sự cộng hợp có thể là:


Dạng (H2N – protein): vị trí cộng hợp ở phía vịng dihydrofuran. Khi
đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc phía vịng cyclopentenone của
AFB1.



Dạng (AFB1 – O – carboxymethyl oxim – protein): vị trí cộng hợp ở
phía vịng cyclopentenone. Khi đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc


18

phía vịng dihydrofuran của AFB1, và chính ở vị trí này xảy ra phản
ứng tạo độc. Do đó, sử dụng dạng cộng hợp này để tạo kháng thể.
AFB1 - BSA conjugate được tiêm vào thỏ để gây miễn dịch trên thỏ. Khi đó,
kháng thể tạo thành sẽ là
 Kháng thể chống AFB1-BSA
Kháng thể chống AFB1 (IgGAFB1)



 Kháng thể chống BSA.
 Kháng thể khác.
 Tinh chế kháng thể chống AFB1
Cho huyết thanh thỏ chứa hỗn hợp các kháng thể thu được qua cột sắc kí ái
lực miễn dịch với thành phần như sau:

•

Giá thể rắn (solid support hay matrix, chromatographic bed
material): gel CNBr-activated Sepharose 4B.

• Ligand: BSA.
Khi đó, chỉ có các kháng thể chống AFB1 đi qua cột còn các loại kháng thể
còn lại bị giữ lại do tương tác kháng nguyên – kháng thể của BSA.
 Cộng hợp IgGAFB1 lên polymer CNBr-activated Sepharose 4B.

Cột được qua thử nghiệm trên AFB1 đã cho kết quả 100% về khả năng thu hồi, tính
lặp lại cao…cho thấy: sử dụng cột ái lực miễn dịch sản xuất tại Việt nam với tính hiệu
quả cao và giá thành thấp hơn so với nhập ngoại sẽ đầy hứa hẹn trong tương lai.
Sự đơn giản của quy trình chiết và tinh chế aflatoxin, sử dụng cột IAC: Chiết mẫu
với dung môi MeOH/H2O, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc được hịa lỗng với nước rồi cho
qua cột IAC, rửa cột với nước. Khi đó chỉ cịn aflatoxin gắn vào kháng thể trên cột để
sau đó được rửa giải bằng dung mơi MeOH. AFT trong dịch rửa giải có thể được định
lượng bằng phương pháp huỳnh quang hay TLC, hay được khẳng định trên HPLC.


19

Hình 2.7: Ngun lí hoạt động của cột ái lực miễn dịch (IAC).
Tuy nhiên, việc phân tích AFB1 bằng IAC cũng khơng thể bỏ qua AFG1, một
aflatoxin mà có lẽ độc tính và tác hại cúa nó chỉ đứng sau AFB1 mà thơi. Vì AFB1 và
AFG1 có sự giống nhau về cấu trúc ở vòng dihydrofuran nên phản ứng chéo có thể xảy
ra là điều dễ hiểu khi dùng IAC bắt AFG1.

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

3.1.1

Thời gian: Từ 1/3/2005 – 1/8/2005

3.1.2

Địa điểm: Phịng Hố miễn dịch - Viện Pasteur – Tp. Hồ Chí Minh.

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cột IAC 2,5 (nồng độ kháng thể kháng AFB1 gắn lên cột bằng 2,5mg/ml gel)
có khả năng bắt giữ AFB1 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất.
Cột: cột nhựa có kích thước 0,4 x 10cm.
Gel: CN-Br activated sepharose 4B gắn kháng thể kháng AFB1 đặc hiệu
(IgG-BSA). Lượng gel đóng trong cột là 0,1-0,15ml, được giữ trong đệm Tris-HCl 1M,
pH = 7,4.


20

Cột được bảo quản trong tủ lạnh (4 - 8oC).
3.2.1 Hoá chất
Aflatoxin G1 chuẩn (A0138 – Sigma).
Methanol (CH3OH - MeOH)
Chloroform (CHCl3)
Dung dịch Br2 0.003%
NaCl
Tween 20
Hóa chất tẩy rửa

Nước cất 2 lần khử ion
3.2.2 Dụng cụ
Ống nghiệm
Pipetman
Eppendorf
Bình Erlen
Giấy lọc thường
Lọc thuỷ tinh
3.2.3 Thiết bị sử dụng
Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi).
Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA) được thiết kế
đặc biệt cho việc sử dụng cột IAC.
Máy khuấy từ đứng (Stuart Scientific Stirrer SS10 – Made in UK).
Máy lắc (Vortex), cân điện tử, tủ lạnh, thiết bị làm khô dưới luồng N2 nhẹ.
Tủ hút
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Aflatoxin là chất độc. Do đó, trong suốt quà trình thao tác, dù với dạng bột hay
dung môi, người thao tác cần lưu ý:
 Mang găng tay, áo blouse, khấu trang khi tiếp xúc với aflatoxin.


Bề mặt nơi làm việc phải được che phủ bằng các vật liệu chỉ dùng một lần.

 Các dụng cụ thủy tinh sau khi thao tác xong phải rửa bằng các chất oxi hóa
mạnh (chất tẩy hay hỗn hợp sulfochromic).
 Phải ln pha mới dung mơi vì nó khơng ổn định.


21

 Dung môi phải được giữ trong những thiết bị không thấm nước, đục, tránh
ánh sáng và để trong tủ lạnh.


Để tránh thất thoát aflatoxin do bị hấp thu, tất cả thiết bị thủy tinh dùng
trong thao tác phải được ngâm trong dung dịch acid lỗng (HCl-1N) vài giờ,
sau đó rửa và làm khô.

3.3.1 Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu
3.3.1.1 Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch

• Dung dịch
(1) H2O, NaN3 0,05%
(2) PBS, NaN3 0,05%
(3) Đệm carbonate: -NaHCO3 0,1 M

-NaCl 0,5 M
-Thimerosal 0,01%
(4) Tris – HCl 0,1 M

NaCl 0,5 M
pH = 8
(5) CH3COONa 0,1 M

NaCl 0,5 M
pH = 4
(6) Tris – HCl 0,1 M
NaCl 0,5 M
NaN3 0,05%
pH = 7,4

(7) HCl 1 nM
pH = 3
• Chuẩn bị protein
Kháng thể IgG dưới dạng tủa trong ammonium sulphate.
Thẩm tích tủa trong dung dịch (1): 1 (lit) x 2 lần.
Thẩm tích tủa trong dung dịch (2): 1 (lit) x 2 lần.
Xác định nồng độ IgG bằng quang phổ kế ở λ= 280 nm.
Thẩm tích trong dung dịch (3) qua đêm.
• Chuẩn bị gel


22

CNBr – activated Sepharose 4B (Amersham Pharmacia BiotechAB).
1 g gel khô trương phồng thành 3,5 ml gel.
Rửa gel với dung dịch (7), thể tích 200 ml dung dịch/ g gel.
• Cộng hợp IgG vào Sepharose
Cho dung dịch IgG vào gel đã rửa (từ 2,5 đến 10 mg IgG/ ml gel), để
2 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4oC.
Lấy dịch nổi đo hấp phụ quang ở λ= 280 nm.
Rửa lại với đệm (3).
Bất hoạt nhóm -C ≡ N+ còn lại với đệm (4) trong 1 giờ.
Rửa với đệm (5).
Lần cuối rửa với dung dịch (6) ở 4oC - 8oC.
• Nén cột
Rửa frit và cột bằng ethanol.
Nén miếng frit vào đáy của cột.
Cho gel đã cộng hợp IgG vào cột.
Cho dung dịch (6) vào cột. Bảo quản ở 4oC.

3.3.1.2 Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1(theo Nollet,

1992)
• Nguyên tắc:
Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát khi qua bộ tạo
ánh sáng đơn sắc sẽ chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch
trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử. Khi phân tử hấp thụ năng
lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Tuy nhiên, chỉ
có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại.
Tiếp đến, bộ nhận tín hiệu, bộ khuyếch đại tín hiệu và đồng hồ đo sẽ phân tích cho 2 chỉ
tiêu:
 Mật độ quang (OD)


Độ thấu quang (T- transmittance)

Cực đại hấp thụ (λmax) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn
nhất. Và ở mỗi cực đại hấp thụ, chất lại có hệ số hấp thụ mol nhất định (Σ) [6].


23

Nồng độ của chất phân tích được tính theo cơng thc
àg / ml =

OD max ìM ì 1000


OD360: giỏ tr hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λmax)
M: trọng lượng phân tử chất cần phân tích

Đèn
nguồn

Bộ tạo ánh
sáng đơn sắc

Cốc
đựng
mẫu
đo

Bộ nhận
tín hiệu

Bộ
khuyếch
đại tín
hiệu

Đồng
hồ đo

Hình 3.1: Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại
•

Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn và xác định nồng độ
Mục đích: Pha lỗng dung dịch AFG1 chuẩn, cần thiết cho những

lượng mẫu rất ít sẽ dùng ở các thí nghiệm sau.

Tiến hành:
Chuẩn AFG1 1mg
Pha thành dung dịch AFG1 có nồng độ 250 ppm (1 mg / 4 ml CHCl3)
Lấy 280 µl AFG1/CHCl3 (250 ppm) pha trong 720 µl CHCl3 thành 1 ml dịch pha
Thêm tiếp 9 ml CHCl3vào
Đo OD360
Mẫu trắng: dung dịch CHCl3.
Cách thực hiện: Cho 2 cóng chứa đầy dung mơi CHCl3 vào quang
phổ kế, sau đó lấy cóng bên ngồi ra, thay dung mơi bằng dung dịch AFG1 đã pha vào
đầy cóng, cho cóng vào lại quang phổ kế. Sau đó đọc kết quả ở ánh sáng λ = 360 nm.


24

Tính µg AFG1/ml với λ = 360 nm, M=360 và Σ= 19500.
3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, cơ đặc và tinh chế AFG1 trên cột IAC
Sử dụng quy trình của hãng Vicam (Mỹ).
Để cột cân bằng ở nhiệt độ phòng 15oC. Rửa cột bằng 15 ml nước.
•

Với mẫu, quy trình được tiến hành
30 g mẫu + 6 g NaCl + 150 ml MeOH 80%
Lắc 30 phút
Lọc qua giấy lọc thường
Cho 20 ml dịch lọc vào bình chính xác.
Thêm nước cho đủ 60 ml
Lọc qua lọc thuỷ tinh
Cho 15 ml dịch lọc vào cột
Rửa cột bằng 10 - 15 ml dịch rửa

(62 ml nước + 8 ml MeOH + 70 µl Tween 20)
Rửa cột bằng 10 ml nước.
Rửa giải bằng 1ml MeOH
Cho tác dụng với 1ml dung dịch Br2 0.003%
Đọc kết quả bằng huỳnh quang kế

3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường hàm lượng aflatoxin
• Nguyên tắc:
Các phân tử hấp thụ các photon ánh sáng thích hợp để chuyển từ
trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Ngược lại, các phân tử đã ở
trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng


25

năng lượng hấp thụ dưới dạng photon, tức là tự phát ra ánh sáng, gọi là sự
phát quang (luminescene). Cường độ và bước sóng của ánh sáng phát ra
có thể đo lường được [6].

Nguồn
sáng

Bộ tạo ánh
sáng kích
thích đơn sắc

Khe sáng
vào

Đồng

hồ đo

Bộ
khuyếch
đại tín
hiệu

Cốc
đựng
mẫu
đo

Bộ nhận
tín hiệu

Khe
sáng ra

Bộ tạo ánh
sáng bức xạ
đơn sắc

Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế

Mỗi chất được đặc trưng bởi 2 hằng số:
Cực đại kích thích (λEx.) là bước sóng mà khi bị kích thích tại



bước sóng này, chất cho cường độ phát quang tương đối (I tđ) là

lớn nhất.
Cực đại bức xạ (λEm.) là bước sóng mà ở đó chất cho Itđ lớn nhất.



Ở nồng độ loãng, Itđ tỉ lệ với nồng độ của chất trong dung dịch.
•

Tiến hành:
Chuẩn bị huỳnh quang kế: mở máy trước 15-20 phút. Sau đó, cho

tuần tự 3 ống chuẩn của máy (màu đỏ, xanh, vàng) vào để chuẩn máy.
Chuẩn bị dung dịch cần đo: mẫu hoặc chuẩn AFG1 được chuẩn bị
theo quy trình 3.3.1.3.
Đo lượng AFG1: Cuvet (cốc đựng mẫu đo) chứa 1 ml dịch giải hấp
và 1 ml dung dịch Br2 0,003% (làm tăng khả năng phát huỳnh quang của AFG1) được
cho vào huỳnh quang kế, đậy nắp lại. Sau 1 phút, máy sẽ tự động tính và hiển thị kết
quả cho biết hàm lượng AFT.
3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế