BÁO cáo môn học CÔNG NGHỆ ENZYM và PROTEIN đề tài ENZYM BIOSENSOR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


BÁO CÁO MÔN HỌC:
CÔNG NGHỆ ENZYM VÀ PROTEIN
ĐỀ TÀI: ENZYM BIOSENSOR
GV:Th.S LÊ VĂN HUẤN
NHÓM: 6
Nguyễn Thị Thanh Thảo: 17070018
Mã Nữ Si Ty: 17070027

BÌNH DƯƠNG 2019_2020



MỤC LỤC
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR
1.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR
1.2 KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR
1.3 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR.
1.4 PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ XÚC TÁC

PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSOR
2.1 CHỌN LỰA BỘ THỤ CẢM SINH HỌC (Bioreceptor)
2.2 CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG
2.3 SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG

ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR
3. ĐO NHỊP TIM VÀ HÀM LƯỢNG OXY TRONG MÁU SỬ DỤNG

BIOSENSOR


1

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR

1. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR
Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cực sinh
học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy. Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết của
mình, ơng đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể.
Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn lâm New York, ơng đã có bài diễn
thuyết: “Làm thế nào để các điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện
thế, phép đo độ dẫn điện) thơng minh hơn”. Trong đó, ơng trình bày cách làm điện cực
điện hóa thơng minh hơn bằng cách thêm enzym vào máy chuyển đổi như những chiếc
bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng.
Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty
Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng điện
của hydro peroxide. Đây là lần đầu tiên các phịng thí nghiệm trên thế giới phân tích dựa
trên một Biosensor. Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới là khi Divis đề
xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để
đo hàm lượng rượu.
Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser –
LA640) trong đó sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan để chuyển các
electron từ lactatdehydrogenase tới một điện cực. Mặc dù không thành công trên thương
trường nhưng là bước đột phá quan trọng cho một thế hệ của Biosensor được ứng dụng
trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng.
Năm 1987, điện cực enzym screen-printed được cơng bố bởi Medisense
(Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám sát
lượng glucose trong máu tại nhà. Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông dụng hơn

và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 khi họ được Abbort
mua lại. Hiện nay Hãng Boehringer, Manheim và Bayer đang cạnh tranh nhau rất gay gắt
về Biosensor và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị trường Biosensor của thế
giới tới 85%.
1.2 KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR
Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thành
một tín hiệu điện.Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc
tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín


2
hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong Biosensor, hiện tượng được nhận dạng bởi một hệ
thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor). Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực
tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor.Cơ
quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích.

Sơ đồ cấu tạo biosensor
1.3 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR
Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực.Màng ngoài
(external membrane) của biosensor sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua. Các thành phần
sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cần phân tích và tạo
ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiện được. Các thành phần
sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau:
Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thơng qua các phản
ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vịng trịn rỗng trong sơ đồ).
Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích.
Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học.
Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được.
Cịn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc
tính thấm khác nhau so với màng bên ngồi.Tín hiệu ra của điện cực thường phụ thuộc

vào loại biến năng mà nó sử dụng.


3

Hình 1: Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor:
- Chất cần phân tích
- Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu)
1.4 PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ XÚC TÁC
Phân loại:
Trên thực tế có vơ vàn những loại cảm biến khác nhau và chúng ta có thể chia các cảm
biến thành hai nhóm chính:
Cảm biến vật lí: có thể kể đến một vài ví dụ dễ hình dung như sóng điện từ, ánh sáng, hồng
ngoại, tia X, hạt bức xạ, nhiệt độ, áp suất, âm thanh, từ trường, gia tốc,…
Cảm biến hóa học: thường thấy như độ ẩm, độ PH, ion, khói,….
Ngồi ra ta cũng có một số hình thức phân chia khác.
Cảm biến chủ động và bị động
Cảm biến chủ động: không sử dụng điện năng bổ sung để chuyển sang tín hiệu điện. Điển
hình là cảm biến áp điện làm bằng vật liệu gốm, chuyển áp suất thành điện tích trên bề mặt
Cảm biến bị động có sử dụng điện năng bổ sung để chuyển sang tín hiệu điện. Điển hình là
các photodiode khi có ánh sáng chiếu vào thì có thay đổi của điện trở tiếp giáp bán dẫn p-n
được phân cực ngược.
Phân loại theo nguyên lí hoạt động
Theo ngun lí hoạt động ta có thể kể đến những loại cảm biến nổi bật như:
Cảm biến điện trở: hoạt động dựa theo di chuyển con chạy hoặc góc quay của biến trở,
hoặc sự thay đổi điện trở do co giãn vật dẫn.


4
Cảm biến cảm ứng: cảm biến biến áp vi phân, cảm biến cảm ứng điện từ, cảm biến dịng

xốy, cảm biến cảm ứng điện động, cảm biến điện dung,….
Cảm biến điện trường: cảm biến từ giảo, cảm biến áp điện,…
Và một số cảm biến nổi bật khác như: cảm biến quang, cảm biến huỳnh quang nhấp nháy,
cảm biến điện hóa đầu dò ion và độ pH, cảm biến nhiệt độ,…
CƠ CHẾ XÚC TÁC:
Đặc hiệu tương đối : enzym có tác dụng lên một kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử
cơ chất mà không phụ thuộc vào bản chất hóa học của các cấu tử tham gia tạo thành liên
kết
Đặc hiệu nhóm: Enzym có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết nhất định khi một hay
hai cấu tử tham gia tạo thành liên kết này có cấu tạo nhất định.
PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSOR
Việc chế tạo Biosensor bao gồm ba bước:
Chọn lựa bộ thụ cảm sinh học
Chọn lựa bộ biến năng
Cố định thành phần sinh học lên bộ biến năng.
2.1 CHỌN LỰA BỘ THỤ CẢM SINH HỌC (Bioreceptor):
Bộ thụ cảm sinh học đóng một vai trị là thiết bị nhận dạng sinh học.Khi có mặt
chất cần kiểm tra, bộ thụ cảm sinh học phải tạo ra một hiệu ứng hóa lý có khả năng phát
hiện bởi bộ biến năng.Điều này liên quan nhiều quá trình chẳng hạn như sự xúc tác sinh
học, sự cặp đôi miễn dịch hay sự nhận cảm hóa học.
2.1.1Enzym:
Chất xúc tác sinh học thường được sử dụng là enzym vì có sẵn trên thị trường,
chẳng hạn như glucose oxidase (enzym oxy hóa glucose) và urease (Enzym thủy phân ure).
Các enzym này được thu nhận từ nhiều nguồn sinh học khác nhau và được sử dụng một
mình hay kết hợp với cofactor của chúng như NAD+ và NADP+.
Sự sử dụng các enzym thương mại có nhiều thuận lợi chẳng hạn như khả năng sản
xuất hàng loạt với những đặc điểm, thời gian sống biết trước và sẵn có.Vì vậy các enzym
thương mại đóng một vai trị quan trọng trong các Biosensor hiện đang có mặt trên thị
trường. Nhưng bên cạnh đó chúng có những bất lợi như ít bền và khi hoạt động cần có
cofactor kết hợp, đồng thời một enzym đơn lẻ thì khơng xúc tác hồn tồn cho một chuỗi

phản ứng, vì vậy trong biosensor thường kết hợp nhiều enzym với nhau theo một trình tự
hợp lý để đảm bảo sự hoạt động tối ưu của Biosensor.


5
2.1.2. Vi sinh vật:
Cơ thể vi sinh vật có đầy đủ các enzym và cofactor cần thiết trong một môi trường
đã được tối ưu hóa. Trong mơi trường thích hợp, Vi sinh vật sẽ sản sinh và đền bù bất cứ
sự mất mát hoạt tính của Enzym theo thời gian.
2.1.3. Mơ và cơ quan:
Có thể tận dụng các phần mơ thực vật hay mô động vật làm nguồn nguyên liệu cung
cấp enzym vì chúng có khả năng gắn kết cao, có một cấu trúc đủ mạnh để gắn kết trực tiếp
lên bộ biến năng mà không cần đến kỹ thuật cố định protein.
Mô thực vật – động vật:
Thực vật là nguồn enzym hữu dụng cho hóa học phân tích.Bằng việc sử dụng bộ biến
năng thích hợp, có thể chế tạo Biosensor có tính năng ổn định cao vì các enzym vẫn được
duy trì hoạt tính trong mơ thực vật.Tương tự như vậy, mô động vật được xem như là một
bộ thụ cảm sinh học hữu dụng cho sự phát hiện chọn lọc L-amiono acid mà không bị ảnh
hưởng đáng kể bởi D-amino acid.Để tăng khả năng chọn lọc có thể kết hợp một chất kháng
khuẩn để tránh sự nhiễm khuẩn, chẳng hạn như thêm 0.02% NaOH vào điện cực
glutamine.
Bộ phận cơ quan:
Các xúc tác sinh học cũng được tìm thấy trong các cơ quan tế bào như lysosome, lục
lạp, thể hạt và vi thể vì chúng chứa nhiều hệ thống enzym được dùng trong biosensor.
Chẳng hạn như vi thể gan có hệ thống enzym monooxidase với cytochrome P 450 xúc tác
cho phản ứng oxy hoá nhiều acid béo, hormone steroids… Các cơ quan tế bào được gắn
trực tiếp lên bộ biến năng đo dòng điện trong thiết bị Biosensor.
2.1.4. Tác nhân miễn dịch:
Kháng nguyên và kháng thể cũng được sử dụng làm bộ thụ cảm sinh học. Tính
chọn lọc của Biosensor được quyết định bởi kháng thể và tính nhạy cảm được quyết định

bởi enzym kết hợp. Kháng thể được cố định vào bộ biến năng nhờ vào kỹ thuật Miễn dịch
học Enzym (EIA).Hoặc thay enzym bằng chất mang ion đóng vai trị như chất trung gian
của các q trình điện hóa miễn dịch.Kháng ngun thích hợp với kháng thể được kết hợp
với chất mang ion tạo ra sự tiếp hợp được phát hiện bởi bộ biến năng điện hóa.
2.1.5. Bộ thụ cảm hóa học:
Màng tế bào cũng được sử dụng do khả năng kích thích hóa học gây ra sự thay đổi
cấu tạo. Các tế bào thần kinh cũng được dùng trong phát hiện thuốc, độc tố hay các chất
khác.
2.2.

CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG:


6
Bảng 3.1: Hiện trạng nghiên cứu của Biosensor với bộ biến năng tương ứng:
Bộ biến năng

Biosensor
Tế bào, vi

Tác nhân

Mô thực vật-

Bộ thụ cảm

sinh vật

miễn dịch

động vật

hóa học

xxx

xx

xx

x

xxx

xx

xx

x

Enzym
Đo dịng

Tế bào

điện

điện

Đo điện

hóa

thế

Bán dẫn (IFET)

xx

x

x

x

x

x

Ap điện

x

x

Cơ hóa học

x

Đo nhiệt

(Thermistor)
Đo quang (sợi quang
học)

Chú thích:

x

x: Đang nghiên cứu cơ bản
xx: Đã nghiên cứu và phát triển những mẫu đầu tiên
xxx: Những thiết bị có mặt trên thị trường

Phụ thuộc vào kiểu phản ứng và từng ứng dụng cụ thể của Biosensor mà chọn bộ biến năng
phù hợp.
Nếu nó được dùng trong sinh học thì cần phải đáp ứng các tiêu chuẩn tương ứng
như khả năng tách protein, lipid hay tế bào.
Nếu nó được dùng trong invivo thì cần phải giảm kích thước tối thiểu và địi hỏi
hình dạng của nó phải phù hợp để khơng phá huỷ mơ thực vật-động vật, đồng thời
cũng có khả năng loại bỏ độc tố, kim loại hoặc các thành phần đa phân tử ra khỏi
bộ biến năng.
Vấn đề tác động hóa học cũng ảnh hưởng đến sự chọn lựa bộ biến năng. Có thể kết hợp
enzym urese vào các điện cực pH, pCO 2, hay pNH3. Bộ biến năng tốt nhất cho việc xác
định ure trong một mẫu sinh học là các điện cực pCO 2, pNH3 bởi chúng có một màng thẩm
thấu để loại bỏ tất cả những ảnh hưởng của cation và anion.
2.3.

SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG:
Việc cố định các thành tố sinh học, nhất là enzym thường đem lại nhiều lợi nhuận

hơn trong việc ứng như:

7
Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn.
Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễ dàng.
Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài.
Tuy nhiên, việc sử dụng enzym cố định cũng có những hạn chế nhất định như:
Sự chuyển khối bị hạn chế.
Có thể mất hoạt tính khi cố định.
Khơng có hiệu quả đối với cơ chất rắn.
Mất tính thích nghi hình thể.
Nhưng những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang
lại. Do vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu mới cũng như các công nghệ mới để cố định
enzym.
Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằng nhiều
cách. Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khi các điện
cực sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế:
Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt biosensor.
Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấu trúc và
chức năng.
Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài.
Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng đối với từng cấu tử sinh học.
Để cố định các thành phần sinh học trong Biosensor, người ta thường sử dụng các kỹ
thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khn gel hoặc trong polymer, liên kết đồng hóa trị
với chất mang và liên kết chéo các protein.

Hình 3.1: Một số phương pháp cố định thường dùng trong điện cực sinh học


8

2.3.1. Sự cố định Enzym:
a. Sự cố định bằng hấp thụ vật lý:
Điện cực Enzym đầu tiên được chế tạo bởi Updike và Hicks bằng cách cố định
Enzym Glucose oxidase trong một lớp gel polyacrylamide, sau đó Enzym này được gắn lên
màng Plastic của điện cực oxy. Hoặc có thể cố định một enzym lên một thành phần nhạy
cảm của một điện cực bằng màng thẩm thấu ngăn cản sự khuếch tán protein. Guibault và
Shu đã chế tạo một điện cực enzym nhạy cảm với ure bằng cách trải một dung dịch huyền
phù của enzym urease lên bề mặt của điện cực có màng nilon và bao bọc khít hồn tồn
bằng màng thẩm thấu, sau đó điện cực enzym này được rửa sạch với nước và sẵn sàng để
sử dụng.
Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:
Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein
như lực Valderwaalls, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang khơng có
lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui
vào trong các lỗ xốp của chất mang.
Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion
(Liên kết này bền hơn so với hấp phụ).
Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên
kết ion:
Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin,
agarose, chitin.
Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide của kim loại.
Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex

CM – sephadex, DEAE –

celllulose, CM – cellulose.
Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl.
Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó
rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang.

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định:
Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với
nồng độ của nó ở một giới hạn nhất định.
pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở
chất mang cũng như ở protein enzym. Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến
lượng enzym cố định được bằng liên kết ion. Đồng thời sự thay đổi pH đột ngột
thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym.


9
Lực ion của mơi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang có
thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch. Tuy nhiên, sự có mặt
của muối cũng có thể làm tăng độ hịa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến
hiệu quả cố định.
Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết
protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym.
Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng
nhỏ thì hấp phụ càng cao. Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ
tốt hơn và bền hơn.
Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym
trong dung dịch khơng giữ được hoạt tính trong thời gian dài. Do đó sự cố định hóa học, sử
dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài.
b. Sự cố định bằng liên kết ngang (cross – linking immobilization):
Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa
các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có
trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và khơng có tính hịa tan.
Có thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiều
protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein
mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA). Ngay cả cơ quan hay các tế
bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang.

Glutaraldehyde là tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng. Tác nhân có hai nhóm
chức aldehyde ở các đầu mạch này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay
enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:

Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene
diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang.
Có 4 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:
Phương pháp ngâm (Immersion method)


10
Ứng dụng: Phương pháp ngâm này dùng để cố định enzym urease lên điện cực thủy
tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với các cation hóa trị I.
Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hòa tan
trong 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8. Thêm vào 1 ml dung dịch albumine huyết
thanh bò 17.5%, sau đó thêm 0.07 ml dung dịch glutaraldehyde 25% để thu được nồng độ
cuối cùng 0.8%. Khuấy dung dịch trong 2 phút.
Chuẩn bị bề mặt hoạt động: Đầu tiên điện cực cation được rửa bằng nước cất, sau đó
lau khơ bằng giấy lọc. Nhúng ngập bầu điện cực trong dung dịch cố định trên, xoay điện
cực nhẹ nhàng xung quanh trục của điện cực trong 15 phút để tạo một lớp dung dịch cố
định đồng nhất.Một vòng “O” được gắn khít vào để giữ cho màng enzym này bám chặt lên
bầu điện cực.Sau đó rửa điện cực bằng nước cất, dung dịch glycine, và cuối cùng bằng
nước cất để tách rửa hay trung hịa tác nhân tạo liên kết ngang.

Hình 3: Nguyên tắc của phương pháp ngâm
Ưu điểm: Phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các Enzym
lên đa số các bộ biến năng, đặc biệt bộ biến năng nhỏ.
Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method):
Nguyên tắc: Nhỏ 10 ml dung dịch chứa enzym lên trên đỉnh của một điện cực, sau đó
nhỏ 10ml dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde.

Phương pháp này cũng được dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước của các điện cực
cảm ứng khí như màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene.


11

Hình 3.3: Phương pháp kết hợp trực tiếp
Ưu điểm: Tiết kiệm enzym, dùng để cố định các enzym có giá thành cao.
Phương pháp sử dụng bình phun (Use of aerosol):
Nguyên tắc: đầu nhạy cảm của một điện cực được rửa và ngâm trong dung dịch
enzym khoảng 20 phút để đảm bảo sự hấp thu enzym lên điện cực enzym. Điện cực này
sau đó được sấy khơ ở 4oC và xoay.Glutaraldehyde được bơm lên trên điện cực từ một
khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt. Sau khi tạo liên kết ngang, điện cực enzym được
rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng.
Ưu điểm: bề dày lớp enzym cực kỳ mỏng (1-2mm) và các biosensor tạo ra có thời
gian đáp ứng cực ngắn (5-10s).
Ứng dụng: Phương pháp này dùng để cố định enzym pennicilinase, urease và
acetylcholinesterase, cố định các protein lên nhiều chất mang.

Hình 3.4: Phương pháp sử dụng bình phun
Sử dụng màng membrane:
Các màng membrane tăng cường-gia cố (Re-inforced membranes): Enzym được cố
định lên một diện tích rộng của màng nylon bằng những dĩa nhỏ chứa membrane enzym có
cùng mẻ và sự cố định giống nhau. Sau đó các màng này được kẹp vào trong bộ biến năng.


12
Màng membran tăng cường-gia cố này có phần sợi do đó cải thiện tính chất cơ học của
màng enzym.
Các màng membrane gắn nhóm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng các

màng membrane xốp sẵn có trên thị trường. Những màng này có các nhóm chức liên kết có
khả năng phản ứng với vị trí tự do của enzym. Các màng này sau đó đem ngâm trong dung
dịch chứa enzym đã chọn để thu được một màng enzym với những tính chất cơ học hữu
dụng.
Sự cố định cofactor:
Cofactor được cố định lên chất mang đồng thời cùng lúc với enzym bằng phương pháp hấp
thụ vật lý, hay bằng liên kết ngang.
2.3.2. Cố định Vi sinh vật
Vi sinh vật có kích thước lớn hơn enzym do đó dễ dàng cố định bằng phương pháp vật lý.
Chúng có thể được cố định bằng gel agar hay polyacrylamide hoặc màng thẩm thấu và
màng lọc membrane như millipore 0.22 mm – chế tạo từ ester cellulosic. Toàn bộ tế bào vi
sinh vật được cố định trong huyền phù collagen đã được xử lý bởi glutaraldehyde. Màng
collagen cũng được sử dụng như một chất mang vật lý.
Màng kỵ nước và vi sinh vật có thể được gắn đồng thời lên các điện cực khuếch tán
khí chẳng hạn như điện cực pNH3, pO2, pCO2. Vi sinh vật được nhốt trong các lỗ màng lọc
cellulose acetate, sau đó rửa các tế bào vi sinh vật tự do trên bề mặt và đặt màng vi sinh vật
trên vào điện cực dùng màng thẩm thấu và ngâm trong dung dịch đệm để loại bỏ các thành
phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo. Các điện cực vi sinh vật được bảo quản ở nhiệt độ
40C trong dung dịch đệm phosphate.

Hình 3.5: Điện cực vi khuẩn đo dòng điện


13
Cũng có thể cố định một enzym và một tế bào vi sinh vật lên cùng bộ biến năng. Vi
sinh vât được cố định bằng phương pháp vật lý và enzym được cố định bằng phương pháp
liên kết đồng hóa trị để tránh sự nhả protein.
Vi khuẩn acetic thuộc loài Acetobacter xylinum có khả năng tạo ra màng mỏng
trong mơi trường tĩnh sau khi xử lý với glutaraldehyde và có những tính chất cơ học nhất
định thì có thể cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà không cần dùng màng thẩm thấu.

2.3.3

Cố định các tác nhân miễn dịch:

Nhiều điện cực miễn dịch được tạo ra bằng các cố định các tác nhân miễn dịch lên các bộ
biến năng khác nhau.
a) Cố định kháng thể (Immobillization of antibodies):
Mục đích: Để phát hiện ra kháng nguyên tương ứng tạo ra kháng thể. Do kháng thể có cấu
trúc là protein nên phương pháp cố định kháng thể tương tự như phương pháp cố định
enzym: dùng phương pháp cố định trực tiếp hay sử dụng màng membrane.
Cố định trực tiếp lên bộ biến năng:
Các kháng thể có thể được gắn lên một điện cực carbon bằng liên kết cộng hóa trị.Các
nhóm COOH được tạo ra trên điện cực carbon bằng phản ứng điện hóa trong mơi trường
acid nitric HNO3 và kali bicromat K2Cr2O7 và gắn với kháng thể bằng một tác nhân tạo liên
kết ngang như carbodiimide.
Hoặc có thể cố định bằng phương pháp hấp phụ kháng thể lên các lớp kim loại vàng
hay bạc lắng trên thủy tinh. Sau đó dùng phương pháp dò cộng hưởng gen nguyên sinh bề
mặt.
Sự cố định bằng màng membrane:
Các kháng thể cũng có thể được cố định lên các màng membrane theo trình tự như sau:
đầu tiên màng bromo-acetylcellulose được ngâm trong dung dịch chứa hexamethylene
diamine, sau đó ngâm trong dung dịch diepoxy butadiene, dung dịch này tạo ra các nhóm
sẽ phản ứng với kháng thể, cuối cùng màng này với kháng thể đã đuợc cố định được rửa
với dung dịch ethanolamine để loại bỏ những nhóm epoxy khơng phản ứng.
Kháng thể cũng có thể được cố định trong các mạng nylon hoặc hấp thụ vật lý bằng các
màng collagen và polyvinylbutyral, sau đó được lắp vào điện cực ISFET.Màng này được
hoạt hóa với glutaraldehyde trước khi kết hợp với kháng thể.Các kháng thể cũng có thể
được cố định lên sợi quang học.
b) Sự cố định kháng nguyên:
Kháng nguyên là các hợp chất bao gồm protein, hydratcarbon,…chúng được cố định

bằng những cách khác nhau, không như kháng thể và enzym. Yếu tố quyết định tính kháng


14
nguyên dinitrophenol (DNP) có thể được kết hợp với một chất mang ion dibenzo-18crown-6 (DB18C6) và sau đó được cố định trong màng polymer.Đầu tiên, ether này được
chuyển thành dẫn xuất dạng trans-dinitro và sau đó thành dẫn xuất arylaminey thích hợp
cho việc kết hợp với fluorodinitrobenzene. Phức hợp này được hịa tan trong
tetrahydrosulfan và thêm dibutylsebacate, sau đó kết hợp phức hợp này trong màng
polyvinylchloride (PVC). Cuối cùng màng kháng nguyên được chia thành những đĩa nhỏ
được gắn lên trên đỉnh của điện cực.Các biosensor tạo ra nhạy cảm trực tiếp với các kháng
thể. Tuy nhiên, điện cực tạo ra bằng cách này vẫn có nhược điểm đó là DNP có một ái lực
đối với ion K+ của dung dịch chất điện phân bên trong điện cực, do đó cho kết quả khơng
chính xác. Để hạn chế điều này, một điện cực rắn với nhựa epoxy nhồi đá granite được chế
tạo. Đầu tiên, người ta đổ nay nhựa thông vào bên trong ống PVC chứa một dĩa bằng Pt
cùng đường kính với ống, sau đó đổ dung dịch tetrahydrofuran, 10 mg/ml DNP-kháng
nguyên và 15% triocyl acetate vào trong lỗ khoan của nhựa thơng.

Hình 3.6: Sự cố định kháng thể lên màng membrane bromo-acetylcellulose


15

Hình 3.7: Điện cực kháng nguyên dùng PVC rắn với DNP
c) Sự gắn enzym:
Khi một tác nhân miễn dịch được cố định lên bộ biến năng hay lên màng membrane
thì sự kết hợp miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhưng khó được phát hiện
bởi bộ biến năng, thơng thường phản ứng miễn dịch có thể được dị khi bổ sung vào enzym
để xúc tác q trình phản ứng. Kháng nguyên hay kháng thể được gắn với một enzym sử
dụng kỹ thuật EIA (miễn dịch enzym) hay ELISA. Enzym được gắn với tác nhân miễn
dịch bằng tác nhân tạo liên kết ngang hai chức glutaraldehyde.

Tuỳ thuộc vào từng loại bộ biến năng mà gắn kháng nguyên hay kháng thể với
enzym cho phù hợp: Nếu sử dụng bộ biến năng là điện cực pO 2 thì kháng nguyên được gắn
với enzym glucose oxidase hoặc catalase. Khi bộ biến năng là điện cực pNH 3kháng nguyên
được gắn với enzym urease.
2.3.4 Cố định mô, cơ quan và chemoreceptor:
a) Cơ quan và mô thực vật – động vật:
Đầu tiên, một lát mô thực vật hay động vật được cắt ra, và chèn vào giữa hai màng
bán thấm rồi gắn chúng lên bộ biến năng. Thường dùng điện cực pO 2, pCO2, hay pNH3.
Mơ động vật có thể là gan bị, gan thỏ, bắp thịt thỏ hay cơ ruột, hay thành phần tế bào. Các
cơ quan này được gắn vào bộ biến năng sẽ làm cho Biosensor chọn lọc hơn bởi vì chúng
chứa những enzym đặc biệt.
Biosensor gắn mô thực vật – động vật nhìn chung có thời gian đáp ứng dài hơn
Biosensor gắn enzym. Thời gian đáp ứng nhanh của Biosensor này có thể đạt được nếu như
gắn các mơ này trong bột than dạng paste nhằm tạo ra sự tiếp xúc lớn hơn giữa chất xúc tác
sinh học và thành phần cảm ứng: Cắt những lát mô và nhồi vào trong hồ vữa, sau đó trộn
với dầu khống và bột than chì để tạo hỗn hợp nhão và cuối cùng trải đều lên đầu điện cực.
b) Chemoreceptor:


16
Receptor là râu nhỏ của loài cua xanh Callinectes sapidus có sợi thần kinh được sử
dụng như bộ biến năng để truyền dẫn xung động thần kinh gây ra bởi khứu giác hay vị
giác, chúng được cố định trực tiếp vào điện cực dò Pt của điện cực đo điện thế. Điện cực so
sánh Ag/AgCl được nhúng vào dung dịch muối, và sẽ tạo ra sự chênh lệch điện thế so với
điện cực dò. Bằng việc dùng các liều tác nhân kích thích khác nhau vào trong dịng chất
mang sẽ gây ra những thay đổi về cấu tạo của receptor và kết quả tạo ra một sự thay đổi về
khả năng thấm của màng kích thích hay sự thay đổi hoạt tính enzym được gắn lên màng.
Sự phân cực của sợi trục axon sẽ làm tăng điện thế đo được.
Biosensor dựa trên các receptor thần kinh có thể dùng để phát hiện độc tố hay các
chất độc hóa học đã sử dụng trong chiến tranh. Sử dụng receptor acetylcholine có thể xác

định acetylcholine bằng cách dò trở kháng đặc trưng so với các bộ truyền thần kinh khác,
receptor này được gắn enzym acetylcholinesterase nhạy cảm với hợp chất phosphor hữu cơ
và carbamate, receptor được cố định lên bộ biến năng thích hợp bằng cách ngâm đầu nhạy
cảm của điện cực vào trong dung dịch liposome chứa receptor.
Ứng dụng của biosensor
3. ĐO NHỊP TIM VÀ HÀM LƯỢNG OXY TRONG MÁU SỬ DỤNG BIOSENSOR
1.1 Các phương pháp phổ biến đo nhịp tim cơ thể người
Có rất nhiều phương pháp để đo và xác định nhịp tim khác nhau hiện nay trong và ngồi
nước. Nhìn chung các phương pháp đo là giống nhau, chỉ khác nhau ở hình thức đo và
được chia làm ba phương pháp là:thủ công, xâm lấn, không xâm lấn.
Phương pháp 1: Phương pháp thủ công
Đo nhịp tim bằng nhấn ngón tay: Sử dụng măt trong của 2 ngón tay áp sát vào mặt
trong của cổ tay bên kia - chỗ có những nếp gấp cổ tay (hai tay ngược nhau). Bấm nhẹ vào
đó cho đến khi cảm thấy nhịp đập. Nếu cần thiết, có thể di chuyển ngón tay xung quanh đó
cho đến khi bạn cảm thấy nhịp đập. Sau đó dùng đồng hồ để xác định số nhịp tim. Hoặc
đặt 2 ngón tay vào một bên cổ nơi giao nhau giữa khí quản và các cơ lớn ở cổ. Bấm nhẹ
cho đến khi bạn cảm thấy nhịp đập.


17

Hình 1: Cách đo thủ cơng bằng tay
Đo nhịp tim bằng dùng ống nghe: đeo tai nghe và kiểm tra ống nghe, mùa đông cần xoa
làm ấm loa nghe trước khi nghe. Đặt ống nghe lên các vị trí nghe tim, mỗi lần đặt ống nghe
10 -20 giây. Sau đó dùng đồng hồ để xác định số nhịp tim.

Hình 2: Đo thủ công bằng ống nghe
> Nhận xét: là phương pháp phổ biến ,đơn giản, dễ đo. Chi phí khi đo khơng đáng kể. Kết
quả đo có độ chính xác phụ thuộc vào người đo, có sự sai sót do chênh lệch thời gian đếm
của người đo và đồng hồ đếm thời gian. Tốn nhiều thời gian, công sức để đo.

Phương pháp 2:
Phương pháp xâm lấn Sử dụng các điện cực để đo nhịp tim trong một khoảng thời
gian, dòng điện từ nguồn sẽ đi qua các điện cực vào cơ thể rồi phản hồi lại các thông tin
nhịp tim. Trước khi đo phải cần lưu ý những vấn đề: không ăn uống, không sử dụng các
loại phấn, dầu hay mỹ phẩm vùng ngực... Các điện cực sẽ được gắn lên vùng ngực đã được
cồn khử trùng, dùng bằng dán cố định dây và điện cực,
dụng cụ sẽ được khởi động và đo liên tục từ 24-48 tiếng,
dữ liệu sẽ được lưu trữ vào một bộ nhớ.


18
>Nhận xét: là phương pháp có độ chính xác cao, được sử dụng nhiều trong các bệnh viện,
trung tâm khám sức khỏe, có thể đo được nhiều thơng số trong cùng một khoảng thời gian.
Nhưng có thể gây ra các tác dụng phụ như dị ứng da do tiếp xúc dòng điện cực hay các
chất để dán cố định , gây cảm giác khó chịu. Vì thiết bị hiện đại nên sai số trung bình của
thiết bị đo là 1% và chi phí trung bình mỗi lần đo là 150 USD.
Hình 3: Đo bằng điện cực
Phương pháp 3: Phương pháp không xâm lấn Khi tim đập, máu sẽ được dồn đi khắp cơ
thể qua động mạch, tạo ra sự thay đổi về áp suất trên thành động mạch và lượng máu chảy
qua động mạch. Vì thế ta có thể đo nhịp tim bằng cách đo những sự thay đổi đó. Khi lượng
máu trong thành động mạch thay đổi sẽ làm thay đổi mức hấp thụ ánh sáng của động mạch,
do đó khi một tia sáng được truyền qua động mạch thì cường độ ánh sáng sau khi truyền
qua sẽ biến thiên đồng bộ với nhịp tim. Khi nhịp tim giãn ra, lượng máu qua động mạch
nhỏ nên hấp thụ ít ánh sáng, ánh sáng sau khi truyền qua động mạch có cường độ lớn,
ngược lại khi tim co vào, lượng máu qua động mạch lớn hơn, ánh sáng sau khi truyền qua
động mạch sẽ có cường độ nhỏ hơn.Ánh sáng sau khi truyền qua ngón tay gồm hai thành
phần AC và DC.
+ Thành phần DC đặc trưng cho cường độ ánh sáng cố định truyền qua mô, xương và tĩnh
mạch.
+ Thành phần AC đặc trưng cho cường độ ánh sáng thay đổi khi lượng máu thay đổi truyền

qua động mạch, tần số của tín hiệu này đồng bộ với tần số của nhịp tim.

> Nhận xét: có độ chính xác cao, đơn giản, dễ sử dụng, thiết bị gọn nhẹ, sử dụng thoải
mái, khơng gây khó chịu, thời gian đo nhanh. Các phương pháp quang học có một đánh giá
sai số 15% và một chi phí trung bình 20USD.


19
So sánh các phương pháp :Phương pháp 1 không sử dụng biosensor dẫn tới độ sai lệch
cao. Phương pháp 2 và 3 sử dụng biosensor nên có độ chính xác cao thuận lợi cho việc
chuẩn đoán.

4.Các loại thiết bị đo nhịp tim có sử dụng biosensor
Hình 4: Thiết bị đo nhịp tim

Hình 5:Thiết bị đo nhịp tim được tích hợp trên các thiết bị đeo tay và đồng hồ

KẾT LUẬN


20
Biosensor đã phát triển vượt bậc nhanh chóng trong suốt nhiều năm qua. Nhờ vào
các phương pháp kết hợp mới của các bộ thụ cảm với nhiều bộ biến năng .Đặc điểm, tính
chất của các biosensor này đã được cải thiện và tính xác thực càng ngày càng cao đã tạo ra
nhiều ứng dụng mới.
Ứng dụng chính của Biosensor là trong lĩnh vực y khoa (chăm sóc sức khỏe bệnh
nhân).Biosensor đặc biệt thích hợp cho phân tích các mẫu trong môi trường sinh học phức
tạp mà không cần tác nhân phản ứng hóa học.Biosensor có thể được dùng in-vivo bởi vì nó
tạo ra một tín hiệu liên tục, có thể điều khiển nồng độ các chất tạo thành trong quá trình
trao đổi chất trong một thời gian nhất định nên được ứng dụng quan trọng trong kiểm soát

nồng độ đường trong máu người bệnh.
Các ứng dụng của Biosensor trong công nghệ thực phẩm cũng rất phát triển.Đột
phá quan trọng là khả năng khử trùng trong các quá trình lên men.Biosensor cũng đóng vai
trị quan trọng trong kiểm sốt trực tiếp chất lượng thực phẩm.
Mơi trường cũng cần có sự kiểm sốt chất lượng liên tục mà các kỹ thuật hóa lý
hiện tại thì giới hạn đặc biệt khi kiểm tra độ độc hại của môi trường.Biosensor ra đời đã
đáp ứng được những nhu cầu đó.
Nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc cải thiện tính nhạy cảm cũng như tính chọn
lọc của biosensor.Nhiều công ty Nhật Bản đã phát triển và sản xuất nhiều loại
biosensor.Năm 2000, thị trường về Biosensor đã được thành lập và tổ chức 2 năm một
lần.Tại đây tập trung các nghiên cứu phát triển biosensor trong nhiều lĩnh vực khác nhau
của các chuyên gia đầu ngành và có giải thưởng trao tặng.Điều này đã khẳng định sự phát
triển nhanh chóng của Biosensor.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1].

TRAN MINH CANH, Biosensor, Chapman & Hall

[2].

TRAN MINH CANH, BROUN G., Construction and study of electrodes using
cross – linked enzymes

[3] />