Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất - phụ lục

Phụ lục 1: Các đặc tính lí hóa của AFT.
Phụ lục 2: Bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD
50
trên động vật (Lu, 1996)
Aflatoxin
Công
thức
nguyên
Trọng
lượng
phân
tử
Điểm
nóng
chảy
Huỳnh
quang
dưới
tia UV
Bước sóng huỳnh quang khi kích thích
bằng tia 365 nm
λ
Ex’
(nm) trong
Metanol ACN Chloroform Aceton
Nhóm difurocoumacyclopentenone
AFL B1 C
17
H
12
O

6
312 267 Xanh
lam
430 416 415 422
AFL B2 C
17
H
14
O
6
314 303-
306
Xanh
lam
430 419 415 420
AFL B2a C
17
H
14
O
7
320 240 Xanh
lam
AFL M1 C
17
H
12
O
7
328 299 Xanh

lam
428
AFL M2 C
17
H
14
O
7
330 293 Xanh
lam
430
AFLM2a C
17
H
14
O
8
346 248 Lục
Nhóm difurocoumarolactone
AFL G1 C
17
H
12
O
7
328 257-
259
Xanh
lục
450 440 435 448

AFL G2 C
17
H
14
O
7
330 237-
240
Xanh
lục
450 437 435 448
AFL G2a C
17
H
14
O
8
346 190 Xanh
lục
Độc tính LD
50
Cực độc (Super toxic)
≤
5 mg/kg
Rất độc (Extremely toxic) 5 -50 mg/kg
Độc tính cao (Highly toxic) 50 – 500 mg/kg
Độc tính khá cao (Moderately toxic) 0.5 – 5 g/kg
Độc tính nhẹ (Slightly toxic) 5 – 15 g/kg
Không độc (Practically nontoxic) > 15 g/kg
Phụ lục 3:

Sơ lược cách chế tạo cột IAC (Viện Pasteur Tp. HCM, 2002)
1. Gây miễn dịch
Thỏ để gây miễn dịch phải hoàn toàn khỏe mạnh, 2-3 tháng tuổi, trọng lượng trên
2 kg. Lấy 1 ml máu tai trước khi tiêm mũi mẫn cảm để làm chứng. Kháng nguyên
dùng tiêm là cộng hợp AFB1 – BSA của hãng Sigma Chemical. Kháng nguyên được
trộn với NaCl 0,9% và tá chất (lắc 30 phút) để thu được huyễn dịch AFB1 – BSA. Mũi
mẫn cảm: tiêm 2 ml huyễn dịch/thỏ, liều tiêm được chia thành nhiều mũi trên lưng,
100 µl huyễn dịch còn lại tiêm ở một bên đùi. Đùi còn lại tiêm 100 µl vaccine ho gà.
Mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4, 5 tiêm trong 5 tháng (mỗi tháng 1 lần), quy trình tiêm tương tự
như trên nhưng lượng kháng nguyên AFB1 – BSA giảm dần và không có vaccine ho
gà.
2. Tinh chế IgG
14 ngày sau lần tiêm thứ 5, lấy toàn bộ máu từ động mạch đùi. Ly tâm thu huyết
thanh và tách bỏ hồng cầu, sau pha loãng huyết thanh gấp đôi bằng nước muối sinh lí.
Tủa IgG bằng (NH
4
)
2
SO
4
45% bão hòa. Tiếp theo cho huyết thanh phản ứng với BSA
để loại các thành phần IgG kháng BSA.
3. Tạo cộng hợp sepharose – IgG kháng AFB1
IgG thu được sau khi tinh chế được gắn đồng trị lên sepharose đã được hoạt
hóa bởi CNBr theo quy trình của nhà sản xuất Amersham – Biotech. Quá trình gắn
được thực hiện ở một trong hai chế độ: (1) 22
o
C – 25
o
C trong 2 giờ hoặc (2) 4

o
C trong
24 giờ. Trong thời gian tạo cộng hợp, hỗn hợp được trộn liên tục bằng máy lắc nhẹ.
Khi cộng hợp kết thúc, cần kiểm tra lại IgG còn dư trong hỗn dịch để đánh giá hiệu
suất gắn. Hiệu suất gắn càng cao thì chất lượng cột càng cao.
Cộng hợp sepharose – IgG là gel có độ thấm cao khi cho chất lỏng chảy qua.
Sau khi xử lí để loại bỏ các IgG còn bám cơ học trong gel, gel được đóng vào cột nhựa
kích thước 0.4 cm x 10 cm với lượng 0.1 ml – 0.15 ml/cột. Cột được bảo quản ở nhiệt
độ 4
o
C – 8
o
C. Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất 1 năm (Nguyễn Lê
Trang, 2003)
Phụ lục 4: Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi)

Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA).