Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN TỪ RONG SỤN
KAPPAPHYCUS ALVAREZII
Lê Thị Mỹ Ngọc*, Nguyễn Thị Minh Chi, Nguyễn Phạm Cẩm Tiên,
Đinh Thị Huyền, Hoàng Thị Ngọc Nhơn
Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP. Hồ Chí Minh
*Tác giả liên lạc:
TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, tiến hành các nghiên cứu phương pháp kết tủa fucoidan
từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii), sau đó tinh sạch fucoidan bằng phương
pháp sắc ký trao đổi ion, thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
và ABTS, hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) và kháng mốc
(Aspergillus niger, Aspergillus flavus) từ các phân đoạn thu được. Các phân đoạn
được chọn khi qua sắc ký trao đổi ion có độ tinh sạch cao từ 49.02% - 61.14%.
Tổng hàm lượng fucoidan sau tinh sạch với hiệu suất thu hồi đạt 60.99%. Ngoài
ra, phân đoạn fucoidan sau sắc kí trao đổi ion cịn có hoạt tính kháng khuẩn
(Bacillus cereus, Escherichiacoli) với MIC là 380 μg/ml và kháng mốc
(Aspergillus niger, Aspergillus flavus) với MIC lần lượt là 680 μg/ml và 580
(μg/ml), khả năng bắt gốc tự do DPPH với IC50 đạt 303.51 (μg/ml), ABTS với
IC50 đạt 299.97 (μg/ml).
Từ khóa: Fucoidan, rong sụn, tinh sạch, hoạt tính sinh học.
RESEARCH FUCOIDAN FROM KAPPAPHYCUS ALVAREZII
Le Thi My Ngoc*, Nguyen Thi Minh Chi, Nguyen Phạm Cam Tien,
Dinh Thi Huyen, Hoang Thi Ngoc Nhon
Ho Chi Minh City University of Food Industry
*Corresponding Author:
ABSTRACT
In this study, the effects of prepitation fucowidan method were investigated

Kappaphycus alvarezii.
Fucoidan fractions which ere obtained after ion-exchange chromatography
purifications were tested the antioxidants activity by DPPH and ABTS, as well
as, antibacterial and antifungal activity. As a result, fractions which were
collected from ion-exchange chromatography had remarkable proportion of
purification from 49.02% - 61.14%, extraction yield was 60.99% for all fractions.
Moreover, fucoidan fractions also had an antibacterial (Bacillus cereus,
Escherichiacoli) and antifungal (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) activities
with the minimum inhibitory concentrations (MICs) were 380 μg/ml, 680 μg/ml
and 580 μg/ml, respectively. Antioxidant activies by ABTS method reached
299.97 ± 1.75 µg/ml (IC50 value), whereas DPPH free radical scavenging activity
with IC50 value was 303.51 ± 1.65 µg/ml.
Keywords: Fucoidan, kappaphycus alvarezii, purifications, biological activity.
TỔNG QUAN
Rong sụn thuộc ngành tảo đỏ đây là
lồi rong biển có giá trị kinh tế cao.

Trong rong sụn hàm lượng nước chiếm
77 - 91% cịn lại là phần trăm chất khơ.
Trong chất khô chứa chủ yếu là glucid,

559


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

protein, chất khóa ng, lipip, sắc tố,
enzim và cacbohydrat… Hàm lượng
cacbohydrate dao động từ 50-60% và
thường tập trung chủ yếu ở thành tế

bào gồm có cellulose và các loại đường
có hoạt tính sinh học (N. H. Dinh,
1991).Nhưng chưa có nhiều nghiên
cứu về cách khai thác các hợp chất quý
này. Fucoidan là một sulfate
polysacharide dị thể với thành phần
cấu tạo hết sức phức tạp. Fucoidan đầu
tiên được phân lập xác định là một
polysacharide có chứa L-fucose và Dxylose. Fucoidan là một hợp chất đa
dạng về công thức cấu tạo nên có nhiều
hoạt tính sinh học đáng được quan tâm
như: Kháng đông tụ máu, kháng huyết
khối, kháng virut, chống kết dính tế
bào, chống tạo mạch (antiangiogenic),
kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể
(anticomplementary), điều biến hệ
miễn dịch ( B. Li et al., 2008). Do đó,
fucoidan đã trở thành đề tài thu hút
được các nhà khoa học trên thế giới với
tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các
lĩnh vực như thực phẩm chức năng,
thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Rong sụn tươi (Kappaphycus
alvarezii) được thu nhận ở Khánh Hòa.
Rong được rửa sạch nhiều lần bằng
nước và loại bỏ các tạp chất bằng rây,
sấy đối lưu ở 600C, nghiền thành bột

bằng máy xay khô.
Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Dịch trích:
Cân 120g rong cho vào cốc và ngâm
với ethanol 80% trong 12 giờ. Trích ly
bã với dung môi HCl (1.38M) 1:40
(w/v), nhiệt độ 880C trong 3.5 giờ. Kết
tủa dịch trích 1 giờ với TCA ở nhiệt độ
lạnh, sau đó ly tâm 5000 vịng/phút
trong 15 phút loại tủa protein để thu
dịch trích ly fucoidan (C. K. Veena et

Kỷ yếu khoa học

al., 2008).
Khảo sát phương pháp kết tủa trước
tinh sạch fucoidan (T. Marudhupandi
et al., 2014):
Phương pháp 1: Kết tủa 1 giai đoạn,
tiến hành kết tủa fucoidan từ dịch trích
với ethanol 99%.
Phương pháp 2: Kết tủa 2 giai đoạn,
tiến hành kết tủa fucoidan với ethanol
99% để nồng độ cồn trong dung dịch là
30% (4 giờ), và 70% (12 giờ).
Khảo sát quá trình tinh sạch
fucoidan bằng phương pháp sắc kí
trao đổi ion
Thực hiện nhồi cội sắc ký trao đổi ion
với 3g DEAE – Cellulose, chỉnh tốc độ

dòng 5ml/10phút. Rửa giải lần lượt
bằng dung dịch đệm bổ sung NaCl. Ở
mỗi nồng độ NaCl tiến hành rửa giải
30ml, tăng nồng độ muối NaCl cao hơn
để tiếp tục quá trình rửa giải cho đến
nồng độ cuối. Các loại đệm được khảo
sát (tris-HCl, phosphate, acetate), nồng
độ muối rửa giải được khảo sát (0.5M;
1M; 1.5M; 2M). Fucoidan được thu
theo từng phân đoạn, mỗi phân đoạn
10ml.
Xác định hoạt tính kháng kháng
mốc, kháng khuẩn
Ống giống vi khuẩn/nấm mốc được
cấy chuyển vào môi trường TSA/PDA
để tạo ra các khuẩn lạc/mốc thuần
riêng rẽ. Dùng que cấy vô trùng lấy 1
khuẩn lạc/mốc hịa tan vào nước muối
sinh lý vơ trùng và trộn đều bằng máy
trộn Vortex, mật độ tế bào của dịch
huyền phù được xác định bằng phương
pháp đếm hồng cầu, điều chỉnh mật độ
tế bào trong dịch huyền phù đạt 106
CFU/ml. Hút 2ml dịch huyền phù chứa
vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml cho
vào mỗi đĩa thạch. Dùng que cấy trang
vô khuẩn, trang đều trên mặt thạch sao
cho vi khuẩn/nấm mốc khuếch tán đầy
trên mặt thạch. Để khô ở nhiệt độ
phịng trong 30 phút. Nhỏ 10 µl dịch

sau tinh sạch đã được pha loãng ở mỗi

560


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

nồng độ khác nhau vào đĩa thạch. Mỗi 0.0074x + 0.0059
nồng độ lặp lại 3 lần, các đĩa thạch Phương pháp xử lý số liệu: Mỗi thí
được ủ ở 320C/24h. Đường kính vùng nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần,
ức chế được đo bằng thước đo đơn vị kết quả được trình bày ở dạng giá trị
mm.
trung bình ± giá trị sai số. Kết quả được
Xác định hoạt tính kháng đơng máu tính tóa n bằng phần mềm Microft
Hoạt động chống đông của fucoidan Office Excel 2010 và phần mềm SPSS.
được xác định theo phương pháp USA Kết quả phân tích ANOVA với độ tin
pharmacopia: Hút 0.8 ml dung dịch cậy 95%, so sánh sự khác biệt giữa các
fucoidan qua DEAE phân đoạn 1M nghiệm thức qua phép thử LSD.
từng nồng độ (600, 500, 400µg/ml).
Hút 0.8 ml dung dịch natri heparin KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
chuẩn (0.7 đơn vị USP/0.8 ml) và 0.8 Kết tủa trước tinh sạch fucoidan
ml dung dịch muối 96% cho lần lượt Thực hiện trích ly fucoidan theo quy
vào từng ống nghiệm. Bổ sung thêm trình (mục 2.2.1) thu được dịch trích có
vào trong mỗi ống đã chuẩn bị trên 1 hàm lượng fucoidan 44.25 (µg/ml).
ml huyết tương và 0.2 ml dung dịch Hàm lượng và độ tinh khiết của
CaCl2 (1%). Đồng nhất hỗn hợp dung fucoidan có trong tủa thực hiện theo
dịch trong từng ống. Ghi lại các thời phương pháp 1 là 163.631 (µg/ml) và
gian máu được đơng.

phương pháp 2 là 191.378 (µg/ml).
Hàm lượng và độ tinh khiết fucoidan
Phương pháp phân tích
Thêm 1ml dung dịch fucoidan ở mỗi có trong tủa của phương pháp 2 (tủa 2
nồng độ vào ống nghiệm, làm lạnh ở giai đoạn) cao hơn phương pháp 1 (tủa
40C (2-3 phút). Thêm 4.5 ml acid 1 giai đoạn) (bảng 2.1). Tác giả
sunfuric (85%), đun sôi trong 10 phút, T.Marudhupandi và cộng sự (2014)
sau đó để nguội, thêm 0.3 ml acid cũng đã sử dụng phương pháp này
cysteine hydrochloric 0.1% vào ống trong nghiên cứu về fucoiddan trong
nghiệm, ủ trong bóng tối trong 2 giờ, rong biển (T. Marudhupandi et al.,
sau đó đo độ hấp thụ trên quang phổ kế 2014).
ở 396 nm và 430 nm. Mỗi thí nghiệm Hoạt tính kháng oxy hóa của
lặp lại 3 lần. Xác định hàm lượng fucoidan từ rong sụn
fucoidan có trong mẫu bằng phương Kết quả DPPH hoạt tính kháng oxy hóa
pháp đo quang phổ UV-VIS ở 390 nm của tủa fucoidan (chưa qua tinh sạch
và 430 nm, theo đường chuẩn y = bằng DEAE) được thể hiện tại Bảng 1.
Bảng 1. Kết quả thử hoạt tính của Fucoidan trong rong sụn theo phương pháp
DPPH, ABTS
Nồng độ (µg/ml)
Phương pháp DPPH
Phương pháp ABTS
39.38
15.91 ± 1.61
14.92± 3.81
78.77
27.61 ± 3.44
29.49± 6.99
157.54
42.15 ± 1.81
43.75± 5.38

315.08
57.02 ± 1.49
58.42 ± 4.32
630.13
69.97 ± 1.12
70.05 ± 1.71
IC50
IC50=303.51± 1.65 (µg/ml) IC50=299.97+ 1.75(µg/ml)
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của
fucoidan từ rong sụn

Kết quả xác định vòng kháng khuẩn
của dịch trích ly và sau tinh sạch

561


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

Kỷ yếu khoa học

fucoidan thể hiện qua Bảng 2.
Bảng 2. Kết quả đường kính vịng kháng khuẩn của dịch trích ly và dịch sau
tinh sạch fucoidan
Nồng độ Đường kính vịng kháng
Nồng
Đường kính vịng kháng
mẫu
khuẩn (mm)
độ mẫu

khuẩn (mm)
pha
pha
Dịch trích ly fucoidan
Dịch fucoidan tinh sạch
lỗng
lỗng
B.cereus
E.coli
B.cereus
E.coli
(µg/ml)
(µg/ml)
350
280
450
1.67
5,17
380
2.83
6.83
550
5.83
6.17
480
7.17
8.17
650
8.00
9.33

580
9.00
10.50
Từ Bảng 2, đối với E.coli, dịch chiết thì nồng độ 580 µg/ml ức chế tốt
fucoidan 650µg/ml cho đường kính Escherichia coli lẫn Bacillus cereus.
vịng vơ khuẩn lớn nhất (9.33mm). Đối Xác định thử hoạt tính kháng mốc
với loài vi khuẩn Bacillus cereus ở Kết quả thử hoạt tính kháng mốc của
nồng độ 650µg/ml, 550µg/ml, dịch trích ly và sau tinh sạch fucoidan
450µg/ml của dịch chiết sau 24 giờ thể hiện trong Bảng 3. Bảng 3 cho thấy
khảo sát và hiệu lực tương tự nhau với dịch fucoidan tinh sạch được cơ đặc có
kết quả đường kính từ 1.67-8mm. Với khả năng ức chế sự phát triển của các
các nồng độ 380µg/ml, 480µg/ml, loại nấm mốc Aspergillus niger và
580µg/ml sau 24 giờ khảo sát kết quả Aspergillus flavus. Nồng độ ức chế tối
đường kính ghi nhận được trải dài từ thiểu và đường kính vịng kháng khuẩn
2.83-9mm. Bacillus subtilis không bị của hai loại nấm mốc lần lượt là 680
ức chế mạnh bởi các loại cao chiết hay μg/ml, 11.17 mm và 580 μg/ml, 9mm.
dịch fucoidan tinh sạch so với Dịch fucoidan tinh sạch có hoạt tính
Escherichia coli. Điều này thấy các vi cao hơn dịch trích ban đầu (đường kính
khuẩn Gram âm khá nhạy cảm và dễ bị vòng kháng mốc) lớn hơn và dịch
ảnh hưởng từ các hiệu ứng kháng fucoidan tinh sạch có nồng độ thấp hơn
khuẩn hơn so với Gram dương. Như dịch trích ban đầu đã ức chế được sự
vậy, với cao chiết thì nồng độ 650 phát triển của nấm mốc.
µg/ml ức chế tốt, cịn với dịch tinh sạch
Bảng 3. Kết quả đường kính kháng nấm mốc của dịch fucoidan tinh sạch
Đường kính vịng
Đường kính vịng
kháng
nấm
(mm)
kháng nấm (mm)

Nồng độ
Nồng độ
mẫu pha
mẫu pha
Dịch fucoidan tinh
lỗng
lỗng
Dịch trích ly fucoidan
sạch
(µg/ml)
(µg/ml)
A.niger
A.flavus
A.niger
A.flavus
350
380
450
480
550
6
580
9
650
10
10
680
11.17
12.83

562


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018

KẾT LUẬN
Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, sắc
ký trao đổi ion có hiệu quả trong việc
tinh sạch fucoidan từ rong sụn đồng
thời tổng hàm lượng fucoidan thu được
sau tinh sạch khá cao. Ngoài ra dịch
fucoidan sau khi tinh sạch cịn có hoạt

Kỷ yếu khoa học

tính kháng khuẩn (B. cereus, E. coli) và
kháng mốc (A. niger, A. flavus), đồng
thời có khả năng chống oxy hóa. Như
vậy có thể thấy, rong sụn là một nguồn
nguyên liệu tiềm năng, giúp mở ra một
hướng đi mới trong việc ứng dụng vào
thực phẩm chức năng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
K. MARXEN, K. H. VANSELOW, S. LIPPEMEIER, R. HINTZE, A. RUSER,
AND U.P. HANSEN. Determination of DPPH radical oxidation caused by
methanolic extracts of some microalgal species by linear regression analysis
of spectrophotometric measurements. Sensors, vol. 7, no. 10, pp. 2080-2095,
2007.
R. RE, N. PELLEGRINI, A. PROTEGGENTE, A. PANNALA, M. YANG, AND

C. RICE-EVANS. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical
cation decolorization assay. Free radical biology and medicine, vol. 26, no.
9-10, pp. 1231-1237, 1999.
S. P. KAMBLE, R. B. GAIKAR, R. B. PADALIA, AND K. D. SHINDE.
Extraction and purification of C-phycocyanin from dry Spirulina powder
and evaluating its antioxidant, anticoagulation and prevention of DNA
damage activity. Journal of Applied Pharmaceutical Science, vol. 3, no. 8,
p. 149, 2013.
T. MARUDHUPANDI, T. A. KUMAR, S. L. SENTHIL, AND K. N. DEVI. In
vitro antioxidant properties of fucoidan fractions from Sargassum
tenerrimum. Pakistan Journal of Biological Sciences, vol. 17, no. 3, p. 402,
2014.

563