Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền bắc việt nam từ năm 2006 – 2012

Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở
miền Bắc Việt Nam từ năm 2006 – 2012


Nguyễn Vĩnh Đông


Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS.BS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Năm bảo vệ: 2012


Abstract. Tổng quan về vi rút dại ở Miền Bắc Việt Nam: Sơ lược lịch sử phát hiện
vi rút dại; Virut dại; Dịch tễ học bệnh dại; Nghiên cứu trong nước liên quan đến đề
tài; Chẩn đoán phòng thí nghiệm; Các kỹ thuật sinh học phân tử. Xác định và định
týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012. Phân tích đặc
điểm phân tử Nucleoprotein của các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam,
2006 - 2012. Trình bày kết quả đạt được: Kết quả về xác định và định týp vi rút, Kết
quả phân tích đặc điểm nucleoprotein vi rút dại.

Keywords. Vi rút dại; Vi sinh vật học; Đặc điểm phân tử; Miền Bắc Việt Nam


Content
MỞ ĐẦU
Bệnh dại là bệnh viêm não và màng não nguyên phát của động vật có vú, do vi rút dại
thuộc họ Rhabdoviridae gây nên. Đây là một căn bệnh cổ xưa nhất của động vật và có thể
truyền sang người khi tiếp xúc với vi rút dại qua niêm mạc và da bị tổn thương. Bệnh thường

biểu hiện dưới hai thể lâm sàng là thể hung dữ (chiếm 80%) có các triệu chứng điển hình như
tăng kích thích, sợ nước, sợ gió, sợ ánh sáng, tăng tiết đờm dãi, co thắt các cơ hô hấp và thể
liệt (chiếm 20%). Khi đã lên cơn dại, 100% bệnh nhân tử vong. Ổ chứa vi rút dại rất đa dạng
bao gồm các động vật máu nóng hoang dại và động vật gần người như chó, mèo, ngựa, trâu,
bò, chồn, cáo, chó sói, dơi Cho đến nay, trên thế giới đã có tới 7 genotype thuộc giống
Lyssavirus được ghi nhận là tác nhân gây bệnh dại và viêm não tủy giống bệnh dại. Vi rút dại
cổ điển và các chủng vi rút sản xuất vắc-xin được xác định thuộc Lysssavirus genotype 1 [2].
Bệnh dại hiện nay được coi là một trong các bệnh bị lãng quên trên thế giới, nhưng lại
tái nổi trội ở một số nước thuộc châu Á, châu Phi [1]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới
(TCYTTG), hằng năm có khoảng 55.000 ca tử vong do bệnh dại và hơn 10 triệu người bị
động vật nghi dại cắn hoặc do tiếp xúc với nguồn truyền bệnh dại phải điều trị dự phòng bằng
huyết thanh/vắc xin (VX) dại. Trong những năm gần đây, Việt Nam và một số nước trong
khu vực như Phillipin, Lào, Cam Pu Chia và Trung Quốc đang phải đối mặt với vấn đề tăng
nhanh các ca bệnh dại. Ở Việt Nam, đã có 560 trường hợp mắc bệnh dại trên người được báo
cáo từ năm 2007-2011 và bệnh dại đã và đang diễn ra ở 25 – 27 tỉnh trên cả nước, nhưng tập
trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc [3]. Nguồn lây chính của bệnh dại ở Việt Nam là chó và
mèo, chưa thấy có ghi nhận các trường hợp mắc dại do tiếp xúc với các động vật khác. Việc
triển khai công tác tiêm phòng vắc xin dại cho đàn chó mèo chưa được tốt, đặc biệt là ở các


vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa. Hơn nữa việc kiểm soát xuất/nhập động vật giữa các
vùng biên giới, các vùng có dịch bệnh dại ở động vật lưu hành và vùng không có dịch chưa
được chặt chẽ, do vậy ổ chứa bệnh dại vẫn chưa thật sự được kiểm soát từ đó là nguồn lây
bệnh cho người. Đứng trước tình hình bệnh dại gia tăng và diễn biến phức tạp, ngày
19/1/2009 thủ tướng chính phủ đã chính thức phê duyệt chương trình phòng chống bệnh dại
Quốc Gia CV99/TTG – KTN. Để đánh giá hiệu quả của chương trình phòng chống bệnh dại,
việc giám sát các ca bệnh dại ở người và động vật là quan trọng cũng như theo dõi đặc điểm
phân tử của các chủng vi rút dại lưu hành giúp cho việc khẳng định hiệu quả của việc phòng
chống bệnh dại trong từng giai đoạn cụ thể, trên cơ sở này có những đề xuất xác đáng cho
việc thực hiện các hoạt động phòng chống bệnh dại hiệu quả ở các giai đoạn tiếp theo. Chính

vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở
miền Bắc Việt Nam, 2006-2012“ với 2 mục tiêu:
1/ Xác định và định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 -
2012.
2/ Phân tích đặc điểm phân tử Nucleoprotein của các chủng vi rút dại lưu hành ở miền
Bắc Việt Nam, 2006 - 2012.


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện vi rút dại
Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não nguyên phát của động vật có
vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc da bị tổn thương.
Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc cổ phương Đông đã
viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà chó và người mắc phải. Bệnh
dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người Do Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu
hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu
gặp các con vật có biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên. Ở Ai Cập, Hy Lạp, La mã
người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn nguyên gây bệnh
cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [10, 16, 47].
Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được truyền từ chó sang
người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương bằng que sắt nung đỏ [46].
Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp phẫu thuật cắt bỏ phần
cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại [47].
Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước dãi của chó
dại. Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm trên thỏ và thử
nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt của con vật bị bệnh dại vào tĩnh
mạch con vật lành.
Năm 1884, Louis Pasteur đã thành công trong việc nghiền não tuỷ của chó mắc bệnh

dại sau đó gây nhiễm dưới màng cứng não thỏ. Tiếp tục nghiền não thỏ đã gây nhiễm truyền
cho thỏ tiếp theo và cứ tiếp tục như vậy sau hơn 100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông
đã thu được chủng vi rút có thời gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là “vi
rút dại cố định” [29, 45, 47]. Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt vi rút dại
gây nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể. Ông đã dùng não tuỷ thỏ bất
hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng vi rút dại sống thử thách cho những con chó này và kết
quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắc xin dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885,
lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắc xin não thỏ bất hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister,
bị một con chó lên cơn dại cắn nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắc xin dại của Pasteur,


cậu bé đã được cứu thoát khỏi bệnh dại [24]. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2.500
người bệnh đã được điều trị bằng vắc xin này và chỉ có 12 người bị chết [45].
Năm 1963, dưới kính hiển vi điện tử Atanasiu cùng cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc,
hính thái của vi rút dại trên động vật thí nghiệm và trên nuôi cấy tế bào [6].
Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự phát triển
của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn dòng để chẩn đoán các
chủng vi rút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ thuật PCR, sequencing người ta đã
có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp các gien và trình tự nucleotide của vi rút dại. Nhờ
vào sinh học phân tử đã mang lại nhiều tiến bộ cho việc sản xuất vắc xin dại tái tổ hợp [29].
1.2. Vi rút dại
1.2.1. Phân loại:
1.3. Dịch tễ học bệnh dại
1.3.1. Tình hình bệnh dại trên thế giới và Việt Nam
1.3.2. Ổ chứa, nguồn truyền bệnh
1.3.3. Các biện pháp phòng chống bệnh dại
Ở các nước phát triển biện pháp phòng chống bệnh dại chủ yếu hướng tới các yếu tố
truyền bệnh, ổ chứa virus dại ở các động vật máu nóng hoang dại như chồn, cáo, chó sói.
Những chiến dịch chủng ngừa bằng mồi có chứa thức ăn trộn lẫn vaccine được rải vào các
cánh rừng để gây miễn dịch cho động vật hoang dại, góp phần làm giảm nguy cơ truyền bệnh

dại cho người [2].
Ở các nước đang phát triển, biện pháp phòng chống chủ yếu tập trung vào việc tăng
cường sản xuất và nâng cao chất lượng vaccine, huyết thanh phòng bệnh dại, đẩy mạnh công
tác tuyên truyền và giáo dục nhân dân về việc hạn chế nuôi chó, tiêm chủng thường xuyên
cho chó, mèo, cách xử lý khi bị súc vật nghi dại cắn. Tăng cường công tác giám sát dịch tễ
học bệnh dại để biết chính xác dịch tễ học bệnh dại và thực hiện tiêm phòng cho các đối
tượng có nguy cơ phơi nhiễm.
Đối với bệnh dại ở súc vật: thiết lập hệ thống giám sát trung tâm có trang thiết bị phòng
thí nghiệm chẩn đoán, có đội ngũ chuyên gia theo dõi. Thành lập chương trình kiểm soát và
hạn chế đàn chó lang thang, thực hiện tiêm phòng thường kỳ cho đàn chó.
Thực hiện giám sát kiểm dịch Quốc tế khi xuất nhập các súc vật qua biên giới. Tăng
cường hợp tác khoa học giữa các nước và khu vực có bệnh dại lưu hành [2].
1.3.4. Các loại vắc xin tế bào phòng bệnh dại sản xuất trên thế giới
 này có độ an toàn và hiệu lực cao, được sản xuất và sử dụng tại Nhật Bản từ 1965.
 Vaccine trên tế bào thường trực Vero (Verorab): sử dụng chủng PM thích nghi trên tế
bào thường trực vero đời 137, vaccine được bất hoạt, cô đặc và tinh chế sau đó đông
khô, vaccine có độ an toàn và tính sinh miễn dịch cao. Được sản xuất tại Pháp từ
1984.
1.4. Nghiên cứu trong nƣớc liên quan đến đề tài
Trước đây đã có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của bệnh dại tại Việt Nam do tác
giả Yamagata và cộng sự (2007) [52], đã tiến hành phân lập vi rút dại từ chó tại Thành phố Hồ
Chí Minh và một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Kết quả của đề tài là đã so sánh trình tự
nucleotide của gien N vi rút dại với một số chủng từ các nước Châu Á khác, và kiến nghị rằng
có sự liên hệ chặt chẽ về mặt tiến hóa giữa các chủng tại Miền Nam Việt Nam với các chủng
từ Thái Lan và có thể có cùng chung một nguồn gốc.
1.5. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Chẩn đoán xác định bệnh dại trong phòng thí nghiệm dựa vào các phương pháp sau:
- Xác định kháng nguyên của vi rút bằng kỹ thuật FA hoặc ELISA
- Phân lập và xác định vi rút: phân lập trên tế bào hoặc trên chuột.
- Xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.

- Nhận dạng vi rút bằng kháng thể đơn dòng


- Các kỹ thuật huyết thanh học; ELISA, RFFIT, FAVN
1.5.1. Chẩn đoán bệnh dại ở người
1.5.1.1. Khi bệnh nhân đang sống
 Kỹ thuật phân lập vi rút
Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ.
Phân lập vi rút trên não chuột ổ nhắt trắng 1 – 2 ngày tuổi, sau tiêm 3 – 4 ngày mổ lấy não
chuột và xác định vi rút bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Phân lập vi rút trên tế bào NA (C1300) Neuroblastoma của chuột. Khoảng 20 – 24
giờ sau khi gây nhiễm, nhuộm tế bào bằng kháng thể kháng dại gắn huỳnh quang sau đó soi
trên kính hiển vi huỳnh quang. Mẫu bệnh phẩm dương tính khi quan sát thấy có hình ảnh phát
quang màu xanh trong bào tương của tế bào. Phân lập vi rút dại trên nuôi cấy tế bào cho phép
phát hiện được lượng vi rút rất ít trong bệnh phẩm và cho kết quả sau 20 – 24 giờ. Phương
pháp phân lập vi rút trên tế bào có độ đặc hiệu cao (99%), độ nhạy 94-97%. Tuy nhiên
phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, tốn kém.
 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
Là một kỹ thuật đáng tin cậy, được sử dụng từ năm 1979, cho đến nay đây vẫn là kỹ
thuật vàng trong việc chẩn đoán xác định vi rút dại.
Mẫu bệnh phẩm là giác mạc bệnh nhân hoặc lấy từ sinh thiết da vùng gáy.
Lấy mẫu bệnh phẩm phết lên lam kính, nhuộm huỳnh quang với kháng thể kháng dại, sau đó
soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Các mẫu dương tính sẽ thấy xuất hiện các tế bào phát
quang, các mẫu âm tính sẽ không thấy hiện tượng phát quang.
Kỹ thuật này có độ đặc hiệu 99,9% và độ nhạy 99,99%. Cho kết quả nhanh sau 2 – 3
giờ [16].
 Các kỹ thuật huyết thanh học
Các kỹ thuật huyết thanh học ít được sử dụng để chẩn đoán mà chủ yếu dùng để định
lượng nồng độ kháng thể kháng dại có trong huyết thanh của người hoặc động vật sau khi
tiêm phòng vắc xin để đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin.

Chuẩn độ kháng thể trung hoà có trong huyết thanh của người sau khi tiêm vắc xin
bằng thử nghiệm trung hoà huyết thanh trên chuột (MNT) hoặc thử nghiệm ức chế tạo đám
miễn dịch huỳnh quang (RFFIT) hoặc FAVN.
Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA), sử dụng glycoprotein dại tinh khiết để xác định
hiệu giá kháng thể trung hoà có trong huyết thanh người và động vật. Thử nghiệm cho kết
quả nhanh nhưng giá thành đắt [16].
 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định ARN của vi rút dại
Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ.
Phát hiện axit nucleic của vi rút bằng kỹ thuật RT – PCR, nested RT – PCR, real time PCR,
từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh chóng.
1.5.1.2. Sau khi bệnh nhân tử vong
Não tử thi ở các vùng khác nhau như dưới đồi, nhân não, chất xám, tiểu não.
Các kỹ thuật chẩn đoán trên não tử thi cũng tương tự như các kỹ thuật chẩn đoán trên
lâm sàng, nhưng có thêm kỹ thuật xác định tiểu thể Nergi ở tế bào thần kinh trong mô não tử
thi.
 Kỹ thuật xác định tiểu thể Negri
Não được phết lên lam kính, nhuộm theo phương pháp Seller hay Mann, soi lên kính
hiển vi tìm tiểu thể Negri thường khu trú trong tế bào thần kinh sừng Amon có kích thước
khoảng 0,25 – 25 m, bắt màu hồng Eosin. Phương pháp này cho kết quả nhanh, sau khoảng
1 giờ.
1.5.2. Chẩn đoán trên động vật


Bệnh phẩm là não động vật nghi dại. Lấy não vùng sừng Amon hai bên, vùng dưới
đồi, cuống não, nhân não, chất xám. Các kỹ thuật chẩn đoán áp dụng như trên bệnh phẩm não
tử thi.
1.6. Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu vi rút dại
1.6.1. Các phương pháp định týp và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút Dại
Phương pháp miễn dịch: Sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các chủng đại diện của
các kiểu gien để định týp các vi rút dại hoang dại phân lập được. Phương pháp đòi hỏi phải

phân lập được vi rút và phải có hệ thống huyết thanh chuẩn của từng týp huyết thanh.
Phương pháp sinh học phân tử: Phân tích, so sánh trình tự nucleotide của vi rút dại cần xác
định kiểu gien so với các chủng đại diện của các kiểu gien.
Hầu hết các công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của vi rút dại sử dụng gien
N để phân tích kiểu gien và sự tiến hóa của vi rút dại. Tại khu vực Đông Nam Á (Thái Lan,
Philipine, Trung Quốc) cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử,
nghiên cứu sâu về cấu trúc di truyền của các chủng vi rút dại, phân tích sự tiến hóa của chủng
vi rút lưu hành [3, 20, 51], các công trình nghiên cứu này cũng sử dụng gien N để phân tích
đặc điểm di truyền, tiến hóa của vi rút do gien này có các đặc tính sau:
Gien N bao gồm 450 axit amin, tương ứng với 1350 nucleotide, N protein có tính bảo
tồn nhất trong các protein của Lyssavirus, trình tự nucleotide của gien mã hóa cho N protein
có độ tương đồng cao trong cùng một kiểu gien, nhưng lại rất khác nhau giữa các kiểu gien.
Độ tương đồng ở mức độ axit amin của N protein giữa các chủng vi rút trong cùng một kiểu
gien đạt tới 98-99,5%, trong khi mức độ tương đồng nucleotide chỉ đạt dưới 80% đối với các
vi rút thuộc các kiểu gien khác nhau, [42, 46]. Các công trình nghiên cứu khoa học đó cho
thấy khi phân tích trình tự cách quãng 200 nucleotide của gien N sẽ thu được kết quả tương
tự như khi phân tích toàn bộ trình tự gien N (Smith và CS, 1992; Kissi và CS, 1995) hoặc
một đoạn gien khoảng 200 – 300 nucleotide (Conzelmann và CS, 1990; Bourhy và CS, 1993;
Kissi và CS, 1995; Smith và CS, 1992; Nadine – David và CS, 1994; Kissi và CS, 1995;
Nishizono và CS, 2002). Chính vì vậy gien N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh
dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử; phân loại kiểu gien (genotyping), xây dựng bản đồ
dịch tễ học phân tử và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút dại so với các vi rút gây bệnh dại
thuộc nhóm Lyssavirus [22, 23, 28, 39, 46, 51].
Ngoài ra trong hệ gien của vi rút dại còn có gien mã hóa cho P protein cũng là gien khá
bảo tồn trong các gien của vi rút dại, có tới 97% sự tương đồng nucleotide của các chủng vi
rút thuộc genotype 1 [46]. Vùng được bảo tồn nhất trong gien P chính là vùng ưa nước, nằm
ở vị trí axit amin 139 – 170 [46] được sử dụng để thiết kế mồi cho các kỹ thuật chẩn đoán vi
rút dại bằng các phương pháp sinh học phân tử và gien P cũng được sử dụng để nghiên cứu
sự tiến hóa của vi rút dại trong một kiểu gien, nhưng hiệu quả phân loại kiểu gien bằng gien P
tỏ ra không hiệu quả bằng gien N và phải giải trình tự toàn bộ gien P thì khả năng phân loại

genotype mới chính xác.
1.6.2. Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
1.6.3. RT - Realtime PCR
1.6.4. RT - LAMP
1.6.5. Kỹ thuật sequencing
các vạch này giải được trình tự của đoạn ADN [14].
1.6.5.1. Giải trình tự bằng máy tự động
Các phòng thí nghiệm hiện nay hầu hết giải trình tự gien bằng phương pháp enzyme, sử
dụng máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải
trình tự bằng máy tự động thì các mạch ADN đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự
phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi
qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính
yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện


di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện
vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc
hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm
tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang
ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh
cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân
tích thành trình tự của đoạn ADN.


CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- 102 mẫu bệnh phẩm dịch não tuỷ, nước bọt được lấy từ 63 bệnh nhân nghi dại điều trị
tại viện Các Bệnh Truyền Nhiễm và Nhiệt Đới Quốc Gia; khoa truyền nhiễm, bệnh viện Bạch

Mai. Các bệnh nhân này tới từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam, sau khi được chẩn đoán lâm sàng
tại các trung tâm y tế của tỉnh được chuyển lên tuyến trên để điều trị và lấy mẫu.
- 150 con chó ở lò mổ của huyện Hoài Đức, Hà Nội (Hà Tây cũ) và các tỉnh lân cận. Chó
có một trong các triệu chứng như bỏ ăn, kích thích, chảy nước dãi được mổ sọ lấy não vùng
đồi thị và tiểu não.
- 6 mẫu não từ chó nghi dại có các triệu chứng như thay đổi hành vi, cắn nhiều người,
cắn động vật khác, tìm chỗ tối chỗ vắng nằm trong bóng tối thu thập được từ một số tỉnh
miền núi phía Bắc là Lào Cai, Sơn La và Yên Bái.
- 4 chủng vi rút dại hoang dại phân lập được từ chó mắc dại tại Việt Nam từ năm 2006 –
2012.
- Tất cả các mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói theo tiêu chuẩn đóng gói mẫu bệnh
phẩm loại A, đảm bảo 3 lớp và bảo quản trong lạnh khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Chủng vi rút
Chủng chuẩn vi rút dại CVS: Phòng thí nghiệm Vắc xin và sinh phẩm thực nghiệm, Viện Vệ
sinh Dịch tễ cung cấp. Chủng vi rút này được nhân trên tế bào (để làm chứng dương cho kỹ
thuật tách chiết ARN từ dịch) và cấy truyền trên chuột (để làm chứng dương cho kỹ thuật
tách chiết ARN từ mô) trong chẩn đoán dại bằng kỹ thuật RT – PCR.
2.2.2. Trình tự gien
Trình tự nucleotide của gien N của các chủng vi rút được tham khảo tại ngân hàng gien thế
giới (GenBank) tại địa chỉ website: với các mã gien đăng ký và
tên chủng như sau:
- 7 chủng đại diện cho 7 genotype thuộc Lysavirus: X03673 - PV; D42112 - CVS;
U22848 - Duvenhage virus; EU822500 - European bat Lyssavirus 1 ; EU293114 -
European bat Lyssavirus 2; AY573964 - Australian bat Lyssavirus; U22842 - Lagos
bat virus; MVU22843 - Mokola virus;
- 8 chủng vi rút ở Miền Nam và Tây nguyên Việt Nam: AB614375; AB614376;
AB628213; AB614373; AB614374; AB628211; AB614377; AB614378.
- Một số chủng vi rút dại lưu hành trên thế giới như Pháp, Nga, Ba Lan, Nam Phi,
Mexico, Brazil…: U22477, ME9126; U22627, EGY8692; U22637, ETH8807;

U22641, GUI9024; U22633, AFS8721; U22656, RUS9141; U22474, FRA9147;
U22840, POL8618; U22479, BRAZIL.
- Một số chủng vi rút dại lưu hành ở khu vực lân cận như Trung Quốc, Malaysia,
Philippines, Nepal: U22918, 94260NEP; U22653, 8738THA; U22916, 8677MAL;
AB070817PHI; EF555106, SDJNCN01; EF555102, CQQJDN06; EF555112,


GDZQDN45; EF555098, CQQJDN02; EF555099, CQQJDN03; EF555100,
CQQJDN04; EF555101, CQQJDN05; AB299032, AB299033, AB299034,
AB299035, AB299036, AB299037, AB299038, AB299039 VN.
2.2.3. Sinh phẩm, hóa chất
 Các sinh phẩm, hóa chất và vật liệu cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật RT – PCR và
sequencing.
2.2.4. Trang thiết bị, dụng cụ
2.2.5. Xác định và định týp vi rút
2.2.5.1. Xác định vi rút bằng kỹ thuật RT-PCR
2.2.5.2. Xác định týp vi rút
 là 50cm. Thì mỗi lần chạy đọc được 4 giếng theo chiều dọc của đĩa từ A đến H và mất 2
giờ 30 phút cho mỗi lần chạy.
 Trình tự nucleotide được phân tích theo các thông số của phần mềm đi kèm theo máy
giải trình tự (chất lượng đọc các nucleotide, phát hiện SNP là trạng thái đa dạng kiểu
nucleotide tại một vị trí trên gien )
b/ Xác định týp vi rút dại
Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm các chương trình
Chromas, BioEdit, Lasergene, và MEGA4.0, để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi
nucleotide, axit amin và các đặc điểm sinh học phân tử gien N của vi rút dại và xây dựng
mối quan hệ phả hệ định týp các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam.
Các chủng vi rút dại thuộc đại diện cho các genotype khác nhau như chủng PV
(Pasteur Virus) và CVS (chủng vi rút thử thách) thuộc genotype 1, chủng vi rút dơi Lagos
thuộc genotype 2, chủng vi rút Mokola thuộc genotype 3, chủng vi rút Duvenhage thuộc

genotype 4, chủng vi rút European bat lyssavirus 1 thuộc genotype 5, chủng vi rút European
bat lyssavirus 2 thuộc genotype 6 và chủng vi rút Australian bat lyssavirus thuộc genotype 7
được sử dụng làm đại diện để xác định týp của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam.


CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả xác định và định týp vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 -
2012
3.1.1. Kết quả xác định vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006-2012
3.1.1.1. Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại trên ngƣời
a. Kết quả thu thập và chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân nghi dại
Trong tổng số 63 bệnh nhân nghi dại điều trị tại viện Các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới
Quốc gia và bệnh viện Bạch Mai thu thập được 102 mẫu bệnh phẩm. Trong đó có 14 bệnh
nhân chỉ thu thập được dịch não tủy (DNT), 8 bệnh nhân lấy được nước bọt (NB) và 41 bệnh
nhân có đầy đủ cả dịch não tủy và nước bọt. Kiểm tra sự có mặt ARN của vi rút dại trong các
mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật RT – PCR đã khẳng định 29/63 bệnh nhân bị nhiễm vi
rút dại, tỷ lệ dương tính với vi rút dại là 46,03%.
3.1.1.2 Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại ở động vật
3.1.1.3 Sự phân bố các chủng vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam theo địa dƣ
Bảng 3.3 cho thấy bệnh dại lưu hành ở nhiều vùng địa lý khác nhau, tập trung chủ yếu ở các
tỉnh miền núi, trung du. Đặc biệt tỷ lệ bệnh nhân mắc dại ở Hà Tây và Phú Thọ cao hơn các
tỉnh khác thuộc khu vực miền Bắc, đây là hai tỉnh nổi trội về tình hình bệnh dại trên người
trong những năm gần đây ở các tỉnh miền Bắc


Bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy 31 chủng vi rút dại xác định được trên người (23 chủng) và
chó (8 chủng) tại miền Bắc, chủ yếu tập trung ở các tỉnh Hà Nội, Phú Thọ, Hòa Bình, Yên Bái,
Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang.

Kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm vi rút dại trên người và động vật cho thấy vi rút lưu
hành tại 9 tỉnh miền Bắc: Hà Nội, Tuyên Quang, Hòa Bình, Phú Thọ, Sơn La, Thái Bình, Lạng
Sơn, Yên Bái, Lào Cai phù hợp với số liệu báo cáo thống kê của chương trình phòng chống
bệnh dại Quốc Gia, Bộ Y tế, 2006 – 2011. Đây chính là 10-11 tỉnh trọng điểm có bệnh nhân tử
vong vì bệnh dại cao nhất trên toàn quốc (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2012). Việc khẳng định
phòng thí nghiệm là có sự lưu hành vi rút dại ở chó cho thấy nguồn truyền bệnh dại chủ yếu
cho người chính là đàn chó bị nhiễm dại tại địa phương. Do tập quán thích nuôi chó, nuôi chó
thả rông và tỷ lệ tiêm phòng cho chó ở khu vực nông thôn phía Bắc chỉ đạt 15 – 30%, thậm chí
ở những vùng sâu, vùng xa không tổ chức tiêm phòng cho đàn chó mèo [1,3]. Đây chính là
nguyên nhân chính gây ra bùng phát dịch tại địa phương và lan rộng ra vùng xung quanh. Do
vậy, cần phải có chiến lược kiểm soát bệnh dại ở động vật như tiêu hủy đàn chó nhiễm bệnh, tổ
chức chiến dịch tiêm phòng cho chó để đạt được tỷ lệ tiêm phòng vắc xin > 80% và giám sát
phòng thí nghiệm vi rút dại ở động vật nhằm phát hiện sớm các ổ dịch để có biện pháp can
thiệp kịp thời cũng như đánh giá hiệu quả các biện pháp phòng chống dại ở động vật.
3.1.2. Kết quả định týp các chủng vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc, Việt Nam 2006 –
2012
3.1.2.1. Kết quả định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.
Trình tự nucleotide gien N của 47 chủng vi rút dại được đưa vào phân tích, trong đó có:
 31 chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc, 2006 – 2012 (kết quả từ đề tài nghiên cứu);
 8 chủng vi rút dại lưu hành ở miền Nam, Tây Nguyên, 2006 – 2009 (tham khảo tại
ngân hàng gien);
 8 chủng vi rút dại đại diện cho 7 genotype của Lyssavirus và chủng vi rút sản xuất vắc
xin.
Hiện nay, để xác định được genotype của vi rút dại có hai phương pháp phổ biến là phương
pháp huyết thanh học và phương pháp sinh học phân tử. Phương pháp huyết thanh học cần sử
dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kiểu gien để định týp các vi rút dại hoang dại phân
lập được. Phương pháp này đòi hỏi phải phân lập được vi rút, mà việc phân lập vi rút trên các
mẫu bệnh phẩm lâm sàng của người trong giai đoạn bệnh nhân vẫn còn sống (dịch não tủy,
nước bọt) là vô cùng khó khăn và phải có hệ thống huyết thanh chuẩn của từng týp huyết
thanh. Do đó mất nhiều thời gian và kém hiệu quả so với kỹ thuật sinh học phân tử. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gien (sequencing) N, so sánh trình tự
gien N của các chủng vi rút dại lưu hành ở Việt Nam với các chủng vi rút đại diện cho 7
genotype của lyssavirus để xác định kiểu gien của vi rút dại hoang dại lưu hành ở Việt Nam.
Kỹ thuật sequencing cho phép xác định kiểu gien nhanh, có độ chính xác cao, tránh được
những nhầm lẫn giữa các kiểu gien khác nhau [22, 23, 27, 39].
3.1.2.2. Mối liên hệ của các chủng vi rút dại lưu hành ở Việt Nam và một số nước lân
cận
Bản đồ lưu hành các nhóm vi rút dại ở miền Bắc Việt Nam (hình 3.6) cho thấy sự có sự lưu
hành của vi rút thuộc nhóm 1 ở 5 tỉnh/thành phố thuộc miền Bắc. Có tới 4 tỉnh đồng thời có sự
lưu hành của vi rút thuộc nhóm 1 và nhóm 2 là các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Phú Thọ và Hà Nội.
So sánh bản đồ lưu hành vi rút dại tại miền Bắc 2006 – 2012 (Hình 3.6) và bản đồ sự lưu
hành vi rút dại 2006 – 2009 (hình 3.7) cho thấy có sự mở rộng địa lý lưu hành vi rút sang các
tỉnh Thái Bình, Lào Cai so với giai đoạn 2006 – 2009 (Nguyễn Thị Kiều Anh và CS) và đồng
thời giai đoạn 2010 – 2012 thấy có sự xâm nhập vi rút nhóm 1 vào các tỉnh Sơn La, Phú Thọ.
Đây có thể là do có sự xâm nhập vi rút dại giữa các vùng lân cận, phải chăng là do sự di
chuyển của đàn chó dại sang các vùng xung quanh một cách tự nhiên hoặc thông qua việc vận
chuyển chó trong thời kỳ ủ bệnh từ vùng này sang vùng khác làm lây lan bệnh dại. Do vậy, cần


phải có biện pháp phòng chống hữu hiệu như tiêu hủy toàn bộ đàn chó mắc bệnh và có nguy cơ
mắc bệnh tại vùng công bố dịch, tiêm phòng vắc xin cho đàn chó ở các khu vực lân cận,
nghiêm cấm vận chuyển chó bị bệnh, chó chưa được tiêm phòng từ vùng này sang vùng khác
3.2. Kết quả phân tích đặc điểm phân tử nucleoprotein của các chủng vi rút dại lƣu
hành tại Việt Nam, 2006-2012.
3.2.1. Đặc điểm chung về phân tử nucleoprotein của vi rút dại
Protein N của vi rút dại (chủng PV) gồm có 450 axit amin (một số vi rút có 451 axit amin),
một trong số chúng được phosphoryl hóa, và có trọng lượng phân tử khoảng 57 kDa. Trình tự
axit amin của protein N là bảo tồn nhất trong số các protein của vi rút dại ở cả 7 genotype. Do
đặc tính tự nhiên được bảo tồn của gien N, nên có một mức độ đa dạng di truyền tương đối cao
trong các đoạn ngắn của gien N giữa các genotype (Conzelmann và cộng sự., 1990; Bourhy và

cộng sự., 1993, 1999; Kissi và cộng sự., 1995; Kuzmin và cộng sự., 2005). Một nguyên nhân
quan trọng về mức độ bảo tồn cao của trình tự axit amin, đặc biệt ở những vùng đặc hiệu của
gien N, có thể là do chúng giữ các chức năng quan trọng. Mặt khác, những khác biệt về axit
amin có thể là do các epitope chuyên biệt genotype trên gien N có khả năng phân loại các vi
rút thành các genotype khác nhau dựa trên cơ sở các kiểu hoạt tính của chúng (đặc tính kháng
nguyên) nhờ một bộ mẫu chuẩn các kháng thể đơn dòng kháng N (Mabs) (Flamand và cộng
sự., 1980a; Dietzschold và cộng sự., 1987a; Smith, 1989). Sự đa dạng về chất lượng trong gien
N cũng được khai thác ở mức độ nucleotide bằng kỹ thuật PCR (Sacramento và cộng sự,
1991; Bourhy và cộng sự, 1993; Kuzmin và cộng sự, 2003). Vị trí gắn trên gien N để giúp
chúng có khả năng tương tác với ARN của vi rút được đặt trên một vùng gien N từ axit amin
298 đến 352 (Kouznetzoff và cộng sự, I998). Sau khi gắn vào ARN của vi rút, gien N thực
hiện việc thay đổi cấu tạo thì cần một số epitop, mà một trong số chúng cho phép axit amin
serine (S) tồn dư ở vị trí 389 trên gien N được phosphoryl hóa (Dietzschold và cộng sự, 1987a;
Anzai và cộng sự., 1997; Kawai và cộng sự., 1999; Toriumi và Kawai, 2004). Trong quá trình
sao chép ARN ở tế bào nhiễm bệnh, có ý kiến cho rằng việc tạo vỏ capsid của ARN vi rút mới
là do gien N tạo ra một hình dáng giống vỏ capsid làm thay đổi gien N từ đó tạo ra tồn dư S389
cần thiết cho quá trình phosphoryl hóa (Kawai và cộng sự., 1999). Sau đó quá trình phosphoryl
hóa gien N củng cố mối tương tác giữa gien N và P trong phức hợp RNP của vi rút dại
(Toriumi và Kawai, 2004). Từ đó suy luận rằng quá trình phosphoryl hóa của gien N sau khi
tạo vỏ capsid ARN là rất quan trọng trong việc điều chỉnh việc sao chép và dịch mã ARN của
vi rút (Yang và cộng sự., 1999; Wu và cộng sự., 2002; Liu và cộng sự., 2004).
Mức độ đồng nhất nucleotide khi phân tích trình tự nucleotide của gien N gồm 500
nucleotide – Nu của các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc, Việt Nam, 2006 – 2012 với
các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Nam 2006 – 2009 và một số nước lân cận cho thấy có
độ đồng nhất cao và cao nhất với nhóm chủng phân lập ở miền Nam, Việt Nam (87,7% -
99,2%) , tiếp đó tới nhóm chủng phân lập ở Philippines (87,5% - 100%), Trung Quốc –
Guangxi (82,2% - 92,8%) và thấp nhất là các chủng phân lập tại Tây Á (81,8% – 88,6%). Độ
đồng nhất nucleotide ở đoạn gien N phân tích của các chủng vi rút phân lập ở Việt Nam so với
các chủng vi rút sản xuất vắc xin dại dại Fuenzalida (chủng PV); Verorab (chủng PM) và
chủng Vnukovo – 32 là 84,5% - 96,9%.

năm 2008; 1 chủng trên người vào năm 2012; 3 chủng phân lập trên chó tại Yên Bái vào năm
2012 và chủng hoang dại có nguồn gốc từ một con bò dại ở Trung Quốc đăng ký trên ngân
hàng gien năm 2007. Điều đó có thể do sự xâm nhập vi rút vào các tỉnh biên giới Việt Nam từ
các tỉnh miền Nam Trung Quốc, nơi đang là điểm nóng của bệnh dại tại Trung Quốc trong
những năm gần đây [51] hoặc ngược lại thông qua sự di chuyển tự nhiên của các con vật bị dại
hoặc thông qua việc buôn bán động vật nhiễm dại qua con đường tiểu ngạch mà không được
kiểm soát.
Sự xuất hiện aa đặc trưng ở vị trí D110 ở hầu hết các chủng vi rút phân lập được trên người và
chó tại các tỉnh Hà Nội, Tuyên Quang, Thái Bình, Hòa Bình, Phú Thọ và một số chủng vi rút ở


Trung Quốc cho thấy chắc chắn có sự nhiễm chéo vi rút ở các vùng biên giới giữa hai nước, từ
đó vi rút phát tán sang các vùng lân cận. Điều đó giúp cho xây dựng chiến lược phòng chống
bệnh dại phải bao gồm việc kiểm soát sự xuất nhập khẩu động vật qua biên giới và truyền
thông người dân không buôn bán động vật qua con đường tiểu nghạch mà không được kiểm
soát bệnh dại.
Các aa đặc trưng tìm được sẽ giúp chúng ta theo dõi đặc điểm vi rút học cũng như sự lưu
hành của các chủng vi rút hoang dại trên quần thể ổ chứa, vector và người để có những biện
pháp can thiệp hữu hiệu nhằm giảm thiểu sự phát tán vi rút từ ổ chứa, vector và lây truyền sang
người. Đồng thời việc giám sát dịch tễ học phân tử vi rút dại thường xuyên là cần thiết để đưa ra
chiến lược đúng đắn cho phòng chống bệnh dại, đặc biệt là kiểm soát bệnh dại ở những vùng
biên giới, đồng thời đánh giá kết quả khống chế, phòng chống bệnh dại ở động vật và người
trong từng quốc gia cũng như trong khu vực.
Qua phân tích đặc điểm nucleotide và axit amin của các chủng vi rút dại lưu hành tại
miền Bắc Việt Nam chưa phát hiện được sự thay đổi các aa hoặc SNP liên quan đến chức năng
độc lực, sinh miễn dịch của gien N đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây [22, 23,
27, 39].

KẾT LUẬN

1. Xác định và định týp vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.
 Các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012 đều thuộc
genotype 1 của Lysavirus và được chia làm 2 nhóm.
 Cả hai nhóm vi rút dại đều có các nhánh được tạo thành từ các chủng vi rút phân lập ở
miền Bắc Việt Nam và một số chủng vi rút dại lưu hành tại Trung Quốc.
2. Đặc điểm nucleoprotein của vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 –
2012.
 Mức độ tương đồng axit amin và nucleotide của các chủng vi rút dại lưu hành ở miền
Bắc Việt Nam năm 2006 - 2012 so với các chủng sản xuất vắc xin (PM, PV và
Vnukovo) là 92,2 – 97,1% và 84,5 – 96,9%.
 Xuất hiện các chủng vi rút mang đa hình đơn nucleotide đặc trưng ở vị trí T124 và
C330 trên trình tự nucleotide của gien N của vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt
Nam và một số chủng lưu hành ở Trung Quốc.
 Các đa hình đơn nucleotide xuất hiện tạo nên các axít amin đặc trưng tại vị trí S42
(Serin 42) và D110 (Aspartic 110) trên gien N của vi rút dại lưu hành tại miền Bắc
Việt Nam và một số chủng lưu hành ở Trung Quốc .

KIẾN NGHỊ
1. Cần phải tăng cường giám sát phòng thí nghiệm vi rút dại và nghiên cứu đặc điểm
dịch tễ học phân tử của vi rút để hiểu rõ về nguồn gốc các vụ dịch bùng phát, góp
phần xây dựng chiến lược phòng chống bệnh dại hiệu quả trong tương lai.
2. Cần thực hiện các biện pháp truyền thông cho những đối tượng có nguy cơ như người
làm nghề giết mổ chó, mèo, nhân viên thú y cần phải tiêm phòng vắc xin dại trước
phơi nhiễm.
3. Thúc đẩy việc thực thi nghị định 05 của Chính Phủ về kiểm soát bệnh dại ở động vật
như nuôi chó phải đăng ký và tiêm phòng cho chó; không giết mổ động vật nghi dại;
thực hiện đúng nguyên tắc xuất, nhập khẩu động vật; tiêu hủy động vật bị dại và xử lý
ổ dịch đúng quy định.

References
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Vĩnh Đông, Ngô Châu Giang, Nguyễn Thị Hồng
Hạnh, Phạm Hồng Nhung (2009), "Đặc điểm genotype của các chủng virus dại lưu
hành ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam trong năm 2007 – 2008”, Tạp chí nghiên cứu
Y học tập 60, số 1- 2/2009, tr.25 – 30,.
2. Nguyễn Thị Kiều Anh (2010), "Thích nghi chủng vaccine dại Vnukovo-32 trên tế bào
Vero và ứng dụng trong sản xuất vắc xin thử nghiệm", Luận án tiến sĩ Y học, Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Vĩnh Đông, Nguyễn Tuyết Thu, Ngô Châu Giang,
Satoshi Inoue, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2011), " Đặc điểm phân tử nucleoprotein của
một số chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2011", Tạp chí nghiên
cứu Y học tập 85, số 5-6/2011, tr.40 – 45,.
4. Lê Huy Chính và cộng sự (2003), “Vi Sinh Y học”. Đại học y Hà Nội, tr: 264 – 267.
5. Đào Đình Đức, Trần Văn Tiến và CS (1990), “Bệnh dại, biện pháp phòng chống”. Bộ
y Tế, tr: 1 – 10.
6. Ngô Châu Giang (2011), " Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật RT -LAMP trong chẩn
đoán vi rút dại ", Luận văn thạc sỹ Y học, Đại học Y, Hà Nội
7. Vũ Thị Hà (2009), "Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh dại", Khóa
luận tốt nghiệp cử nhân y khoa: tr. 21-23.
8. Thái Hà, “Chết vì bệnh dại từ chó mèo gia tăng”. Báo Sức Khoẻ Đời Sống, số ra 14/
8/ 2006.
9. Nguyễn Thị Hạnh (1975), "Hỏi và đáp về bệnh dại", NXB Y học: tr. tr: 5-11.
10. Hoàng Minh Hiền (2001), "Nghiên cứu vắc xin mẫu chuẩn quốc gia phòng bệnh dại",
Luận án Tiến sĩ Y học.
11. Nghị định số 05/ 2007/ NĐ - CP (1/2007), “Chương III: Chống dịch bệnh dại ở động
vật”, tr: 3 – 4.

12. Lê Duy Thành và CS (2008), “Cơ sở sinh học phân tử”. NXB Giáo Dục, tr: 134 – 153.
13. Phạm Hùng Vân (2009), "PCR và realtime PCR, các vấn đề cơ bản và các áp dụng
thường gặp": tr. tr 9-36.
14. Phạm Hùng Vân (2009), "PCR và giải trình tự": tr. tr 81-87.
15. Tạ Thành Văn (2009), "Nguyên lý ứng dụng của PCR và một số kỹ thuật y sinh học
phân tử": tr. tr:10-12.
16. Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương (2010), "Virus y học": tr. tr.139-156.
17. Đinh Kim Xuyến, Trần Văn Tiến (1996), “Một số nhận xét về tình hình bệnh dại ở
Việt Nam trong 5 năm 1991 – 1995”. Tạp chí Vệ Sinh Phòng Dịch, IV, tr 19 – 20.
18. Đinh Kim Xuyến (2001), “Bệnh dại ở Việt Nam”. Tập san của Hội nghị Quốc tế
“Giám sát bệnh dại ở châu á” lần IV, HN 3/ 2001, tr:19 – 20.
19. Đinh Kim Xuyến (2007), "Tình hình bệnh dại ở Việt Nam từ 1994 – 2007".

Tiếng Anh
20. Anh K.T. Nguyen, Dong V. Nguyen, Giang C. Ngo, Thu T. Nguyen, Satoshi Inoue,
Akio Yamada, Xuyen D. Kim, Dung V. Nguyen, Thao X. Phan, Bao Q. Pham, Hien
T. Nguyen, and Hanh T. H. Nguyen (2011), "Molecular of rabies virus in Vietnam,
2006 – 2009", Jpn, J. Infect. Dis., 64, pp 391 – 396.
21. Baer GM., Bellini WJ., (1990), “Rhabdoviruses”, Virology, Second Edition Field BN
ed., pp 883- 930.
22. Bourhy, H., Kissi, B., Tordo, N. (1993), "Molecular diversity of lyssavirus genus",
Virology, 194, pp 70 – 81


23. Bourhy, H. (2008), "Rabies diagnosis", Conference of sharing information on rabies
control and prevention among ASEAN plus three countries, setion 5, 21 – 24 April,
2008.
24. B. Boldbaatar, S. Inoue, N. Sugiura, A. Noguchi, (2009), "Rapid detection of rabies
virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification", Jpn J Infect
Dis, 62(3): tr. 187-91.

25. Center for Disease control (1997), “Rabies in a Laboratory worker”, New York
MMWR 26, pp 183- 184.
26. Charles V. Trimarchi and Jean S. Smith (2001), “Postmortem diagnosis of rabies in
animal”, Rabies, pp 309 – 319V .
27. Charles V. Trimarchi and Jean S. Smith (2001), “Diagnosis of rabies in human”,
Rabies, pp 337 -342.
28. Conzelmann, K. K., J. H. Cox, et al. (1990), "Molecular cloning and complete
nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19", Virology 175(2), pp.
485-99.
29. Dietzschold B., Koprowski H. et al. (1996), “Rhabdoviruses”, Fields Virology, 3
rd

Edition, 38, pp. 1145-1151.
30. Dinh Kim Xuyen & Et Al (2004), "Rabies situation in Viet Nam", Proceedings of the
2nd Vietnam – Laos – Cambodia symposium, July 2004, Hanoi, Vietnam.
31. Dong-Kun Yang, Young-Nam Park, Gyeong-Soo Hong, Hee-Kyung Kang,Yoon-I
Oh, Soo-Dong Cho, Jae-Young Song (2011), "Molecular characterization of Korean
rabies virus isolates", J. Vet. Sci., 12 (1), 57-63.
32. Eiken Chemical Co. & Ltd. "The principle of LAMP method", loopamp.eiken.co.jp.
33. Fishbein D.B. (1991), "Rabies in human", Nature history of Rabies. 2nd ed.; Ed. Baer,
G.M; CRCD press: tr. pp. 519-549.
34.
35. Heiman F. L. Wertheim, Thai Q. Nguyen, Kieu Anh T. Nguyen, Menno D. de Jong,
Walter R. J. Taylor, Tan V. Le, Ha H. Nguyen, Hanh T. H. Nguyen, Jeremy Farrar,
Peter Horby, Hien D. Nguyen (2009), “Furious rabies after an atypical exposure”,
Plos Medicine, Volume 6, Issue 3, pp. 1-5.
36. Hien Tran Nguyen (2009), “Rabies in Vietnam”, The second international rabies in
Asia conference (RIACON) proceeding, Hanoi, Vietnam Sep. 2009.
37. Jackson (2002), "Human Disease", Rabies: tr. 219 - 244.
38. James E. Childs (2002), "Rabies: Routes of rabies virus transmission to humans",

Academic press, pp 125 – 126.
39. Kissi, B., Tordo, N and Bourhy, H. (1995), "Genetic polymorphism in the rabies virus
nucleoprotein gen", Virology, 209, pp 526 – 537.
40. Kureishi A, Xu LZ, Wu H, Stiver HG (1992), "Rabies in China: Recommendations
for control", Bull World Health Organ 70: 443-4750.
41. Ky Dang Van (2007), “Animals rabies control and prevention in Vietnam”, ASEAN +
3 conference on sharing information on rabies and prevention, Halong, Vietnam Apr.
2007.
42. Mcevoy Gerald K. (2005), "Rabies Vaccine", AHFS Drug Information: tr. 3303 -
3310.
43. National Institute of Hygiene Epidemiology (2012), "Rabies conference for 10 main
point rabies provinces", held in ThaiNguyen, June, 2012.
44. N. Mori, Y. Motegi, Y. Shimamura, T. Ezaki, (2006), "Development of a new method
for diagnosis of rubella virus infection by reverse transcription-loop-mediated
isothermal amplification", J Clin Microbiol, 44(9): tr. 3268-73.


45. Perry Ll. (1990), "Rabies vaccines from Pasteur’s time up to experimental subunit
vaccines today", Viral vaccines: tr. 325-345.
46. Qi Liu, Yi Xiong, Ting Rong Luo, You-Chuan Wei, Song-Jian Nan, Fang Liu,Yan
Pan, Li Feng, Hua-Ming Li (2007), "Molecular epidemiology of rabies in Guangxi
Province, south of China", Journal of Clinical Virology, 39, pp 295–303.
47. Tordo N. (1996), "Characteristic and molecular biology of the rabies virus",
Laboratory Techniques in rabies, 4th edition: pp 28 – 50.
48. Selimov M. A. (1982), "Rabies", Moscow Medistina: tr. 182 - 185.
49. Wagner RR., (1990), “Rhabdoviridae and their replication”, Field BN, Knipe
DM,eds.Virology. NewYork, Raven Press, pp 867-881.
50. Wallerstein C (1999), "Rabies cases increase in the Philippines". BMJ 318: 1306.
51. Xiao-Yan Tao, Qing Tang, Hao Li, Zhao-Jun Mo, Hong Zhang, Ding-Ming Wang,
Qiang Zhang, Miao Song, Andres Velasco-Villa, Xianfu Wu, Charles E. Rupprecht,

and Guo-Dong Liang. (2009), "Molecular Epidemiology of Rabies in Southern
People’s Republic of China", Emerging Infectious Diseases, Vol.15, No. 8, pp
1192-1198.
52. Yamagata J, Ahmed K, Khawplod P, Mannen K, Xuyen DK, Loi HH, Dung NV,
Nishizono A. (2007), "Molecular epidemiology of rabies in Vietnam",
Microbiol.immunol., 51 (9), 833 – 840.
53. Yokosuka O.&Omata M Tagawa M. (1992), "Polymerase Chain Reaction": tr. 322 –
326.
54. Zhang YZ, Xiong CL, Zou Y, Wang DM, Jiang RJ, Xiao QY, et al. (2006),
"Molecular characterization of rabies virus isolates in China during 2004", Virus Res.,
121:179–88.