Vi khuẩn Bacillus sp. nội sinh phân lập từ cỏ mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu quả khả năng loại bỏ amoni trong nước nuôi tôm

Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 3: 359-369

Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 359-369
www.vnua.edu.vn

VI KHUẨN Bacillus sp. NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CỎ MẦN TRẦU (Eleusine indica)
CẢI THIỆN HIỆU QUẢ KHẢ NĂNG LOẠI BỎ AMONI TRONG NƯỚC NUÔI TÔM
Đỗ Quang Trung1*, Trần Thị Tuyết Thu2, Lưu Thế Anh1
1

Viện Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2

*

Tác giả liên hệ:

Ngày nhận bài: 03.08.2021

Ngày chấp nhận đăng: 21.01.2022
TÓM TẮT

Xử lý nước thải nuôi tôm bằng phương pháp sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm. Nghiên cứu này
được tiến hành nhằm sàng lọc các chủng Bacillus sp. chịu mặn và oxy hóa amoni để loại bỏ amoni trong nước thải
nuôi tôm. Trong nghiên cứu này, đã sàng lọc được 08 chủng Bacillus sp. từ các vi khuẩn nội sinh phân lập từ cỏ Mần
trầu. Hai chủng được lựa chọn là MT50 và MT51 có các đặc tính như: hiệu suất loại bỏ amoni cao (lần lượt là 80,36
và 82,24%), pH tối ưu là 7 và sinh trưởng tốt trong mơi trường có nồng độ muối cao (4% NaCl). Ngoài ra, hai chủng
này cũng cho thấy khả năng cải thiện nước thải ni tơm ở điều kiện phịng thí nghiệm. Thí nghiệm TN1 với 1%
huyền phù tế bào chủng MT51 cho thấy lượng amoni bị loại bỏ cao nhất (62,38%), trong khi kết quả của các nghiệm

thức khác không có ý nghĩa (P >0,05). Thí nghiệm TN2, cả 2 chủng Bacillus sp. đều loại bỏ amoni từ 72,25 và
78,85% ở ngày thứ 7. Thí nghiệm TN3, chủng MT51 cho hiệu quả loại bỏ amoni cao nhất với tỉ lệ bổ sung 1% huyền
phù tế bào ở ngày thứ 4 là 79,91%. Kết quả cũng cho thấy sự hình thành của nitrit và nitrat trong các thí nghiệm và
các chất này được loại bỏ bởi các chủng Bacillus sp. nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy 02 chủng Bacillus sp.
phân lập được có thể là lồi khử nitrat hiếu khí dị dưỡng.
Từ khóa: Loại bỏ amoni, nitrat hóa- phản nitrat hóa, vi khuẩn nội sinh, Bacillus sp. chịu mặn.

Bacillus sp. Isolated from Goose Grass (Eleusine indica) Enhances
the Removal Efficiency of Ammonium in Shrimp Aquaculture
ABSTRACT
Treatment of aquaculture wastewater by biological method is being more attractive to the scientists. This study
aimed to screen the salt-tolerant and ammonia-oxidizing Bacillus endophytic bacteria having potential to reduce
ammonium levels in shrimp aquaculture wastewater. In this study, eight Bacillus strains were screened from
endophytic bacteria isolated from gooose grass. Among these strains, two strains, MT50 and MT51 showed the
highest efficiency for ammonium removal (80.36 and 82.24%, respectively). They optimally grew at pH of 7 and in
highly salty condition (4% NaCl). Investigation in laboratory conditions for their ability in improving shrimp aquaculture
th
wastewater showed that both Bacillus strains had ammonium removal from 72.25 and 78.85% at day 7 . Notably,
strain MT50 in combination with unsterilized shrimp-wastewater presented the highest ammonium removal efficiency
th
(79.91%) with 1% cell suspension at day 4 . The results also showed the nitrite and nitrate production in all
experiments and these compounds were removed by the selected Bacillus species. Results suggested that tưo
Bacillus sp. isolated might be used as heterotrophic nitrification-aerobic denitrification species.
Keywords: Ammonium removal, Endophytic bacteria, Nitrification-denitrification, Salt-tolerant Bacillus.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Amoni là thành phæn tă nhiên cûa chu
trình nitĄ trong hệ sinh thái sinh ra t mt
lỵng ln thc ởn tha (Hmadhloo & cs., 2013).

Hp chỗt cha nit thõi ra mụi trỵng cú th tọo
ra cỏc vỗn nghiờm trng, chợng họn nhỵ hin
tỵng phỳ dỵng cỏc khu vc sụng v ven bin
(Hmadhloo & cs., 2013; Hong Phỵng H & cs.,
2016; Nguyn Hu ng & cs., 2019; Quyen &

359


Vi khuẩn Bacillus sp. nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu quả khả năng loại bỏ amoni
trong nước nuôi tôm

cs., 2020; Nguyen Thð Kim Anh & cs., 2021). Do
ú, vic x lý nỵc nuụi để giâm să tích tý
nhanh chóng cûa amoni trong ni trồng thûy
sân ngày càng trć nên quan trọng.
Quá trình sinh học sā dýng vi khuèn nitrat
hóa để biến đổi amoni thành nitrit và tiếp týc
chuyển nitrit thành nitrat là một trong cỏc
phỵng phỏp ang ỵc quan tồm. Trỵc ồy, vi
khuốn nitrat húa ỵc bit n nhiu nhỵ
Nitrobacter v Nitrosomonas (Zhang & cs.,
2012; Ren & cs., 2019). Tuy nhiên, các vi khuốn
ny cú tc tởng trỵng chờm v ớt cọnh tranh
hn khi so sỏnh vi cỏc vi khuốn d dỵng khác
(Ren & cs., 2019). Một trong nhĂng vi khuèn
hĀa hẹn ỵc s dýng loọi b amoni hoc x
lý nỵc thõi l Bacillus sp. do chỳng cú mt s
ỵu vit nhỵ tởng trỵng nhanh, cọnh tranh tt,
s dýng nhiu cacbon và nitĄ, chðu mðn và hình

thành nội bào tā (Manzo & cs., 2013; Meeboon
& Saimmai, 2019; Ren & cs., 2019). Ngoi ra,
mt c tớnh mong mun x lý nỵc lĉ và
nuôi trồng thûy sân biển là khâ nëng chðu mðn.
Vì vêy, việc phân lêp và hiểu rõ các đðc điểm
cûa Bacillus trong q trình nitrat hóa và phân
nitrat hóa l rỗt quan trng phỏt trin v
ng dýng chỳng vo x lý nỵc thõi.
Vi khuốn ni sinh l vi khuèn sống bên
trong các mô thăc vêt và không gây bệnh cho
vêt chû (Đỗ Quang Trung & cs., 2021). Chúng
đang ngy cng ỵc quan tồm hn so vi cỏc vi
khuốn khác vì đã phát triển nhiều lội cĄ chế
khác nhau vụ hiu húa tỏc ng cỷa cỏc chỗt
gõy ụ nhim chợng họn nhỵ s bin i cỏc chỗt
ụ nhim thành các däng ít độc hĄn và cơ lêp các
ion kim loäi trên bề mðt tế bào (Ijaz & cs.,
2015). Gổn ồy, nhiu vi khuốn ni sinh
(VKNS) ó ỵc phõn lờp t cỏc loi thc vờt
khỏc nhau v ỵc s dýng tởng hiu quõ
phõn hỷy cỏc chỗt ụ nhim trong nỵc thõi
(Shahid & cs., 2020; Ijaz & cs., 2015). Ijaz & cs.
(2015) đã sā dýng 3 dòng vi khuèn nội sinh
(Acinetobacter sp., Bacillus cereus và Bacillus
licheniformis) loäi bỏ hĄn 75% hm lỵng amoni
khi nỵc thõi trong 7 ngy. Do cỏc hoọt ng
phõn hỷy chỗt ụ nhim v thỳc ốy tởng trỵng
thc vờt, vi khuốn ni sinh rỗt cú trin vng i
vi mt s phỵng phỏp x lý nỵc thõi (Khan &
cs., 2013; Shahid & cs., 2020).

360

Cỏ Mæn træu (Eleusine indica) l loọi c ph
bin Vit Nam. Chỳng ỵc coi là lồi thăc vêt
siêu tích tý vì do có thể xā lý một số kim loäi
nðng (Tampubolon & cs., 2020). Ngoi ra, c
Mổn trổu ỵc bỏo cỏo cú th chu ỵc mn
khỏ cao (55 dS/m cỷa NaCl) (Wiecko, 2003). Cỏc
chỷng vi khuốn ni sinh ỵc phõn lờp t c
Mổn trổu ó ỵc chng minh cú tim nởng
trong kim soát sinh học bệnh thăc vêt (Đỗ
Quang Trung & cs., 2021). Do đó, mýc đích cûa
nghiên cĀu này là sàng lc cỏc chỷng vi khuốn
ni sinh ỵc phõn lờp t cỏ Mỉn trỉu có khâ
nëng chuyển hóa amoni, trong đó têp trung
phân lêp các chûng vi khuèn Bacillus sp. chðu
mðn v xỏc nh hiu quõ loọi b amoni trong
nỵc thõi nuôi tôm.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Tổng số 16 chỷng vi khuốn ni sinh ỵc
phõn lờp t c Mổn trỉu thu thêp tÿ tỵnh Bình
Thn, số chûng phân lêp ỵc t thõn, lỏ v r
lổn lỵt l 5; 5 và 6 (Đỗ Quang Trung & cs.,
2021). Các chûng này ỵc lỵu tr tọi Phũng thớ
nghim cỷa Vin Ti nguyờn v Mụi trỵng, 19
Lờ Thỏnh Tụng, Hon Kim, H Ni.
2.2. Húa cht

Tỗt cõ cỏc húa chỗt ỵc s dýng cho
nghiờn cĀu này bao gồm MgCl2; NaCl; K2PO4;
CaCO3; FeCl3; Na2COONa; NaHCO3 ỵc cung
cỗp bi cụng ty Merck - CHLB c v thọch cú
nhit núng chõy thỗp ỵc mua t hóng
Biobasic, Canada. Tỗt cõ húa chỗt cú tinh
khit t 99,0-99,9% sā dýng cho các phép phân
tích và phịng thí nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Sàng lọc vi khuẩn Bacillus
Các chûng vi khuốn ni sinh thc vờt ỵc
nuụi trong 10ml canh trỵng dinh dỵng cú b
sung 2% NaCl v mụi trỵng tëng sinh (peptone
5g, dðch chiết thðt bò 3g, muối biển 2g, thc ởn
cho tụm 1g v H2O 1.000ml). Canh trỵng ỵc
nuụi lớc 30C, 170 vũng/phỳt trong 24 gi. Mt


Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu, Lưu Thế Anh

mililit dch khuốn ỵc pha loóng trong ng
cha 9ml nỵc cỗt. Cỏc ng ny ỵc x lý trong
ni cỏch thỷy 80C trong 10 phỳt loọi b t
bo sinh dỵng v các chûng vi sinh không sinh
bào tā (Marquis & Bender, 1985). Sau ú, lỗy
0,1ml dch pha loóng trõi trờn thọch dinh dỵng
ỵc b sung 2% NaCl (Zhao & cs., 2017). Vi
khuốn cú c im nhỵ Gram dỵng, hỡnh que
v hỡnh thnh ni bo t ỵc chn lc v
chuyn sang mụi trỵng mi. Cỏc chỷng vi

khuốn Bacillus sp. tinh khit thu ỵc bỡng
cỏch lp lọi nhiu lổn trờn ùa thọch mi.
Chỷng vi khuốn cú mc oxy húa amoni
cao ó ỵc lăa chọn để giâi trình tă độn gen
16S rRNA: tách chiết bộ gen vi khuèn bìng bộ
kit cûa QIAgen, khuếch đäi trình tă bìng phân
Āng PCR vĆi cðp mồi có trỡnh t nhỵ sau 27F
(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) v 1492R
(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3). Phõn ng
PCR ỵc thăc hiện trong 50µl master mix bao
gồm: 25µl 2X Taq Master Mix (Biobasic
Canada); mỗi lội mồi nồng độ 10µm: 1,5µl; 11àl
nỵc cỗt (dH2O) v 1àl DNA t vi khuốn. Phõn
ng PCR gồm 35 chu kì bao gồm 2 giai độn
tiền biến tính: 95°C trong 5 phút; giai độn biến
tính 95°C trong 30 giây; giai độn bít cðp cûa
các mồi: 58°C trong 1 phút; giai đoän kéo dài
đoän khuếch đäi: 72°C trong 1 phút và giai đoän
kéo dài cuối: 72°C trong 10 phỳt. Cỏc sõn phốm
PCR ỵc in di trờn gel agarose 1% trong
dung dðch TBE 1X. Sā dýng 10µl sân phèm cho
vào tÿng giếng. Chäy điện di vĆi hiệu điện th
100V trong 25 phỳt. Kt quõ in di ỵc quan
sỏt bìng máy chýp ânh gel (Bio-Rad, Hoa Kì).
Độn khuếch đäi PCR cûa đoän gen 16S rRNA
cûa tÿng méu vi khuèn ỵc gi giõi trỡnh t tọi
hóng First Base (The Gemini, Singapore
Science Park II, Singapore). Cỏc trỡnh t
nucleotide hon chợnh ỵc so sánh vĆi ngân
hàng dĂ liệu GenBank cûa NCBI bìng cách sā

dýng công cý BLAST.
2.3.2. Đánh giá khả năng oxy hóa amoni
của các chủng Bacillus sp. phân lập được
Một ml chûng vi khuèn Bacillus sp. (mêt độ
tế bào khoâng 107 CFU/ml) ỵc chuyn vo mụi
trỵng dinh dỵng NB (peptone 5g, dðch chiết

thðt bò 3g, amoni sulfat 15g và H2O 1.000ml) v
ỷ 30C trong 7 ngy. Hm lỵng amoni ỵc
xỏc đðnh bìng kit Ammonium Test (ID 110024,
Merk). Sā dýng theo hỵng dộn kốm theo cỷa
b kit.
2.3.3. Th nghim c tớnh khử nitrat hóa
dị dưỡng
Các chûng Bacillus sp. (mêt độ tế bo
khoõng 107 CFU/ml) ỵc ỷ trong bỡnh tam giỏc
250ml cha 100ml mụi trỵng nitrat húa d
dỵng ((NH4)2SO4: 0,66g, natri succinat: 4,72g,
KH2PO4: 0,50g, Na2HPO4: 0,50g, MgSO4∙7H2O:
0,20g, NaCl: 20g và H2O 1.000ml) (Zhang & cs.,
2012). Quỏ trỡnh ỷ ỵc thc hin 30°C trên
máy líc quay ć tốc độ 160 vịng/phút trong 7
ngày. Nồng độ cûa nitĄ amoni (NH4+-N), nitrit
(NO2--N) và nitrat (NO3--N) ỵc xỏc nh vo
ngy th 7 (Lu & cs., 2012; Nguyn Hu ng
& cs., 2019).
Hm lỵng nitrate/nitrite ỵc xỏc nh
bỡng kit NITRITE/NITRATE, colorimetric
method (Merk); Hm lỵng amoni ỵc xỏc nh
bỡng kit Ammonium Test (ID 110024, Merk).

S dýng theo hỵng dén kèm theo cûa bộ kit.
2.3.4. Đánh giá nhu cầu muối và pH tối ưu
cho sự phát triển của các chng vi khun
thu c
Mt mililit huyn phự t bo ỵc nuụi cỗy
trong mt ng cú 10ml mụi trỵng dinh dỵng
NB. pH cỷa mụi trỵng NB iu chợnh cỏc
giỏ trð 3, 5, 7, 9 và 11. Thā nghiệm ânh hỵng
cỷa nng mui ỵc tin hnh cỏc nng
nhỵ sau 0, 1%, 2%, 3% v 4%. Cỏc ng nuụi cỗy
ỵc lớc vi tc 170 vũng/phỳt trong 24 gi.
Tc sinh trỵng cỷa Bacillus sp. ỵc xỏc
nh bỡng mêt độ quang học (OD) ć 600nm
(Seenivasagan & cs., 2017).
2.3.5. Chuẩn bị nước thải ni tơm
Bốn thí nghiệm về các loọi nỵc thõi tụm
khỏc nhau ó ỵc thit k. ỏnh giỏ õnh
hỵng cỷa cỏc vi sinh vờt cú sùn trong nỵc
thõi, nỵc thõi thớ nghim ỵc chia thnh x lý
tiệt trùng và khơng tiệt trùng. Trong mỗi lội
lội này, ỵc phõn chia tip thnh lờn men v

361


Vi khuẩn Bacillus sp. nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu quả khả năng loại bỏ amoni
trong nước nuôi tôm

không lên men để đánh giỏ õnh hỵng cỷa cỏc
chỗt dinh dỵng trong thc ởn đến hột tính

cûa các chûng nghiên cĀu. Đối vĆi các th
nghim lờn men, nỵc thõi nuụi tụm ỵc tng
hp bỡng cỏch lờn men 1% thc ởn thỵng
phốm cho tụm trong 3 ngy. Tng hp cỏc mộu
nỵc thõi nuụi tụm dựng trong thớ nghim ỵc
th hin trong bõng 1.
2.3.6. ỏnh giỏ hiệu quả loại bỏ amoni
Các chûng Bacillus sp. có hiệu quõ kh
amoni cao ỵc nghiờn cu khõ nởng loọi b nit
vụ c trong bn loọi nỵc thõi cỷa tụm ó chuèn
bð (Bâng 1). Huyền phù tế bào cûa các vi khuốn
Bacillus sp. ỵc nuụi qua ờm trong mụi trỵng
NB lng (mêt độ tế bào khoâng 107 CFU/ml).
Trong mỗi nghiên cĀu th nghim, huyn phự t
bo vi khuốn ỵc s dýng cõ 1% (50ml) v 5%

(250ml) trong 5l nỵc thõi ó chuốn b. Thớ
nghim C ỵc chuốn b ging nhỵ cỏc thớ
nghim khỏc nhỵng khụng cú thờm canh trỵng
vi khuốn. Tỗt cõ cỏc thớ nghim v i chng
(C) ỵc thc hin trong 7 ngy. Mộu nỵc thõi
ỵc lỗy mộu v kim tra nng amoni, nitrit
v nitrat theo phỵng phỏp o màu tiêu chuèn
vào ngày thĀ 4 và ngày thĀ 7 sau khi cỗy vi
khuốn (Nguyn Hu ng & cs., 2019).
2.3.7. Phõn tớch thng kờ
Cỏc s liu thớ nghim ỵc ỏnh giỏ bỡng
cỏc phỵng phỏp thng kờ phõn tớch bin lỵng
ANOVA (Analysis of Variance) một nhân tố, so
sánh các giá trð trung bỡnh theo chuốn Ducan.

Cỏc s liu ghi nhờn ỵc xā lí bìng Excel và
phỉn mềm Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS) phiên bân 19.

Bâng 1. Xử lý nước thâi từ ni tơm để nghiên cứu loại bỏ amoni
Thí nghiệm

Nước thải không trộn 1% thức ăn của tôm

Nước thải trộn 1% thức ăn của tôm

TN 1

Khử trùng (121°C, 15 phút)

Lên men (trong 3 ngày)

TN 2

Khử trùng (121°C, 15 phút)

Không lên men

TN 3

Không khử trùng

Lên men (trong 3 ngày)

TN 4

Không khử trùng

Khơng lên men

Ghi chú: Giá trị là trung bình ± độ lệch chuẩn (thanh sai số) cho ba lần lặp lại. Dấu sao cho thấy sự khác biệt có
ý nghĩa (P <0,05) về khả năng chuyển hóa amoni giữa các chủng (thử nghiệm Duncan).

Hình 1. Khâ năng oxy hóa amoni của các chủng Bacillus
trên mơi trường nitrat hóa dị dưỡng

362


Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu, Lưu Thế Anh

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc và xác định đặc điểm của vi
khuẩn Bacillus sp.
Kết quâ sàng lọc cho thỗy cú 08 dũng vi
khuốn ni sinh (VKNS) phõn lờp ỵc l vi
khuốn Bacillus sp. Trong ú cú 05 chỷng ỵc
phõn lờp t r (MT47, MT48, MT49, MT50 v
MT51); 02 chûng tÿ thân (MT52 và MT53) và 01
chûng tÿ lá (MT54).
Tỗt cõ 8 chỷng phõn lờp ỵc xỏc nh s b
khõ nởng kh nit (NH3, NO2- v NO3-) trờn mụi
trỵng nitrat húa d dỵng. Kt quõ cho thỗy, 2
chỷng phõn lêp là MT50 và MT51 có hiệu q
lội bỏ amoni cao hn 80% (lổn lỵt l 80,36 v

82,24%) (Hỡnh 1). HĄn nĂa, hai chûng này có thể
chuyển amoniac thành nitrit, nhỵng chợ tip týc
mc khỏ mọnh thnh nitrat. Hỡnh 2 cho thỗy
khõ nởng cỷa cỏc chỷng MT50 v MT51 tọo ra

lỵng nitrit lổn lỵt l 14,35 v 12,14 mg-N/L v
lỵng nitrat lổn lỵt l 5,13 v 4,05 mg-N/L.
Hai chỷng MT50 v MT51 ó ỵc xỏc nh
bỡng phỵng phỏp sinh hc phõn t. Kt quõ
ỵc trỡnh by trong bõng 2 cho thỗy chỷng
MT50 cú tỵng ng l 99% vi chûng
Bacillus velezensis (mã đðnh danh trên NCBI là
MN704466.1) và chûng MT5 ỵc xỏc nh l
Bacillus amyloliquefaciens (Mó nh danh trờn
NCBI l MG822731.1) vi tỵng ng l 99%.
Cỏc trỡnh t vựng gen 16S rRNA cỷa hai chỷng
ny ỵc lỵu tr trờn ngõn hng gen vi cỏc mó
s lổn lỵt l MZ484518 và MZ484519.
Các kết quâ nghiên cĀu chĀng tỏ hai chûng
vi khuèn nội sinh là MT50 và MT51 là hai
chûng vi khuốn d dỵng. Kt quõ ny chng
minh khụng cú s sai khỏc v khõ nởng d
dỵng gia chỷng Bacillus sp. nội sinh và
ngoäi sinh.

Ghi chú: Giá trị là trung bình ± độ lệch chuẩn (thanh sai số) cho ba lần lặp lại. Dấu sao cho thấy sự khác biệt có
ý nghĩa (P <0,05) về khả năng tạo nitrit và nitrat giữa các chủng (thử nghiệm Duncan).

Hình 2. Khâ năng tạo nitrit và nitrat
của các chủng Bacillus trên môi trường nitrat hóa dị dưỡng

Bâng 2. Kết quâ định danh chủng vi khuẩn phân lập được
Tên chủng VKNS
phân lập được

Tên chủng gần nhất
với chủng phân lập được

Điểm đạt
cao nhất

Tổng điểm

Tỷ lệ
trùng lặp

Mã số
trên NCBI

MT50

Bacillus velezensis

2.228

2.228

99%

MN704466.1

MT51

Bacillus amyloliquefaciens

2.113

2.113

99%

MG822731.1

363


Vi khuẩn Bacillus sp. nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu quả khả năng loại bỏ amoni
trong nước nuôi tôm

3.2. Nhu cầu muối và pH tối ưu đối với sự
phát triển của vi khuẩn Bacillus
Kt quõ cho thỗy 2 chỷng Bacillus sp. phõn
lờp ỵc có thể phát triển trong phổ rộng cûa
nồng độ muối tÿ 0-40 g/l NaCl (Hình 3a). Tuy
nhiên, khi nồng độ muối tëng dỉn thì mêt độ cûa
các chûng tế bào vi khn cüng giâm dỉn (Hình
3a). Bên cänh đó, 2 chỷng Bacillus sp. phõn lờp
ỵc cú s phỏt trin chờm pH 3-5. Chỳng phỏt
trin ti ỵu pH 7 v sau ú s tởng trỵng giõm
dổn t pH 9 đến pH 11 (Hình 3b).
Kết quâ nghiên cĀu về ânh hỵng cỷa pH

n s sinh trỵng v phỏt trin cỷa cỏc chỷng
Bacillus sp. phõn lờp ỵc cho thỗy chỳng phỏt
trin tt trong mụi trỵng cú pH ban ổu l 7.
Kt quâ này phù hĉp vĆi các kết quâ nghiên cĀu
về chỷng Bacillus sp. ó ỵc cụng b (Zhang &
cs., 2012; Sheela & cs., 2014; Ijaz & cs., 2015),
trong đó ć pH trung tớnh 7-8 l pH ti ỵu cho s
phỏt trin cỷa vi khuốn Bacillus sp. v trong mụi
trỵng hi kim cú li cho quỏ trỡnh nitrat húa d
dỵng cỷa vi khuèn Bacillus sp. (Mevel & Prieur,
2000). Thêm vào đó, kt quõ nghiờn cu cỹng cho
thỗy mụi trỵng cú tớnh axit (pH 5-6) hoðc kiềm
(pH 9-10) hän chế să phát triển cûa vi khuèn
Bacillus sp. Nhên đðnh này phù hĉp vĆi nhên
đðnh cûa Sheela & cs. (2014). Sheela & cs. (2014)
cho thỗy s phỏt trin cỷa cỏc loi Bacillus sp.
phõn lêp bð hän chế ć pH 6-6,5 và pH trên 8,5.
Trong nghiờn cu v õnh hỵng cỷa nng
mui n s sinh trỵng cỷa cỏc chỷng
Bacillus sp. phõn lờp ỵc cho thỗy l cõ hai
loi ny u chu mn vi phäm vi độ mðn rộng
(0-4% NaCl). Kết quâ này phù hĉp vĆi kết quâ
nghiên cĀu cûa Sutin (2010), trong đó tỏc giõ
cho thỗy phọm vi mn ú l cổn thit cho s
phỏt trin ti ỵu cỷa cỏc loi ven biển. Tuy
nhiên, kết quâ nghiên cĀu này có să sai khác vĆi
kết quâ nghiên cĀu cûa Mevel & Prieur (2000).
Tác giâ báo cáo rìng chûng Bacillus sp. MS 30
có độ mn sinh trỵng ti ỵu l 16 g/l NaCl, v
khụng thể phát triển khi độ mðn tëng lên

28,50 g/l NaCl. Să khác nhau này có thể do să
khác nhau về chỷng Bacillus sp. ỵc s dýng
trong nghiờn cu. Trong nghiờn cu ny, hai
chỷng MT50 v MT51 u ỵc phõn lờp tÿ cây

364

cỏ Mỉn trỉu thu tÿ vùng ven biển tỵnh Bình
Thn nên có tính kháng mðn cao và đðc tính
này l khỏc nhau gia cỏc chỷng phõn lờp ỵc
(Kearl & cs., 2019). Kt quõ nghiờn cu ny
cho thỗy tim nởng sā dýng cûa hai chûng vi
khuèn Bacillus MT50 và MT51 trong x lý nỵc
thõi ven bin v nuụi trng thỷy sân có chĀa độ
mðn cao.
3.3. Hiệu quâ loại bỏ amoni của Bacillus sp.
trong nước thâi nuôi tôm
3.3.1. Hiệu quả loại b amoni
Cõ hai chỷng Bacillus MT50 v MT51 u
cho thỗy khâ nëng lội bỏ amoni trong các thí
nghiệm khác nhau cỷa nỵc thõi nuụi tụm
(Bõng 1). Kt quõ cho thỗy, hiu suỗt loọi b
amoni khi nỵc thõi b õnh hỵng bi mt s
iu kin nhỵ chỷng ging vi sinh vờt, thąi gian
ni, să có mðt cûa các vi sinh vêt bõn a v s
lờn men cỷa mụi trỵng nuụi cỗy.
Trong kt quõ cỷa thớ nghim 1 (TN1) cho
thỗy nng vi khuốn ban ổu khụng õnh
hỵng nhiu n hiu suỗt chuyển hóa amoni.
Hỗn dðch tế bào 1% và 5% cûa câ 2 chûng MT50

và MT51 loäi bỏ amoni chêm ć ngày thĀ 4
(amoniac ban đæu là 3,56 ± 0,06 mg-N/L) và
tëng lên 55-62,38% cho đến ngày thĀ 7. Trong
khi đó, lỵng amoni b loọi b khụng cú ý nghùa
(P >0,05) tỗt cõ cỏc nghim thc i chng
(Hỡnh 4A).
Tuy nhiờn, trong thí nghiệm 2 (TN2) mêt độ
vi khn ban đỉu cho thỗy õnh hỵng rừ rng.
Kt quõ cho thỗy vi 1% huyền phù tế bào cûa
hai chûng MT50 và MT51 ó loọi b amoni lổn
lỵt vi hiu suỗt lổn lỵt là 72,25 và 78,85%
(amoniac ban đæu là 2,26 ± 0,07 mg-N/L) ć ngày
thĀ 4 và 7. Tuy nhiên, ć nồng 5% huyn phự
t bo ó cho thỗy kt quõ âm ć ngày thĀ 4.
Điều này có thể do việc b sung khi lỵng ln
cỏc vi khuốn ny ó tọo ra amoniac trong q
trình điều chỵnh cûa tế bào vi khuèn khi chuyển
sang các điều kiện mĆi. Sau đó, các t bo s
thớch ng vi nỵc thõi v biu hin khõ nởng
loọi b amoni (Hỡnh 4B). Nhỵ vờy, kt quõ thớ
nghim cho thỗy mờt t bo vi khuốn ban
ổu õnh hỵng rừ nột n hiu suỗt oxy húa
amoni cỷa chúng.


Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu, Lưu Thế Anh

(A)

(B)

Ghi chú: Các giá trị là giá trị trung bình ± SD (thanh sai số) cho ba lần lặp lại.

Hình 3. Biểu đồ sinh trưởng
của các chủng vi khuẩn Bacillus dưới các độ mặn (A) và pH (B) khác nhau

Ghi chú: A: TN1; B: TN2; C: TN3; D: TN4.
Giá trị là giá trị trung bình ± SD (n = 3). Giá trị với các ký tự khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa
(P <0,05) về khả năng loại bỏ amoni giữa các chủng (thử nghiệm Duncan).

Hình 4. Hiệu quâ loại bỏ amoni của các chủng Bacillus sp. phân lập được

365


Vi khuẩn Bacillus sp. nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu quả khả năng loại bỏ amoni
trong nước ni tơm

Bên cänh đó, trong thí nghim 3 (TN3) cho
thỗy õnh hỵng cỷa cỏc chỷng vi khuèn đến khâ
nëng loäi bỏ amoni. Chûng MT51 (vĆi 1% huyền
phù tế bào) thể hiện khâ nëng loäi bỏ amoni
nhanh chúng ngy th 4 (hiu suỗt l 79,91%),
trong khi chỷng MT50 cho thỗy hiu quõ vi 5%
huyn phự t bào ć ngày thĀ 4 là 72,89%
(Hình 4C). Kết quâ này có thể do các vi sinh vêt
bân đða trong nỵc thõi ó cú tỏc ng tỵng h
n hoọt ng lội bỏ amoni cûa các chûng vi
khn MT50 và MT51.
Thí nghim 4 (TN4) cho thỗy hiu quõ loọi

b amoni tng th (53,29-76,42%) thỗp hn cỏc
thớ nghim khỏc (lỵng amoni ban ổu l
1,19 0,02 mg-N/L). Cỏc kt quõ khụng cho
thỗy s õnh hỵng cỷa mờt t bo ban ổu
v thi gian x lý n hiu suỗt loọi b amoni
(P >0,05) (Hình 4D).
Ngồi ra, kết q lội bỏ amoni cûa thớ
nghim 3 (TN3) cỷa tỗt cõ cỏc chỷng Bacillus sp.
cho hiệu quâ cao hĄn các thí nghiệm khác. Thí
nghiệm TN3 dựng nỵc thõi nuụi tụm thụ, khụng
ỵc kh trựng; do ú cỏc vi khuốn bõn a cú
sùn trong nỵc thõi có thể tham gia vào q
trình lội bỏ amoni (Ongsara & cs., 2012). HĄn
nĂa, thĀc ën nuôi tôm lên men giõi phúng cỏc
hp chỗt hu c lm chỗt dinh dỵng cung cỗp
cho s sinh trỵng v phỏt trin cỷa vi khuốn.
S kt hp gia cỏc chỷng Bacillus sp. phõn lờp
ỵc trong nghiên cĀu này và các vi sinh vêt bân
đða là să hiệp đồng về khâ nëng loäi bỏ amoni.
Các kết quâ này chĀng tỏ khâ nëng loäi bỏ amoni
trong nỵc thõi nuụi tụm nu chợ dựng cỏc chỷng
Bacillus l kém hĄn so vĆi să hĉp tác cûa chúng
vĆi các vi sinh vờt cú sùn trong nỵc thõi.
Nghiờn cu ny ó cho thỗy hiu suỗt oxy
húa amoni b õnh hỵng bi cỏc yu t nhỵ
chỷng vi khuốn, iu kin mụi trỵng (lờn men
v kh trựng) v ớt b õnh hỵng bi lỵng dch
khuốn ban ổu dựng cho thớ nghim. Trong iu
kin khụng kh trựng v mụi trỵng ỵc lờn
men cho hiu suỗt loọi b amoni cao nhỗt cho cõ

hai chỷng MT50 và MT51.
3.3.2. Hiệu quả loại bỏ nitrit và tạo
thành nitrat
Nng nitrit ban ổu cỷa nỵc thõi nuụi
tụm ỵc duy trỡ mc thỗp (<1 mg-N/L). Tuy

366

nhiờn, lỵng NO2 trong cỏc thớ nghim ỵc tọo
ra v loọi b trong quá trình û nhą sā dýng các
chûng vi khuèn phân lờp ỵc (Hỡnh 5A v 5B).
Trong iu kin tit trựng v khụng lờn men
(thớ nghim TN2) cỹng nhỵ trong iu kiện
khơng tiệt trùng và lên men (thí nghiệm TN3),
câ hai chûng MT50 và MT51 đều biểu hiện khâ
nëng loäi bỏ nitrit vi hiu suỗt cao (80-83%) so
vi i chng. Kt quõ cho thỗy s lờn men hay
khụng lờn men thc ởn cú õnh hỵng khụng
ang k n khõ nởng loọi bỏ nitrit cûa hai
chûng MT50 và MT51. Mðt khác, kết quõ cỷa
thớ nghim i chng trong TN2 cho thỗy khõ
nởng tọo thnh v loọi b nitrit rỗt thỗp trong
khi kt quõ i chng TN3 cho thỗy khõ nởng
tọo thnh và lội bỏ nitrit khá cao (không
29%). Điều này chĀng t vic tit trựng cú õnh
hỵng n mờt ban ổu cỷa cỏc vi sinh vờt
trong nỵc thõi v cỏc t bo vi sinh vờt sng
trong nỵc thõi thụ úng mt vai trũ nhỗt nh
trong vic loọi b nitrit trong nỵc thõi.
Bờn cọnh khõ nởng loọi b nitrit, khõ nởng

tọo nitrat cỷa cỏc chỷng Bacillus sp. cỹng ỵc
quan tõm (Hỡnh 5C v 5D). Kt quõ thớ nghim
TN1 cho thỗy khõ nởng loọi b nitrat cao nhỗt
cỷa chỷng MT50 l 81,30% ć ngày thĀ 7 (5%
huyền phù tế bào), trong khi chỷng MT51 cho
thỗy khõ nởng loọi b nitrat cao nhỗt (81,12%) ć
ngày thĀ 4 (5% huyền phù tế bào) (Hình 5c).
Thêm vào đó, việc lội bỏ nitrat trong thí
nghiệm TN3 cho thỗy mờt cỷa chỷng vi
khuốn cỹng õnh hỵng ỏng k n khõ nởng
loọi b nitrat trong mụi trỵng (Hình 5d). Các
kết quâ chĀng tỏ să hình thành và loäi bỏ nitrat
phý thuộc vào chûng vi sinh vêt và mêt độ ban
đỉu cûa chúng. Ngồi ra, kết q thí nghim i
chng (C) cho thỗy khụng cú s khỏc bit
nhiu giĂa TN1 (Hình 5C) và TN3 (Hình 5D)
chĀng tỏ các vi sinh vờt bõn a cú sùn trong
nỵc thõi ớt õnh hỵng n khõ nởng loọi b
nitrat cỷa hai chỷng MT50 và MT51.
ThĀc ën cûa tôm chû yếu bao gồm protein và
phốt pho (Hmadhloo & cs., 2013). NhĂng thĀc ën
này s giõi phúng cỏc hp chỗt nit v pht pho
phýc vý cho vi khuèn Bacillus sp. và các vi
sinh vêt khác (Mclntosh & cs., 2001;
Dechmahitkul & cs., 2007). Do ú, trong nỵc
thõi nuụi tụm khụng ỵc kh trựng cỏc vi sinh


Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu, Lưu Thế Anh

vêt cú sùn trong nỵc thõi ó tham gia phồn hỷy
cỏc chỗt hu c v vụ c (O-Thong & cs., 2003).
Cỏc chỷng Bacillus sp. l vi khuốn nitrat húa d
dỵng, loọi bỏ amoni hiệu q và q trình nitrat
hóa ít phĀc tọp hn vi khuốn t dỵng (Sheela &
cs., 2014). Do ú, Bacillus sp. d dỵng cú th cú
tim nởng ng dýng cao trong x lý nỵc thõi
nuụi trng thỷy sõn. Trong nghiên cĀu này, các
phân lêp Bacillus sp. đều dén đến q trình
nitrat hóa hiếu khí. Yang & cs. (2011) cho rỡng
NO2- ỵc chuyn thnh NO3- bỡng quỏ trỡnh
nitrat húa v nitrat cú th tip týc ỵc chuyn
thnh nit t do trong các phân Āng khā nitĄ
hiếu khí bći vi khuốn nitrat húa d dỵng. Trong
nghiờn cu ny, hai chỷng Bacillus sp. cho thỗy
c im loọi b amoni cỹng nhỵ khâ nëng
chuyển amoni thành nitrit. HĄn nĂa, chúng có

thể lội b v bin i nitrit thnh nitrat cỹng
nhỵ loọi b nitrat. Tuy nhiên, cỉn phân tích
thêm khí nitĄ tă do tÿ nitrat trong hệ thống vên
hành để cûng cố kết luên này.

4. KẾT LUẬN
Hai chûng vi khuèn nội sinh MT50 v
MT51 phõn lờp t c Mổn trổu ỵc xỏc nh
lổn lỵt l chỷng Bacillus velezensis MT50 (mó
Genbank
MN704466.1)
v

Bacillus
amyloliquefaciens
MT51
(mó
Genbank
MG822731.1) cú khõ nởng loäi bỏ amoni hiệu
quâ cao và chðu mðn đến 4% NaCl. Thêm vào
đó, hai chûng MT50 và MT51 có khâ nởng
nitrat húa d dỵng nờn cú khõ nởng ng dýng
trong xā lý ao nuôi tôm.

Ghi chú: A: TN2; B: TN3; C: TN1; D: TN3.
Giá trị là giá trị trung bình ± SD (n = 3). Giá trị với các ký tự khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa
(P <0,05) về khả năng loại bỏ nitrit và nitrat giữa các chủng (thử nghiệm Duncan).

Hình 5. Hiệu quâ loại bỏ nitrit (A-B) và
nitrat (C-D) của các chủng Bacillus sp. phân lập được

367


Vi khuẩn Bacillus sp. nội sinh phân lập từ cỏ Mần trầu (Eleusine indica) cải thiện hiệu quả khả năng loại bỏ amoni
trong nước nuôi tôm

LỜI CẢM ƠN
Nghiên cĀu này ỵc tin hnh trong
khuụn kh ti QG.21.60 Nghiờn cu sàng lọc
vi khuèn nội sinh thăc vêt có khâ nëng oxy húa
amoni nhỡm nh hỵng ng dýng trong cụng
ngh bói lọc sinh học” cûa Đäi Học Quốc Gia

Hà Nội.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Charoendat U., Chumchareon M. & Phumee P. (2016).
Effects of Creat (Andrographis paniculata Wall.
Ex Nees) extract on growth performance and
bacterial disease resistance in Pacific White
Shrimp (Litopenaeus vannamei Boone). RMUTSV
Research Journal. 8(2): 190-202.
Dechmahitkul W., Youkong C., Poomputra K.,
Akeprathumchai S. & Mekvijitsaeng P. (2007).
Study on media formulation and production
process of Bacillus subtilis spores for animal
probiotics. KMUTT Research and Development
Journal. 30(2): 251-259.
Đỗ Quang Trung, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đinh Mai
Vân, Phạm Bích Ngọc, Trần Thị Hằng, Lưu Thế
Anh & Phí Quyết Tiến (2021). Khả năng đối kháng
của vi khuẩn nội sinh từ cỏ Mần trầu với vi nấm
gây bệnh thối ngọn cành trên thanh long
(Hylocereus undatus). Tạp chí Khoa học: Cơng
nghệ và Khoa học Tự nhiên. 37(2): 60-69.
Hoàng Phương Hà, Nguyễn Quang Huy & Hoàng Thị
Yến (2016). Nghiên cứu một số điều kiện thích
hợp cho sinh trưởng và tạo biofilm của các chủng
vi khuẩn khử nitrate. Tạp chí Cơng nghệ sinh học.
14(1): 191-196.
Hmadhloo S., Tanyaros S. & Phumee P. (2013). Effect
of C : N ratio in integrated culture of White Shrimp
(Litopenaeus vannamei) and Nile Tilapia

(Oreochromis niloticus) using biofloc technology.
RMUTSV Research Journal. 5(1): 96-106.
Ijaz A., Shabir G., Khan Q.M. & Afzal M. (2015).
Enhanced remediation of sewage effluent by
endophyte-assisted floating treatment wetlands.
Ecological Engineering. 84: 58-66.
Khan S., Afzal M., Iqbal S. & Khan Q.M. (2013).
Plant–bacteria partnerships for the remediation of
hydrocarbon contaminated soils. Chemosphere.
90: 1317-1332.
Kearl J., McNary C., Lowman J. S., Mei C., Aanderud
Z. T., Smith S. T., West J., Colton E., Hamson M.
& Nielsen B. L. (2019). Salt-Tolerant Halophyte
Rhizosphere Bacteria Stimulate Growth of Alfalfa
in Salty Soil. Front Microbiol. 10:1849.

368

Lu Y., Wang X., Liu B., Liu Y. & Yang X. (2012).
Isolation and characterization of heterotrophic
nitrifying strain W1. Chinese Journal of Chemical
Engineering. 20(5): 995-1002.
Manzo N, Luccia D. B., Isticato R., Apuzzo D. E.,
Felice D. M. & Ric E. (2013). Pigmentation and
sporulation are alternative cell fates in B. pumilus
SF214. PlosOne. 8(4): 1-12.
Marquis E. R. & Bender G. R. (1985). Mineralization
and heat resistance of bacterial spores. Journal of
Bacteriology. 161(2): 789-791.
Mclntosh D., Samocha T. M., Jones E. R., Lawrence A.

L., Horowitz S. & Horowitz A. (2001). Effects of
two commercially available low-protein diets (21%
and 3%) on water and sediment quality on the
production Litopenaeus vannamei in an outdoor
tank system with limited water discharge.
Aquaculture Engineering. 25(2): 69-82.
Meeboon N. & Saimmai A. (2019). Characterization of
biosurfactant produced by Bacillus subtilis AS6
isolated from mangrove sediment in Phuket
province. Rajamangala University of Technology
Srivijaya Research Journal. 11(1): 67- 83.
Mevel G. & Prieur D. (2000). Heterotrophic
nitrification by a thermophilic Bacillus species as
influenced by different culture conditions.
Canadian Journal of Microbiology. 46(5): 465-473.
Nguyễn Hữu Đồng, Nguyễn Thị Việt, Đinh Thị Thu
Hằng, Phan Đỗ Hùng, Nguyễn Quang Lịch & Trần
Hòa Duân (2019). Khả năng nitrat hóa amoni của
chủng vi khuẩn Pseudomoonas aeruginosa HT1
phân lập từ nước thải sau biogas của trang trại chăn
nuôi lợn ở Hà Tĩnh. Tạp chí Khoa học Đại học
Huế: Nơng nghiệp và Phát triển nông thôn.
128(3C): 119-132.
Nguyen Thi Kim Anh, Nguyen Thi Tram Anh, Chuong
T.P.N Bui, Curtis Jolly, Nguelifack & Brice
Merlin. (2021). Shrimp farmers risk management
and demand for insurance in Ben Tre and Tra Vinh
Provinces in Vietnam. Aquaculture Reports.
19: 100606.
Ongsara N., Sungpud J. & Liamtong S. (2012).

Microbiological quality of drinking water at
Nakhon Si Thammarat Rajabhat University.
Wichcha Journal Nakhon Si Thammarat Rajabhat
University. 31(2): 11-21.
O-Thong S, Jiapakdee R. & Intrasungkha N. (2003).
Wastewater generated from marine shrimp feed
and its treatment potential by internal filter system.
Thaksin University Journal. 6(1): 41-53.
Quyen N. T. K., Hien H. V., Khoi L. N. D., Yagi N. &
Karia Lerøy Riple A. (2020). Quality management
practices
of
intensive
whiteleg
shrimp
(Litopenaeus vannamei) farming: A study of the
Mekong Delta, Vietnam. Sustainability. 12: 4520.


Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu, Lưu Thế Anh

Ren J., Wei C., Ma H., Dai M., Fan J., Liu Y., Wu Y.
& Han R. (2019). The Nitrogen-Removal
Efficiency of a novel high-efficiency salt-tolerant
aerobic denitrifier, Halomonas Alkaliphile HRL-9,
isolated from a seawater biofilter. International
Journal of Environmental Research and Public
Health. 16(22): 4451.
Sheela B., khasim beebi S. & Yellaji rao O. (2014).
Bioremediation of ammonia using ammonia

oxidizing bacteria isolated from sewage.
International
Journal
of
Environmental
Bioremediation & Biodegradation. 2(4): 146-150.
Seenivasagan R., Kasimani R., Babalola O. O.,
Karthika A., Rajakumar S. & Ayasamy P. M.
(2017). Effect of various carbon source,
temperature and pH on nitrate reduction efficiency
in mineral salt medium enriched with Bacillus
weinstephnisis
(DS45).
Groundwater
for
Sustainable Development. 5: 21-27.
Shahid M., Al-surhanee A., Kouadri F., Ali S., Nawaz
N., Afzal M., Ali B. & Soliman M. (2020). Role of
microorganisms in remediation of wastewater in
floating
treatment
wetlands:
A
review.
Sustainability. 12.

Tampubolon K., Zulkifli T. B. H., & Alridiwirsah A.
(2020). Review of Eleusine indica Weed as Heavy
Metals
Phytoremediator.

Agrinula:
Jurnal
Agroteknologi Dan Perkebunan. 3(1): 1-9.

Sutin S. (2010). Water quality of mullet (Liza
oligolepis, Bleeker, 1985) at Nakhon Si
Thammarat bay, Nakhon Si Thammarat province.
Wichcha Journal Nakhon Si Thammarat Rajabhat
University. 29(2): 58-63.

Zhao C., Yan X., Yang S. & Chen F. (2017). Screening
of Bacillus strains from Luzhou-flavor liquor
making for high-yield ethyl hexanoate and lowyield propanol. Food Science and Technology.
77: 60-66.

Usawakesmanee N. (2016). The Use of dried water
hyacinth as a feed supplement for rearing Silver
barb (Puntius gonionotus). Wichcha Journal
Nakhon Si Thammarat Rajabhat University.
35(1): 70-78.
Wiecko G. (2003). Ocean water as a substitute for post
emergence herbicides in Tropical turf. Weed
Technology. 17: 788-791.
Yang X.P., Wang S.M., Zhang D.W. & Zhou L.X.
(2011).
Isolation
and
nitrogen
removal
characteristics of an aerobic heterotrophic

nitrifying-denitrifying bacterium, Bacillus subtilis
A1. Bioresource Technology. 102(2): 854-862.
Zhang Q.L., Liu Y., Ai G.M., Miao L.L., Zheng H.Y.
& Liu Z.P. (2012). The characteristics of a novel
heterotrophic nitrification–aerobic denitrification
bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7.
Bioresource Technology. 108: 35-44.

369