Tài liệu Nuôi cấy mô và tế bào ppt

Nuôi cấy mô
và tế bào


Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh
tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật
và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh
bằng con đường nuôi cấy mô và tế bào.
Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh
cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào
trần (protoplast) mới trở thành hiện thực.
Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi
cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh
mô thực vật tách rời trên môi trường dinh
dưỡng trong điều kiện vô trùng. Sau đó,
các mô cấy được cho tái sinh thành cây
hoàn chỉnh. Người ta đã xây dựng được
các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái
sinh cây cho một số loài như thuốc lá,
khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn
quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên
đồng ruộng, như bông và đậu lấy hạt thì
việc thiết lập các quy trình để áp dụng
rộng rãi khó hơn nhiều. Ở những loài cây
này tần số tái sinh thấp và kết quả tái
sinh từ nuôi cấy không chỉ thay đổi theo
loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene
trong một loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức
khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng
và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công

nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho phép
nhân nhanh những kiểu gene có giá trị
hay vật liệu chọn giống trong một môi
trường có kiểm soát. Một số khả năng
ứng dụng của nhân nhanh đối với cây
trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị
hợp tử, nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân
bố mẹ bất dục trong chương trình chọn
giống lai, nhân vật liệu sạch bệnh, bảo
quản và trao đổi nguồn gene quốc tế
Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ
thuật nuôi cấy in vitro liên quan trực tiếp
tới quá trình chọn giống.
(1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in
vitro
Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang
tận dụng biến dị di truyền hiện có trong
nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng
nhiều sơ đồ lai và chọn lọc khác nhau.
Tuy nhiên với thâm canh và độc canh,
một ít kiểu gene chọn lọc về những tính
trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền
ngày một giảm trong nguồn gene trồng
trọt. Thậm chí trong một số trường hợp,
nguồn biến dị đối với một số tính trạng
có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví
dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục
thân, chịu mặn ở lúa
Để khắc phục những vấn đề nghiêm
trọng ảnh hưởng đến năng suất, nhà chọn

giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh
từ các loài hoang dại thân thuộc hoặc
không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi
sử dụng các loài hoang dại để lai với cây
trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một
số trường hợp, các phôi lai từ các tổ hợp
lai giữa các loài có quan hệ xa nhau
thường yếu và không có khả năng sống
do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ
không đầy đủ và chúng thường bị chết
trong một thời gian ngắn sau khi hình
thành hợp tử và không thể phát triển
thành hạt có khả năng sống. Vì vậy, nuôi
cấy phôi hay cứu phôi là một phương
pháp để khắc phục hàng rào bất hợp, bảo
đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần,
và phát triển thành cây con. Thông qua
sử dụng phương pháp này người ta đã tạo
ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại
cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại mạch,
bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây
cảnh và nhờ vậy nhiều gene có ích đã
được chuyển vào cây trồng.
Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy
để cứu phôi từ các tổ hợp lai xa mà
không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn
chứa phôi lai non được tách ngay sau khi
thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi
cấy trên môi trường dinh dưỡng. Bằng
con đường nuôi cấy noãn phôi có thể

nuôi cấy ở giai đoạn sớm hơn so với nuôi
cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát
triển trong noãn có môi trường hoá học
và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy bên
ngoài noãn.
Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc
thu nhập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn
trên môi trường dinh dưỡng trong điều
kiện vô trùng, và thụ phấn cho noãn với
các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua
thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế
bào trứng. Phương pháp này đã được áp
dụng để tạo con lai giữa các loài mà ống
phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào
noãn bình thường sau khi thụ phấn.
(2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây
đơn bội:
Trong phần lớn các chương trình chọn
giống việc tạo giống mới cải tiến bao
gồm việc gieo trồng quần thể F
2
lớn và
chọn lọc các dòng mong muốn trong các
thế hệ phân ly từ F
2
đến F
7
để cuối cùng
tạo ra các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy
bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật

hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng hợp tử
ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội
kép), do đó tiết kiệm nguồn lực và rút
ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống
mới.
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in
vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay
hạt phấn chưa thành thục trên môi trường
dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số
nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân
đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử
hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc
nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà
chọn giống vì thế đơn bội kép có thể
được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả
cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời
gian cần thiết để tạo ra một giống hay
một dòng tự phối bằng phương pháp đơn
bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với
phương pháp truyền thống. Các dòng đơn
bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải
thiện hiệu quả chọn lọc đối với nhiều tính
trạng vì trong quần thể không có phương
sai trội, đồng thời gene lặn cũng biểu
hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được
áp dụng thành công ở Trung Quốc trong
việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy
nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng
rãi phương pháp này là khả năng nuôi
cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu

gene. Ví dụ, các nhà chọn giống lúa
Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có
hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa
Japonica do các kiểu gene Indica khó
nuôi cấy hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi
giai đoạn phát triển của bao phấn, điều
kiện sinh lý của cây cho phấn, điều kiện
xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh
dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả
lưỡng bội hoá bằng colchicine.
(3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng
tế bào:
Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm
kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương
pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất
hàng loạt cây dồng nhất và như bố mẹ
ban đầu của các giống ưu tú.
Tuy nhiên, với thời gian các công trình
nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá
trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và
mô được nuôi cấy trong môi trường nhân
tạo thường xuất hiện các biến đổi di
truyền bao gồm số lượng và cấu trúc
nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm
sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị
này được truyền lại cho cây khi tái sinh.
Tập hợp các biến dị di truyền hình thành
do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị
dòng soma (somaclonal variation)
(Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị

dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây,
kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ
nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và
tính ổn định của genome. Như vậy bản
thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn
biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và
phong phú trong các điều kiện đã thích
ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống
cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma
có ích đã được phân lập, đó là khả năng
để kháng virus Fiji, bệnh đốm vàng viền
nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và
cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh
đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram,
1979); kháng sương mai ở khoai tây
(Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và
chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs,
1996).
Một ưu điểm của biến dị di truyền trong
quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc
dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và
xử lý hàng triệu tế bào trong một không
gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri
và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi
cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân
chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột
biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị
di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính
trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể
xác định được bằng cách sàng lọc tế bào

nuôi cấy, bao gồm các đặc tính như
kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu
kim loại như sắt, nhôm, axit amin tương
đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh
dưỡng và khả năng kháng độc tố do các
tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene
phân lập kháng với các điều kiện bất lợi
này có thể được sử dụng trực tiếp trong
chương trình chọn giống.