tóm tắt luạn án tiến sĩ nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn escherichia coli (nhóm vtec) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại hà nội
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (713.15 KB, 27 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ESCHERICHIA COLI
: 62 62 50 10
- 2012
Phn bin 1:
Phn bin 2:
Phn bin 3:
phút, ngày tháng
-
-
1
1
Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO)
có khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đó phần lớn xảy ra
tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh. Năm 2010, cả nước
xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người mắc và 42 trường hợp tử
vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và nghỉ làm việc khoảng 8 triệu
USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101].
Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm
ở người (Salmonella, E. coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium botulism ),
những năm gần đây, các vi khuẩn E. coli thuộc nhóm Verotoxigenic (VTEC)
ngày càng được biết đến như là một trong những tác nhân quan trọng.
Verotoxigenic E. coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi khuẩn E. coli có khả
năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin.
Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E. coli đã bùng phát tại
Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác. WHO cho biết, trên phạm
vi toàn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành HUS; con số tử
vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1 trường hợp ở Thụy
Điển. Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau quả bị nhiễm E. coli
O104. Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới nền kinh tế thuộc liên minh châu Âu
(EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại đây thất thu 200 triệu euro (tương
đương 290 triệu USD).
Việc xác định chính xác loại vi khuẩn thuộc nhóm này là rất cần thiết, do
mối nguy hại của vi khuẩn này liên quan đến các nạn dịch tiêu chảy trầm trọng ở
người và khả năng truyền lây bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc
động vật. Hiểu biết về các đặc tính của vi khuẩn Verotoxigenic E. coli ở các loài
động vật nuôi (bò, lợn…) làm thực phẩm cho con người hoặc trong các loại thực
phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh
báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp.
Để có được những hiểu biết về vi khuẩn này trong thực trạng giết mổ và
chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC)
phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ”
2
- Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò,
lợn tại điểm giết mổ.
2
- Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản
phẩm thịt tươi.
3
- Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn E. coli
nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được một
số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn.
- Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống của
đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở mức độ
phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC.
- Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực
phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh
báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp.
4
- Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính của
vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản phẩm
thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội.
- Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn
nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam.
- Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực cao
của vi khuẩn E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có
nguồn gốc khác nhau.
Cấu trúc luận án gồm 131 trang: Mở đầu 4 trang; Chương 1 Tổng quan tài
liệu 40 trang; Chương 2 Nội dung, nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
12 trang; Chương 3 Kết quả và thảo luận 50 trang; Kết luận và đề nghị 2 trang;
Các công trình đã công bố có liên quan 1 trang; Tài liệu tham khảo 15 trang gồm:
10 tài liệu trong nước, 90 tài liệu nước ngoài, 1 trang web; Phụ lục 7 trang.
Luận án có 25 biểu bảng, 23 hình ảnh minh họa.
1.1 E. coli
E. coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae.
Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới kính
hiển vi thường thấy đứng riêng hoặc thành đôi. E. coli là vi khuẩn thường thấy
trong đường tiêu hóa của người và động vật.
3
Trong những năm gần đây, các chủng E. coli gây tiêu chảy được chia thành ít
nhất 5 nhóm. Đó là E. coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic E. coli) - sản sinh
độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột (EIEC - Entero invasive
E. coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột, E. coli gây bệnh tích ruột (EPEC
- Enteropathogenic E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô và gây bệnh
tích bám dính và xâm nhập (Attaching and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết
(EaggEC - Enteroaggregative E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô nhờ
một cơ quan giống lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột. Nhóm cuối
cùng là VTEC gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm
tiểu cầu ở người. Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có
khả năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ. Nhưng khi phát
hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố
bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC.
1.1.1 Phân loại E. coli
Vi khuẩn E. coli được phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm
có kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar) và kháng
nguyên giáp mô K (Capsular) (Lior, 1996) [53].
1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E. coli
E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 2 - 3 x 0,6 µm. Vi
khuẩn bắt màu Gram âm. E. coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện. Nhiệt
độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 37
0
C, pH thích
hợp là 7,4. Vi khuẩn E. coli phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường:
thạch thường, nước thịt, thạch máu, MacConkey, Simmon citrate, Endo, EMB, SS
Vi khuẩn E. coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại đường như:
Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose. Lên men
không chắc chắn với các loại đường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin. Các phản
ứng: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP, Urease, H2S âm tính.
1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC)
Trong số E. coli có khả năng gây tiêu chảy, VTEC được xem là một nhóm
quan trọng gây tiêu chảy có lẫn máu ở người (Levent Akkaya và cs. 2006) [52].
1.2.1 Danh pháp
SLTEC (Shiga-like toxin-producing Escherichia coli) và STEC (Shiga
toxin-producing Escherichia coli) là những tên gọi khác của VTEC.
1.2.2 Độc lực
Nhìn chung, ngoại độc tố VT được coi là yếu tố độc lực của VTEC. Tuy
nhiên, sự có mặt của riêng độc tố VT có thể không đủ gây ra bệnh, những yếu tố
4
được cho là độc lực khác có thể đóng một vai trò nào đó. Một số yếu tố có liên
quan đến khả năng bám dính của VTEC với tế bào biểu mô ruột, gây nên bệnh
tích A/E. Trong những yếu tố này có plasmid 60-Mda, mã hóa cho lông roi bám
dính - một loại protein màng ngoài (OMP - Outer membrane protein), có yếu tố
intimin do gen eae quy định tổng hợp.
1.2.3 Vai trò của VTEC không thuộc nhóm O157
Mặc dù triệu chứng của các bệnh nghiêm trọng ở người như HC và HUS hầu
hết đều liên quan đến các chủng O157 (Beutin và cs. 1994) [19], vẫn còn một số
trường hợp bệnh lẻ tẻ do các chủng không thuộc nhóm O157 gây ra. Năm 1992, ở
Italia, O111: H
-
đã gây ra nhiều ca bệnh HUS. Ở Úc, báo cáo ca bệnh HUS đầu
tiên do VTEC gây ra là vào năm 1987. Kiểm tra mẫu phân, các bác sỹ đã phân lập
được chủng E. coli O111: H2. Pryor và cs. (1990) [76] phân lập được O111 từ các
bệnh nhân bị HC. Chủng O111 trở thành nguyên nhân gây HC và HUS chủ yếu ở
Úc. Nhiều chủng không thuộc nhóm O157 có nhiều yếu tố độc lực như sản sinh
độc tố VT, gen eae, plasmid EHEC và độc tố gây xuất huyết ruột. Do vậy, nhiều
vi khuẩn không thuộc nhóm O157 nhưng vẫn gây bệnh.
1.2.4 VTEC ở động vật
Carlton (2004) [24] cho rằng tỷ lệ VTEC ở động vật dao động khoảng 6% -
100%. Thông thường, E. coli O157 có thể được tìm thấy trong đường tiêu hóa
của một số loài như trâu bò, cừu, gia cầm, trong đó trâu bò đóng vai trò là nguồn
tàng trữ chính (Levent Akkaya và cs. 2006) [52].
Có nhiều nghiên cứu về VTEC ở động vật được tiến hành, 60% các chủng
VTEC không thuộc nhóm O157 phân lập từ trâu bò có khả năng gây bệnh cho
người, đặc biệt các bệnh nặng như viêm ruột xuất huyết và hội chứng huyết niệu.
1.2.5 VTEC trong thực phẩm
Có nhiều vụ dịch do VTEC đã xảy ra ở nhiều quốc gia, trong đó nguyên nhân
chính là do sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm, chủ yếu là các thực phẩm có nguồn gốc
từ bò. Sự có mặt của VTEC trong thực phẩm đã được khẳng định ở nhiều quốc gia.
1.2.6 Nhiễm VTEC ở người
VTEC, đặc biệt chủng O157:H7 được khẳng định có khả năng gây một số
bệnh nghiêm trọng ở người, thường gây chết. Trẻ em, người già và người suy
giảm miễn dịch là những đối tượng dễ bị nhiễm nhất. Số bệnh nhân bị HUS
chiếm 12% các ca nhiễm VTEC. Tỷ lệ chết là 4%.
1.3 E. coli
Các báo cáo về các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E. coli gây ra tại
5
Việt Nam cũng đã được công bố. Năm 2004, (Thi Thu Thao Van, 2007) [89] phát
hiện trên 90% các mẫu thịt và hải sản chứa E. coli, nhưng chưa xác định được cụ
thể là loại E. coli nào. Các nghiên cứu về vi khuẩn E. coli và bệnh do chúng gây
ra ở gia súc (lợn, bê) cũng đã được nhiều tác giả tập trung nghiên cứu, nhưng các
công trình này chủ yếu đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn thuộc nhóm
Enterotoxigenic E. coli (Đỗ Ngọc Thúy 2004) [8].
1.4
1.4.1 Phương pháp vi sinh vật
Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy trực tiếp nhằm phân lập nhanh VTEC dựa trên
hiện tượng dung huyết đã được báo cáo. Phương pháp này có sự chính xác cao vì
90% VTEC được kiểm tra đều gây dung huyết.
1.4.2 Phương pháp miễn dịch học
Đã có một số phương pháp miễn dịch để phân lập VTEC như ELISA, miễn
dịch huỳnh quang,
1.4.3 Phương pháp PCR
Một trong những ứng dụng của PCR là xác định chính xác vi khuẩn. Đây
là phương pháp nhanh, đặc hiệu, nhạy và tự động trong việc xác định các mầm
bệnh là vi sinh vật. Nhiều tác giả đã sử dụng thành công phương pháp này trong
xác định gen VT của VTEC. Phương pháp PCR xác định gen VT có thể phát hiện
được dưới 10 VTEC trong tổng 10
9
coliform và là một phương pháp phù hợp để
phát hiện VTEC trong mẫu phân hoặc mẫu thực phẩm nghi ngờ.
1.5 Kỹ thuật PFGE
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) là một trong các phương pháp
dựa trên phân tích acid nucleic (DNA nhiễm sắc thể). Đây là phương pháp dùng
enzym cắt hạn chế để cắt DNA của nhiễm sắc thể thành nhiều mảnh cắt khác
nhau có kích thước khoảng 50 kb hoặc nhỏ hơn và được phân biệt bằng PFGE.
Kỹ thuật PFGE được dùng cho nghiên cứu so sánh về sự tương đồng.
2.1
2.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn Hà Nội
- Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ gia súc, gia cầm
trên địa bàn Hà Nội
- Điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận chuyển của các điểm
giết mổ trên địa bàn Hà Nội
6
- Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội
- Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ sản
phẩm thịt gia súc, gia cầm
2.1.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi khuẩn VTEC
- Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR
- Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu
- Thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng
- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để xác định
VTEC trong môi trường nhân tạo
- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để xác định
VTEC trong mẫu thịt sạch
- Xây dựng quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt
2.1.3 Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng VTEC phân
lập được
- Tỷ lệ nhiễm trong phân
- Tỷ lệ nhiễm trong thân thịt và mẫu lau thân thịt
- Xác định các yếu tố độc lực cơ bản
+ Độc tố VT1
+ Độc tố VT2
+ Yếu tố bám dính intimin
- Xác định serotyp
- Xác định sự đa dạng di truyền của các VTEC có nguồn gốc phân lập khác nhau
2.3
- Các chủng vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được
- Các chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương và âm
2.4
Các môi trường nuôi cấy, hóa chất, sinh phẩm do hãng Merck, Oxoid cung
cấp. Các chủng vi khuẩn E. coli đối chứng do một số phòng tham chiếu E. coli
cung cấp. Các loại dụng cụ, trang thiết bị, máy móc phòng thí nghiệm.
2.5
2.5.1 Phương pháp lấy mẫu
- Lấy mẫu thịt tươi: mẫu thịt lợn, bò được mua ngẫu nhiên tại một số chợ
và siêu thị trên địa bàn Hà Nội. Mẫu được lấy vào buổi sáng (6 - 7 giờ). Mỗi mẫu
được đựng riêng rẽ vào 1 túi nilon sạch, có ghi rõ ký hiệu.
- Lấy mẫu lau thân thịt: dùng gạc tiệt trùng lau trên thân thịt sau khi đã
7
được giết mổ, tách toàn bộ nội tạng, mỗi thân thịt lau tại 3 vị trí, 100 cm
2
/vị trí.
Sau khi lau, gạc được đặt vào lọ có chứa 20ml môi trường mTSB.
2.5.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn trong canh khuẩn nuôi cấy
Canh khuẩn sau khi nuôi cấy được pha loãng trong dung dịch PBS thành
các nồng độ 10
-1
, 10
-2
, …, 10
-8
. Lấy 0,1ml dung dịch ở các nồng độ pha loãng 10
-6
,
10
-7
, 10
-8
nhỏ và dàn đều trên bề mặt thạch máu, bồi dưỡng ở 37
0
C trong 24 giờ.
Mỗi nồng độ pha loãng dùng 03 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch,
rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ.
2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR
Trình tự các mồi, kích cỡ sản phẩm, thành phần các chất và chu kỳ nhiệt
của phản ứng PCR được trình bày ở các bảng 2.1, 2.2, 2.3.
eae
Gen
primers
- 3
)
(bp)
VT1
VT1-F
5’ - CAGTTAATGTGGTGGCGAAG - 3’
894
VT1-R
5’ - CTGCTAATAGTTCTGCGCATG - 3’
VT2
VT2-F
5’ - CTTCGGTATCCTATTCCCGG - 3’
481
VT2-R
5’ - GGATGCATCTCTGGTCATTG - 3’
eae
eae-F
5’ - ACGTTGCAGCATGGGTAACTC - 3’
816
eae-R
5’ - GATCGGCAACAGTTTCACCTG - 3’
các gen VT1, VT2 và eae
l)
Mồi xuôi
3
3,2 M /l
Mồi ngược
3
3,2 M /l
Dung dịch đệm AMP x 5 (Fermentas) gồm:
+ 750 mM Tris - HCl (pH=8)
+ 200 mM (NH
4
)
2
SO
4
+ 0,1% (v/v) Tween 20
+ dNTPs
+ 2 mM MgCl
2
5
-
Taq - polymerase (Fermentas)
0,62 l
500 UI (1 U/1 l)
DNA mẫu
thích hợp
Nước khử ion
vừa đủ 25 l
-
Tổng cộng
25 l
-
8
VT2 và eae
o
C)
(phút)
Giai đoạn tiền biến tính
94
5
1
Giai đoạn biến tính
Giai đoạn bắt cặp
Giai đoạn tổng hợp
94
50
72
1
1
1
30
Giai đoạn kéo dài
72
7
1
Giữ ở 4
0
C
2.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR
Độ đặc hiệu của phản ứng PCR được xác định bằng cách kiểm tra với 10
chủng VTEC đối chứng dương và 10 chủng đối chứng âm với các thông tin về
đặc tính của một số yếu tố gây bệnh đã được công bố.
2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR
Dùng phản ứng PCR để xác định VTEC trong môi trường nhân tạo, trong
các mẫu thịt sạch
2.5.6 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC
Tiến hành phân lập và giám định vi khuẩn VTEC theo quy trình tham khảo
của FDA (US Food and Drug Administration) và Phòng Thí nghiệm tham chiếu
vi khuẩn E. coli của OIE, Canada (Universite
’
de Montre
’
al, Canada).
2.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn
phân lập được
Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli bằng
phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính. Các chủng vi khuẩn được tiến
hành xác định nhóm với huyết thanh đa giá trước, sau đó đến các huyết thanh đơn
giá trong nhóm
2.5.8 Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc khác
nhau bằng phản ứng PFGE ( Pulsed-field gel electrophoresis)
Sự tương đồng hệ gen của một số chủng vi khuẩn E. coli phân lập được
xác định bằng phương pháp PFGE tại phòng thí nghiệm Vi khuẩn, Viện vệ sinh
dịch tễ Trung ương. Quy trình chuẩn bị mẫu DNA và thực hiện phản ứng dựa
theo Helgerson và cs. (2006) [39].
2.5.9 Xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2003 để tính. Sự sai
khác giữa các giá trị được xem là có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05.
9
3.1
Theo số liệu thống kê, Hà Nội có khoảng 245.000 con trâu bò, 1.670.000
con lợn và gần 16 triệu con gia cầm. Trung bình mỗi ngày Hà Nội tiêu thụ
khoảng 500 – 600 tấn thịt gia súc, gia cầm. Trong đó Hà Nội tự sản xuất khoảng
60%, phần còn lại do các địa phương khác cung cấp hoặc nhập khẩu từ nước
ngoài. Bao gồm: gia súc, gia cầm sống, thân thịt gia súc, gia cầm sau khi giết mổ
và thịt mảnh các loại. Vì vậy, thị trường thực phẩm tươi sống có nguồn gốc động
vật ở Hà Nội rất phong phú đa dạng.
3.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ gia súc, gia cầm
trên địa bàn Hà Nội
.
STT
Trâu, bò
1
Ba Vì
2
4
6
2
5
1
3
9
3
4
4
4
4
9
2
15
5
Gia lâm
2
3
3
8
6
3
1
4
7
Hoàng Mai
4
4
8
1
4
1
6
9
Mê Linh
21
5
3
29
10
41
12
12
65
11
Phú Xuyên
33
1
34
12
23
3
8
34
13
3
3
14
3
1
4
15
6
6
16
2
2
17
Thanh Oai
2
24
26
18
59
1
3
63
19
Thanh Trì
10
10
20
7
2
102
111
21
9
9
22
15
15
199
89
179
467
(Nguồn: Chi cục Thú y Hà Nội)
10
Thành phố Hà Nội đã xây dựng được 14 cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm tập
trung. Tuy nhiên cho đến nay đã có nhiều cơ sở giết mổ không còn hoạt động,
một số chỉ hoạt động cầm chừng, hoặc có cơ sở giết mổ lợn công nghiệp nhưng
lại tổ chức giết mổ thủ công khoảng 10 con lợn/ngày để cung cấp cho các siêu
thị, bếp ăn tập thể.
Do địa bàn quản lý rộng, các điểm, hộ giết mổ gia súc, gia cầm nhỏ lẻ ở
các huyện ngoại thành chiếm 50% số lượng sản phẩm gia súc, gia cầm trên địa
bàn Hà Nội. Vì vậy, việc quản lý giết mổ gặp nhiều khó khăn, không kiểm soát
được. Nguồn thực phẩm này không đảm bảo các điều kiện vệ sinh thú y, an toàn
thực phẩm, không được cơ quan thú y kiểm soát theo quy định nhưng lại là
nguồn cung cấp chính thực phẩm cho Thành phố Hà Nội.
3.1.2 Kết quả điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận chuyển của các
điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội
TT
các
Phương tiện vận chuyển
phân
thành khu
trên
trên
sàn nhà
Có khu
khám
Ôtô
Xe
máy
Bao gói
1
Lợn
199
02
04
191
02
20
179
0
2
Trâu, bò
89
0
0
89
0
05
84
0
3
Gia cầm
179
02
05
172
0
15
164
0
467
04
09
452
02
40
427
0
0,9
1,9
96,8
0,4
8,6
91,4
0
- Trong 467 điểm giết mổ chỉ có 02 điểm giết mổ gia cầm, 02 điểm giết mổ
lợn được phân thành khu riêng biệt, chiếm tỷ lệ 0,9%; 02 điểm có khu khám thân
thịt, phủ tạng riêng, chiếm tỷ lệ 0,4%; 09 điểm giết mổ trên bàn, bệ, chiếm 1,9%
và nhiều nhất là 452 điểm giết mổ trên sàn nhà, chiếm tỷ lệ 96,8%.
- Về vệ sinh tiêu độc nhà xưởng, trang thiết bị, dụng cụ giết mổ trước và sau
khi giết mổ cũng như việc vệ sinh tiêu độc định kỳ có ý nghĩa rất quan trọng trong
khâu vệ sinh giết mổ nhằm tiêu diệt các vi sinh vật gây ô nhiễm lưu trú trên nền,
sàn, bàn bệ và các vật dụng khác. Thực trạng hiện nay hầu hết các điểm giết mổ
trên địa bàn Hà Nội đều không quan tâm đến vệ sinh tiêu độc.
- Các phương tiện vận chuyển thịt, gia súc và gia cầm sống ở các điểm giết
mổ trên thường không phải là các phương tiện vận chuyển chuyên dụng, chúng
11
có thể được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau không đảm bảo vệ sinh theo
quy định của Pháp lệnh thú y. Vì thế thịt và các sản phẩm từ thịt có thể bị ô
nhiễm trong quá trình vận chuyển hoặc ô nhiễm từ các phương tiện này. Việc vận
chuyển gia súc, gia cầm sống như trên cũng là nguyên nhân làm lây lan dịch
bệnh, gieo rắc mầm bệnh ra môi trường xung quanh và gây ô nhiễm môi trường.
3.1.3 Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội
STT
(*)
máy
khoan
sinh
Biogas
do
(**)
GM
sau
khi
GM
khu
GM
1
Lợn
199
58
141
0
29
0
170
41
16
28
2
Trâu, bò
89
27
62
0
18
0
71
21
15
14
3
Gia cầm
179
73
106
0
27
0
152
29
21
24
467
158
309
0
74
0
393
91
52
66
33,8
66,2
0,0
15,8
0,0
84,2
19,5
11,1
14,1
Ghi chú:
(*)
GM: Giết mổ
(**)
VSTĐ: Vệ sinh tiêu độc
- Đối với nước sử dụng trong quá trình giết mổ: Có tới 309 điểm trong tổng
số 467 điểm giết mổ sử dụng nước giếng khoan, chiếm tỷ lệ 66,2%. Trong khi đó
chỉ có 158 điểm có sử dụng nước máy (đạt tiêu chuẩn vệ sinh), chiếm tỷ lệ 33,8%.
- Về việc xử lý chất thải tại các điểm giết mổ: Qua điều tra 467 điểm giết
mổ trên địa bàn Hà Nội chúng tôi thấy: có 393/467 điểm giết mổ (chiếm tỷ lệ
84,2%), chất thải được thải tự do ra môi trường. Chỉ có 74 điểm chiếm tỷ lệ
15,8%, có sử dụng hầm chứa, hồ sinh học để xử lý chất thải.
- Vệ sinh tiêu độc nơi giết mổ: Thực trạng hiện nay hầu hết các điểm giết mổ
tư nhân trên địa bàn Hà Nội đều không quan tâm đến vệ sinh tiêu độc. Hơn nữa các
điểm giết mổ gia súc, gia cầm phần lớn không chịu sự quản lý, kiểm tra, giám sát
của trạm thú y, nên các điểm giết mổ tiến hành giết mổ một cách tự do không thực
hiện theo quy trình vệ sinh thú y. Cách giết mổ tùy tiện này đã làm cho hệ vi sinh vật
phát triển và tồn tại trên nền, sàn khu giết mổ, tường nhà và các vật dụng tham gia
vào quá trình giết mổ sau đó gây ô nhiễm vào thịt.
12
3.1.4 Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ sản
phẩm gia súc, gia cầm
Có khoảng 300 chợ có hoạt động kinh doanh sản phẩm gia súc, gia cầm
không bao gồm cả chợ cóc, chợ tạm. Ý thức chấp hành quy định của pháp luật về
kiểm dịch, kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y của người kinh doanh, buôn bán
sản phẩm gia súc, gia cầm thấp. Hầu hết thịt gia súc bày bán ở chợ được vận chuyển
bằng xe máy, không được che đậy. Thịt gia súc, gia cầm bày bán ở các chợ cóc, chợ
tạm thường không qua kiểm soát thú y, không có dấu kiểm soát giết mổ, tem kiểm
tra vệ sinh thú y theo đúng quy định.
3.2
VTEC
3.2.1 Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng một phương pháp Multiplex
– PCR nhằm xác định 3 loại gen độc lực của các chủng VTEC đối chứng, từ đó
áp dụng đối với các chủng phân lập được, lần lượt là gen VT1 mã hóa cho độc tố
VT1, gen VT2 mã hóa cho độc tố VT2 và gen eae mã hóa cho yếu tố intimin.
Thí nghiệm tiến hành với 2 chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương
(FD523, FD636) và 1 chủng vi khuẩn E. coli đối chứng âm (C-600). DNA mẫu là
lượng nhỏ khuẩn lạc nuôi cấy trên thạch máu cừu. Kết quả cho thấy: Phản ứng
Multiplex -PCR với cả 3 loại cặp mồi đều cho các sản phẩm riêng biệt và ổn định
như trong phản ứng với từng cặp mồi riêng biệt. Ngoài ra, Multiplex - PCR còn
thể hiện một số ưu điểm khác: tiết kiệm thời gian, công lao động và đặc biệt là
tiêu hao vật tư, hóa chất.
Multiplex PCR
Multiplex - PCR
VT1
VT2
eae
VT1
VT2
eae
E. coli FD523
+
+
-
+
+
-
E. coli FD636
+
+
+
+
+
+
E. coli C-600
-
-
-
-
-
-
3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu
Thí nghiệm được tiến hành với 2 chủng VTEC, gồm 2 đối chứng dương
(FD523, FD636) và 1 đối chứng âm (C-600). Vi khuẩn được nuôi cấy trên 5 loại
môi trường lỏng (LB, m-TSB, BHI, BPW và NB) và thạch máu. Ủ ở tủ ấm 37
0
C
qua đêm. Sau đó, phản ứng PCR được tiến hành như đã trình bày, kết quả như sau:
13
Như vậy, có thể thấy: cả 5 loại môi trường lỏng đều không gây ảnh hưởng
đến chất lượng và kết quả của phản ứng PCR. Chúng tôi đã quyết định lựa chọn
môi trường m-TSB là môi trường tăng sinh thích hợp ban đầu cho việc kiểm tra
sự có mặt của nhóm vi khuẩn VTEC đối với các mẫu thịt tươi.
E. coli
thí
FD523
FD636
C-600
2
LB
+
+
-
m-TSB
+
+
-
BHI
+
+
-
BPW
+
+
-
NB
+
+
-
3.2.3 Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn E.coli tham chiếu
Thực hiện phản ứng Multiplex - PCR đã được chuẩn hóa dùng để xác định 3
gen (VT1, VT2 và eae) với 10 chủng đối chứng dương và 10 chủng đối chứng âm.
So sánh kết quả với các thông tin về đặc tính của một số yếu tố gây bệnh của
các chủng đối chứng được công bố, thì kết quả hoàn toàn phù hợp. Như vậy, phản
ứng PCR đã được chuẩn hóa trong nghiên cứu này dùng để xác định 3 loại gen có
độ đặc hiệu là 100% khi được xem xét thử nghiệm trên các chủng đối chứng.
- PCR
VT1
VT2
eae
Đối chứng
dương
E. coli FD523
+
+
-
E. coli FD526
+
-
-
E. coli FD528
-
+
-
E. coli FD635
+
+
+
E. coli FD636
+
+
+
E. coli BDL9.1
-
+
-
E. coli BKT29.1
-
+
-
E. coli E4
+
+
-
E. coli E7
+
+
-
E. coli E41
+
+
-
14
Multiplex - PCR
VT1
VT2
eae
Đối chứng
âm
E. coli (C-600) (K-12)
-
-
-
E. coli FV847a
-
-
-
E. coli FV2289
-
-
-
E. coli FV2586
-
-
-
E. coli FV2593
-
-
-
S. typhymurium (FD675)
-
-
-
P. multocida (PM-VT3)
-
-
-
S. suis (HN-25)
-
-
-
S. aureus (FD231)
-
-
-
C. perfringens (BCD6)
-
-
-
3.2.4 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để xác
định VTEC trong môi trường nhân tạo
Để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR, trước hết cần xác
định được số lượng vi khuẩn trên một số môi trường nuôi cấy, từ đó lựa chọn
được môi trường thích hợp để nhân số lượng vi khuẩn và tách DNA cho phản
ứng PCR.
TN
Mô
(x 10
6
)
3
BHI
2375,2
2508,3
P > 0,05
LB
622,5
570,4
P > 0,05
m-TSB
660,3
657,5
P > 0,05
Các số liệu được xử lý thống kê, sự sai khác này không có ý nghĩa thống
kê (P>0,05). Như vậy, số lượng hai chủng vi khuẩn đối chứng là tương đương
nhau ở cả 3 loại môi trương. Trong đó môi trường BHI cho kết quả cao nhất
(2.300-2.500 x 10
6
CFU/ml).
Điều này chứng tỏ BHI là môi trường có dinh dưỡng
tốt nhất cho nuôi cấy vi khuẩn VTEC. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh và phân
tích thêm một số chỉ tiêu khác (chất lượng môi trường ảnh hưởng tới mức độ tăng
sinh của vi khuẩn, giá thành, tác động tới môi trường, ), chúng tôi đã quyết định
lựa chọn môi trường m-TSB là môi trường tăng sinh thích hợp ban đầu cho việc
kiểm tra sự có mặt của nhóm vi khuẩn VTEC đối với các mẫu thịt tươi.
Như vậy:
- Về độ đặc hiệu của phản ứng: DNA được tách ra từ 3 loại môi trường
nuôi cấy đều cho phản ứng PCR dương tính với độ đặc hiệu là 100% với cả 3 loại
gen VT1, VT2 và eae.
15
pha
loãng
TN
giá
(%)
LB
(6,2x10
8
CFU/ml)
m-TSB
(6,6x10
8
CFU/ml)
BHI
(23,7x10
8
CFU/ml)
LB
(5,7x10
8
CFU/ml)
m-TSB
(6,5x10
8
CFU/ml)
BHI
(25,1x10
8
CFU/ml)
CKBĐ
2/2
+
+
+
+
+
+
100
10
-1
2/2
+
+
+
+
+
+
10
-2
2/2
+
+
+
+
+
+
10
-3
2/2
+
+
+
+
+
+
10
-4
2/2
+
+
+
+
+
+
10
-5
2/2
-
-
+
-
-
+
10
-6
2/2
-
-
-
-
-
-
10
-7
2/2
-
-
-
-
-
-
10
-8
2/2
-
-
-
-
-
-
Ghi chú CKBĐ: Canh khuẩn ban đầu
+ Phản ứng dương tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae
- Phản ứng âm tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae
- Về độ nhạy của phản ứng: Ngưỡng giới hạn dưới (Lower limit) về số
lượng của vi khuẩn VTEC để có thể phát hiện được trong một số môi trường nuôi
cấy như sau:
+ Môi trường LB: 5,7 - 6,26 x 10
4
CFU/ml
+ Môi trường m-TSB: 6,5 - 6,6 x 10
4
CFU/ml
+ Môi trường BHI: 23,75 – 25,08 x 10
4
CFU/ml
Có thể thấy: ở cả 3 loại môi trường, ngưỡng giới hạn dưới hay mật độ của
vi khuẩn để từ đó có thể dùng để phát hiện được VTEC bằng phản ứng PCR là
tương đương nhau, khoảng 5,7 – 25,08 x 10
4
CFU/ml.
3.2.5 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR dùng để
xác định VTEC trong mẫu thịt sạch
Như vậy, có thể kết luận độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR như sau:
+ Về độ đặc hiệu của phản ứng: DNA được tách ra từ môi trường m-TSB
có các mẫu thịt đều cho các phản ứng PCR dương tính, tương đương độ đặc hiệu
100% với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae.
+ Về độ nhạy của phản ứng: Với cả 3 loại thịt, ngưỡng giới hạn dưới (Lower
limit) về số lượng của vi khuẩn VTEC để có thể phát hiện được trong môi trường có
các mẫu thịt và đã được gây nhiễm với số vi khuẩn đạt nồng độ cuối cùng là 6,6 x
10
6
CFU/ml đối với chủng FD523 và 6,2 x 10
6
CFU/ml đối với chủng FD636. Hay
nói cách khác, số lượng vi khuẩn VTEC nhiễm trong 25 g thịt tươi phải đạt ở mức ~
6,2 - 6,6 x 10
6
CFU thì mới có thể xác định được bằng phương pháp PCR như đã
được chuẩn hóa trong nghiên cứu này.
16
pha loãng
(m-TSB)
TN
FD523
(6,6 x 10
8
CFU/ml)
FD636
(6,2 x 10
8
CFU/ml)
Bò
Bò
CKBĐ
2/2
+
+
+
+
100
10
-1
2/2
+
+
+
+
10
-2
2/2
+
+
+
+
10
-3
2/2
-
-
-
-
10
-4
2/2
-
-
-
-
10
-5
2/2
-
-
-
-
10
-6
2/2
-
-
-
-
10
-7
2/2
-
-
-
-
10
-8
2/2
-
-
-
-
Ghi chú: CKBĐ: Canh khuẩn ban đầu
+: Phản ứng dương tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae
-: Phản ứng âm tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae
3.2.6
Mẫu thịt (25g, cắt nhỏ)
225 ml môi trường m-TSB
0,1 ml + 5 ml TPB
Thạch MacConkey
Dương tính
Âm tính
2-3 khuẩn lạc Lactose (+)
PCR (VT1, VT2, eae)
Xác định serotyp
PCR (VT1, VT2, eae)
Dương tính
Âm tính
PCR (VT1, VT2, eae) từng khuẩn lạc
37
0
C/6 giờ/ lắc
37
0
C/24 giờ
17
Sau khi tiến hành thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR, chúng tôi đã
xây dựng được một quy trình nhằm xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong
các mẫu thịt
3.3
3.3.1 Thu thập mẫu
Từ thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y tại các cơ sở giết
mổ và chợ trên địa bàn Hà Nội. Để làm rõ hơn tình hình an toàn thực phẩn, chúng
tôi tiến hành lấy mẫu phân tại các điểm giết mổ, mẫu thịt tại các điểm giết mổ và
chợ trên địa bàn Hà Nội để kiểm tra.
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với một số mẫu mẫu phân và mẫu lau
thân thịt thu thập từ lò mổ, được trình bày bảng 3.10.
TT
thu
Bò
1
Trung Văn
15
0
15
0
30
2
Minh Hiền
20
0
15
0
35
3
Hoàng Mai
0
15
0
0
15
4
Bình Đà
0
15
0
0
15
5
Đông Anh
0
15
0
0
15
6
Long Biên
0
0
0
20
20
7
Thanh Trì
0
0
0
20
20
8
Đông Anh
0
0
0
20
20
35
45
30
60
170
Đồng thời, chúng tôi tiến hành lấy mẫu thịt lợn, bò tại một số chợ trên địa
bàn Hà Nội. Tổng hợp số lượng mẫu được trình bày bảng 3.11
TT
1
Chợ Hôm
10
10
20
2
Chợ Cầu Giấy
5
10
15
3
Chợ Tựu Liệt
10
5
15
4
Chợ Bách Khoa
10
10
20
5
Chợ Hòe Nhai
5
10
15
6
Chợ Châu Long
10
5
15
7
Siêu thị Unimart
10
5
15
60
55
115
18
3.3.2 Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E. coli
Chúng tôi đã phân lập được 570 chủng E. coli từ 285 mẫu phân, thịt lấy ở
lò mổ và chợ.
E. coli u
TT
E. coli
Bò
Bò
1
Phân
30
60
60
120
180
2
Lau thân thịt ở lò mổ
35
45
70
90
160
3
Thịt ở chợ, siêu thị
60
55
120
110
230
125
160
250
320
570
Năm 2004, các nhà nghiên cứu Việt – Úc đã tiến hành nghiên cứu tần số
hiện diện của E.coli trong thực phẩm (Thi Thu Thao Van, 2007) [89]. Trong
nghiên cứu này 180 mẫu thịt bò, thịt lợn, thịt gà, hải sản được lấy từ các chợ ở
Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả phát hiện trên 90% các mẫu thịt, hải sản chứa
E. coli, nhưng chưa xác định được cụ thể là loại E. coli nào. Như vậy, kết quả
phân lập các chủng E. coli từ mẫu phân, mẫu lau thân thịt, mẫu thịt tại các điểm
giết mổ và chợ của chúng tôi hoàn toàn phù hợp
Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của các chủng này được
trình bày ở bảng 3.13.
E. coli
TT
(%)
1
Gram âm
570
100
2
Di động
570
100
3
Indol
570
100
4
MR
570
100
5
VP
0
0
6
H
2
S
0
0
7
Citrat
0
0
Đặc tính lên men đường
8
Lactose
570
100
9
Mannit
570
100
10
Manitol
570
100
11
Glucose
570
100
12
Xylose
570
100
13
Galactose
570
100
14
Fructose
570
100
15
Sorbitol
570
100
16
Saccarose
214
37,5
17
Arabinose
0
0
19
Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả các chủng E. coli phân lập được đều có
các đặc tính sinh vật hóa học giống như các tài liệu trong và ngoài nước đã mô tả,
như bắt mầu Gram âm, Indol dương tính, H
2
S âm tính, có khả năng di động, lên
men một số loại đường như Lactose, Glucose, Mannit, Manitol, Sorbitol, không
lên men đường Arabinose, …
3.3.3 Kết quả phân lập VTEC trong thịt
Các số liệu so sánh về VTEC trong thực phẩm hiện nay còn rất hạn chế do
một số nguyên nhân nhất định. Trước hết là do việc sử dụng các phương pháp
nghiên cứu khác nhau với từng loại sản phẩm khác nhau. Thứ 2 là do quy trình
phân lập và giám định vi khuẩn khác nhau và không thống nhất giữa các phòng
thí nghiệm. Thứ 3, do hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào E. coli O157:H7
và bỏ qua các chủng vi khuẩn VTEC không thuộc nhóm O157 (Jorge Blanco và
cs., 2007) [44]. Mặc dù vậy, với mục đích xác định tỷ lệ VTEC trên thịt, chúng
tôi đã thu thập mẫu tại chợ và tiến hành thí nghiệm
E.coli
d
Thịt lợn
60
120
24
40,0
Thịt bò
55
110
13
23,6
115
230
37
32,2
Kết quả bảng 3.14 cho thấy, số mẫu thịt lợn phân lập được VTEC là 24 mẫu,
chiếm tỷ lệ 40,0%. Số mẫu thịt bò phân lập được VTEC là 13 mẫu, chiếm tỷ lệ
23,6%. Tổng số mẫu dương tính phân lập được trên 115 mẫu thịt lợn và bò là 37
mẫu, đạt tỷ lệ 32,2%. Như vậy, khi tiến hành nghiên cứu trên 115 mẫu thịt tươi, tỷ
lệ nhiễm VTEC ở thịt lợn và thịt bò có sự sai khác và sự sai khác này có ý nghĩa
thống kê (P < 0,05).
Sự có mặt của VTEC trong thực phẩm đã được khẳng định ở nhiều quốc
gia. Ở Mỹ, Willshaw và cs. (1993) [98] phát hiện 17% mẫu thịt bò tươi có VTEC.
Ở Canada, VTEC cũng được phân lập từ thịt bò là 10,4% và thịt lợn 3,8%.
Samadpour và cs. (1994) [79] sử dụng mồi của gen VT để xác định sự có mặt của
VTEC trong các thực phẩm bán trên thị trường ở Washington, kết quả 23% mẫu
thịt bò, 18% mẫu thịt lợn, 12% mẫu thịt gà, 7% mẫu thịt gà tây, 10% mẫu cá, 5%
mẫu sứa có kết quả dương tính.
Rất nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều đã khẳng định: bò (kể
cả phân bò và thịt bò ô nhiễm) là nguồn tàng trữ VTEC lớn nhất. Tuy nhiên, trong
nghiên cứu này, tỷ lệ phân lập của chúng tôi lại đạt thấp hơn ở nhóm thịt bò.
20
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, với các mẫu thịt dương tính với 1 trong 3
cặp mồi sử dụng, chúng tôi tiếp tục tiến hành phản ứng PCR với từng khuẩn lạc
riêng biệt. Kết quả thu được 42 mẫu chỉ dương tính với VT1 và/hoặc VT2 (không
có mẫu nào dương tính với gen eae), tương ứng với 42 chủng VTEC; trong đó, có
một số trường hợp phân lập được nhiều hơn 1 chủng từ cùng 1 mẫu thịt, do đó
mà có kết quả phân lập được 42 chủng từ 37 mẫu dương tính.
3.3.4 Kết quả phân lập VTEC từ các mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại lò mổ
E.coli
Lau thân thịt
80
160
9
11,3
Mẫu phân
90
180
13
14,5
170
340
22
12,9
Từ mẫu lau thân thịt phân lập được 9 mẫu dương tính với VTEC của 160
chủng, chiếm tỷ lệ 11,3%; 13 mẫu dương tính của 180 chủng, chiếm tỷ lệ 14,5%
từ mẫu phân. Như vậy, từ 170 mẫu lau thân thịt và mẫu phân bò, lợn đã phân lập
được 22 mẫu dương tính với VTEC, chiếm tỷ lệ 12,9%.
Có nhiều nghiên cứu về VTEC ở động vật đã được tiến hành. Cray và cs.
(1996) [26] đưa ra tỷ lệ 5,9% của 1.305 chủng E. coli phân lập được từ phân của
bò là VTEC. Ở Đức, Beutin và cs. (1993) [18] đã phân lập được VTEC từ trâu bò
là 21,1%, ở lợn là 7,5%. Ở Canada, VTEC thường phân lập được ở bê là 24,7%,
ở bò sữa trưởng thành là 9,5%.
Kết quả phân tích bằng phản ứng PCR cho thấy: có 9 mẫu lau thân thịt
dương tính với 1 trong 2 gen độc lực VT1 và VT2, chỉ có 13 mẫu phân cho kết
quả dương tính với gen VT1. Khi kiểm tra từng khuẩn lạc riêng biệt ở 2 mẫu này,
chúng tôi phân lập được 25 chủng VTEC.
3.3.5
Bằng kỹ thuật PCR, trong 67 chủng VTEC phân lập được, đa số chỉ mang
gen VT1 (hơn 75%), một số ít chủng chỉ mang gen VT2, có 2 chủng phân lập được
có cả hai gen độc tố VT1 và VT2. Đặc biệt, không chủng nào trong số các chủng
VTEC phân lập được có gen eae (bảng 3.16). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với
các nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam, cho rằng tỷ lệ có gen eae ở các
chủng VTEC không thuộc nhóm O157 là rất thấp. Nguyễn Bình Minh (2004) [5]
khi nghiên cứu về VTEC ở Việt Nam đã phân lập được 9 chủng từ 400 bệnh nhân bị
tiêu chảy và 42 bò thịt. Kết quả cho thấy không chủng nào có gen eae. Mohammad
A. Islam và cs. (2008) [64] thu thập mẫu phân trực tiếp từ trực tràng của trâu, bò và
dê ngay sau khi giết mổ ở Bangladesh. Tất cả các chủng VTEC không thuộc nhóm
O157 phân lập được đều không có gen eae. Một nghiên cứu về các yếu tố độc lực
21
của VTEC trên động vật cho thấy 57% VTEC chỉ có gen VT1, 28% chỉ có gen
VT2 và 15% có cả 2 gen. Bloton và cs. (1996) [21] cho rằng 10% số VTEC phân
lập được có mang gen gây bệnh tích A/E. Ngoài ra, còn một số nghiên cứu khác
cũng báo cáo kết quả tỷ lệ mang gen eae của các chủng VTEC thấp hoặc không có,
như Peiris và cs. (2001) [74], Irino và cs. (2005) [42].
Thực tế cho thấy: các chủng phân lập được ở nghiên cứu này chưa thể hiện
khả năng gây bệnh một cách rõ ràng, do chúng không có một gen độc lực quan
trọng (eae).
VTEC phân
VT1
VT2
VT1 + VT2
eae
Thịt lợn
26
20 (76,9%)
4 (15,4%)
2 (7,7%)
0 (0%)
Thịt bò
16
12 (75,0%)
3 (18,8%)
1 (6,2%)
0 (0%)
Lau thân thịt
12
10 (83,3%)
2 (16,7%)
0 (0%)
0 (0%)
Phân
13
13 (100%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
67
55 (82%)
9 (13%)
3 (5%)
0 (0%)
3.3.6 Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được
Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn phân lập được với 9
nhóm huyết thanh O đa giá (gồm 50 loại huyết thanh O đơn giá) được trình bày ở
bảng 3.17.
Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của 67 chủng VTEC phân lập
được cho thấy các chủng VTEC thuộc về 14 nhóm kháng nguyên O khác nhau,
nhưng không có chủng nào được xác định là thuộc nhóm O157, O111 hay O26 -
là 3 trong số các serotyp đã được xác định là thường gây ra các vụ ngộ độc và
một số các chứng bệnh khác trên người như HC, HUS và TTP do ăn phải thực
phẩm bị ô nhiễm.
Các kết quả nuôi cấy và giám định đặc tính sinh hóa của 67 chủng vi khuẩn
VTEC, đặc biệt là trên môi trường CT-SMAC cũng đã một lần nữa khẳng định
các kết quả này là hoàn toàn phù hợp.
Tuy nhiên, điều đáng lưu ý ở đây là 2 loại serotyp O8 và O103 đều đã được
phát hiện thấy ở một tỷ lệ nhất định trong số các chủng có nguồn gốc từ thịt lợn
và thịt bò. Chúng thuộc trong số 8 loại serotyp thường gây tiêu chảy xuất huyết ở
bò và có khả năng lây sang người, đặc biệt O8 là nhóm vi khuẩn có khả năng gây
tiêu chảy không xuất huyết và HUS ở người. Ngoài ra các loại serotyp O1, O18,
O103, O125, O166 được cho là có liên quan tới một số ca bệnh HUS và HC ở
người (Paton và cs. 1996) [70].
22
xét
Serotyp
tính
Chợ
Thịt lợn
26
O1
2
7,7
O8
6
23,2
O18
3
11,5
O103
2
7,7
O143
3
11,5
O148
3
11,5
O159
3
11,5
O166
2
7,7
KXĐ
2
7,7
Thịt bò
16
O8
10
62,5
O125
6
37,5
Lò mổ
Lau thân
thịt
12
O1
2
16,7
O15
2
16,7
O28ae
2
16,7
O152
3
24,9
O158
1
8,3
O169
2
16,7
Phân
13
O103
13
100
Ghi chú - KXĐ: Không xác định với 9 nhóm huyết thanh đa giá
3.3.7
Sự tương đồng hệ gen của một số chủng vi khuẩn VTEC phân lập được và
có nguồn gốc khác nhau được xác định bằng phương pháp PFGE (Tenover và cs.
1995 [92], Hopkins và cs. 2000 [40]). Hệ gen của vi khuẩn E. coli được phân cắt
bằng enzyme XbaI và được điện di trên hệ thống CHEF-DR II (Bio-Rad).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi so sánh sự tương đồng hệ gen của 28
chủng vi khuẩn VTEC đại diện cho các serotyp và có nguồn gốc khác nhau (mẫu
phân, mẫu lò mổ, thịt mua tại chợ và siêu thị). Kết quả đánh giá sự tương đồng
dựa trên tiêu chuẩn của Tenover và cs. (1995) [87]. Theo tác giả, mức độ tương
đồng hệ gen của các chủng vi khuẩn E. coli được chia thành các cấp độ khi phân
tích bằng phương pháp PFGE:
Kết quả phân tích sự tương đồng về hệ gen của các chủng vi khuẩn VTEC
được thể hiện ở hình 3.17 và 3.18.
23
Hình 3.17. Kết quả phân tích tương đồng hệ gen của vi khuẩn VTEC bằng
phương pháp PFGE
Kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy quan hệ giữa các chủng vi khuẩn
thuộc cùng serotyp phân lập được từ thịt lợn hoặc bò (O8, O125) hoặc từ mẫu thịt
và phân (O1, O103) là không phân biệt; các chủng có quan hệ rất gần là O8,
O143 và O148 phân lập từ các mẫu thịt; và O103, O1, O15, O143, O148, O28ae
và O152. Sự sai khác về hệ gen giữa các chủng chủng vi khuẩn phân lập từ thịt
thu thập từ chợ và các mẫu tại lò mổ (mẫu lau thân thịt, mẫu phân) là không lớn
(mức độ tương đồng trên 85%).
Leotta và cs. (2008) [51] đã tiến hành nghiên cứu và so sánh đặc tính của
các chủng O157 phân lập được từ Achentina, Úc và New Zealand bằng phương
pháp PFGE. Kết quả cho thấy kiểu PFGE có 46 mẫu PFGE đã được quan sát thấy
khi sử dụng enzym XbaI để phân cắt, trong đó có 37 chủng được chia thành 10
nhóm khác nhau.
Xia và cs. (2010) [85] trong một nghiên cứu với các chủng VTEC phân lập
được từ thịt được bán lẻ tại Mỹ cũng đã công bố kết quả phân biệt các chủng
bằng kỹ thuật PFGE. Kết quả cho thấy 17 chủng được phân loại vào 14 nhóm,
chứng tỏ mức độ tương đồng giữa các chủng là rất cao.
O8
O8
O8
O8
O8
O143
O143
O148
O148
O148
O125
O125
O125
O125
O125
O125
O103
O1
O1
O15
O143
O143
O148
O28ae
O28ae
O152
O152
O148
