Tính kháng thuốc Oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012 (tóm tắt)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thế kỷ XX, căn nguyên vi rút là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch
nguy hiểm đe doạ tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người, điển hình là các
vụ dịch xảy ra như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm
2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Tại Việt Nam, số người mắc
cúm có xu hướng tăng lên sau mỗi năm. Các phương pháp áp dụng trong điều trị và
phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Văc
xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm
trước vụ dịch cúm. Sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir )
là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm. Sự tương tác
của thuốc với vi rút có thể gây sự kháng thuốc của vi rút. Việc tìm hiểu khả năng
kháng thuốc và mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ
điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan truyền của hiện tượng kháng thuốc
trong quần thể. Tại Việt Nam quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005
dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường
đại học Oxford thuộc bệnh viện bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên,
các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ báo cáoở mức độ từng ca bệnh
hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, mà chưa có một nghiên cứu hệ thống theo dõi quá
trình kháng thuốc và sự tiến hoá của chủng vi rút cúm A theo thời gian. Để tìm hiểu
hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ
và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống
trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A.
Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc
oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với
mục tiêu:
- Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC
50
) vi rút

cúm A tại miền Bắc Việt Nam.
- Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir
thông qua giá trị ức chế 50% (IC
50
).
- Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm
với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và
trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Đây là công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên thực hiện có hệ thống để xác
định tính kháng thuốc của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong
giai đoạn từ 2001 đến 2012.
2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là các kỹ thuật xét nghiệm mới
cập nhật trong những năm gần đây.
3. Kết quả nghiên cứu đã xác định được giá trị IC
50
ngưỡng,tỉ lệ và mức độ giảm
nhạy cảm với oseltamivir củacác phân típ chủng vi-rút cúm A lưu hành tại
miền Bắc Việt Nam, 2001-2012. Đây là các công bố đầu tiên về giá trị ngưỡng
tương tác của virut cúm A với oseltamivir tại Việt nam cho phép nhận định
2

mức độ kháng thuốc của vi rút cúm A, từ đó có thể phối hợp với bác sĩ lâm
sàng đưa ra phác đồ điều trị phù hợp.
4. Kết quả nghiên cứu so sánh về sự tương đồng di truyền học giữa các vi rút
cúm A được xác định giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành tại miền Bắc
Việt Nam với các vi rút cúm A lưu hành trong nước, trong khu vực và trên thế
giới trong giai đoạn 2001-2012 cho thấy sự các vi rút cúm A giảm nhạy cảm
với oseltamivir lưu hành song song cùng với các chủng cúm thông thường
khác, kết quả này cũng bổ sung thêm thông tin về sự tiến hóa của vi rút cúm A

tại Việt Nam.
5. Nghiên cứu về tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm theo chiều dọc thời
gian từ 2001-2012 với các số liệu thu thập được là cơ sở dữ liệu đầu tiên về sự
tương tác của vi rút cúm với oseltamivir tại Việt Nam.
Bố cục luận án: Luận án dày 103 trang gồm:
Đặt vấn đề 3 trang

Chương I: Tổng quan 34 trang

Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp
nghiên cứu
16 trang

Chương III: Kết quả 32 trang

Chương IV: Bàn luận 15 trang

Kết luận 2 trang

Kiến nghị 1 trang

Luận án có 23 hình vẽ, 11 bảng, 6 biểu đồ và 2 sơ đồ. Trong 123 tài liệu tham khảo
có 6 tài liệu Tiếng Việt và 117 tài liệu Tiếng Anh.
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN
1.1. Vi rút cúm A
1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A
Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A
Hệ gen của vi rút cúm A: Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein.
Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần. Đoạn RNA 1,
3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA.Phân

đoạn 2, 7 và 8 mỗi phân đoạn mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-
M2 và NS1-NS2.
Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút:
Heamaglutinin (HA): Heamaglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa
bởi đoạn RNA số 4 có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu
sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Trên bề mặt tế bào người, HA gắn vào thụ thể
alpha 2,6 axit sialic; trên tế bào gia cầm, HA gắn vào thụ thể alpha 2,3 axit sialic; trên
tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể .
Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme,
neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được
phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho
quá trình cắt đứt mối liên kết α 2,3 hoặc α 2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề
mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ
3

Các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau. Các phân típ
NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2,
H9N2) và gần đây là N9 (H7N9).
Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 mã hóa cho hai protein M1 và
M2.Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút. M2 là một
protein xuyên màng, hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H
+
từ nội
bào vào trong vi rút, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm
nhiễm
Các polymerase PB1, PB2, PA và nucleoprotein (NP):Tồn tại trong hệ gen của vi
rút cúm còn có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA
polymerase: phức hợp PA-PB1-PB2.NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ
gen của vi rút cúm có tính bảo tồn cao, chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào
quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới.

1.1.2. Cơ chế nhân lên của virút cúm A
Vi rút cúm A nhân lên qua bốn giai đoạn: Sự bám dính, sự thâm nhập, sự cởi áo,
tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút. Vi rút cúm bám vào tế bào
biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamoglutinin gắn vào phần axit sialic của
glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào (α2,3 hoặcα 2,6 axit sialic). Vi rút tiến
vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào. Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình
trạng pH thấp trong thể thực bào, phá vỡ vỏ giải phóng RNP vào tế bào chất của tế
bào chủ. RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào, các RNP và
M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút. Hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài
màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của enzyme
neuraminidase.
1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A
Những thay đổi nhỏ trên gen
Enzyme polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có
chức năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên và đã
tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới. Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã
hóa HA và NA tác động lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới. Những biến
đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút cúm với kháng
thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút mang những biến
đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng năm.
Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên
Sự biến đổi lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên tạo nên vi rút tuy
cùng mang tên một phân typ vi rút (vd: H1N1) nhưng bản chất vi rút đã có sự thay
đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết quả đáp ứng
chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết.
Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng
chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới
(đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1).
1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, với vật liệu di truyền phân đoạn như vậy, sự tái

sắp xếp của vật liệu di truyền giữa các chủng vi rút cúm có khả năng xảy ra khi có sự
4

đồng nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân typ khác nhau trên một vật chủ, kết quả
là sự tạo ra một loại vi rút thế hệ mới trong đó cấu trúc gen là sự trộn và sắp xếp lại
của các vi rút cúm đồng nhiễm.
1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm
Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra. Đường
lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua là qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút
tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành. Từ đầu thế kỷ XX đến nay,
thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm
cúm. Bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh rõ rệt vào mùa đông
xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và mùa hạ với sự lưu hành
của các chủng thuộc phân typ cúm A (tháng 7 – tháng 8).
1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A
Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền học
với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen. Sự tiến hóa của vi rút cúm A còn được
khẳng định là sự tiến hóa thích nghi. Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi
rút cúm A chưa được đánh giá một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng
gia cầm, tiêm văc xin hay sử dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng
đến sự tiến hóa.
1.2. Phòng và điều trị vi rút cúm A
1.2.1.Văc xin phòng cúm
Các loại văc xin đưa vào sử dụng gồm hai chủng A (một chủng A/H3N2 và một
chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được lựa chọn từ hơn 100 trung tâm
cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới. Các loại văc xin cúm bao gồm: Văc
xin bất hoạt, Văc xin sống giảm độc, Các loại văc xin thế hệ mới (reverse genetic văc
xin, DNA văc xin)
1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A
Các thuốc dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm

Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, Cơ chế tác dụng của
các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H
+

không thể đi vào bên trong virút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình
hòa màng của vi rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình ”cởi áo” vi rút để xâm nhập
vào bên trong tế bào chủ Hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra với các chủng cúm
A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến trên gen M (phần M2).
Các thuốc dòng ức chế neuraminidase
Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt
neuraminidase của vi rút cúm. Ức chế quá trình phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào
chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi, vi rút chỉ có khả năng nhiễm
và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế bào lành
khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút. Sự đột biến trên protein NA làm giảm
hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase.
1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới
Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào (ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào
– DAS181); Các thuốc ức chế neuraminidase (Peramivir và Laninamivir); Thuốc ức
chế sự tái tạo vi rút của vi rút cúm - T-705.
5

1.3.Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút
1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine
Được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước, amatadine có hiệu quả điều trị
chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2,
H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm
A. Sau 7 năm đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị
và phòng bệnh có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất hiện và lan
truyền nhanh trong quần thể. Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm 2002 tăng lên
12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005. Theo kết quả của các

nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của virút cúm A cho thấy 100% các virút cúm
A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine.
1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir
Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt
neuraminidase của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999. Gần đây các
nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng vi rút kháng lại
oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm 2009. Các chủng
kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm 2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm
2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009 với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ,
Châu Âu). Các phân típ H5N1, H1N1pdm09 cũng đã được ghi nhận các trường hợp
kháng oseltamivir trên thế giới và tại Việt Nam.
1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm
A
1.4.1. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự
thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm
Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger (phương pháp thông thường):Kỹ thuật được thực
hiện có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm. Điển
hình là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng
kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để
xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine
Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length
Polymorphism): Enzyme giới hạn BspHI hoặc BclI sẽ cắt sản phẩm PCR tại với vị
trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi
rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm
PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn.
Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định (pyro-
sequencing): Mục tiêu chính của phương pháp là xác định các điểm đột biến có sẵn
trên cỡ mẫu lớn trong thời gian ngắn.
Kỹ thuật realtime RT-PCR: Kỹ thuật này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm
2008 với ứng dụng tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của

virút cúm A/H1N1.
1.4.2. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của
enzyme neuraminidase
Xác định hoạt động của NA
6

Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động
của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước khi
thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút.
Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir
*Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc
hóa học
Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa vào
sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence). Kết quả thu được
từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều phòng thí
nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát bệnh dịch
Hoa Kỳ (US CDC), PTN tại viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản.
*Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang
Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của enzyme neuraminidase với thuốc ức
chế hoạt động của enzyme (oseltamivir, zanamivir ) có sử dụng chất huỳnh quang
trong thành phần của phản ứng. Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc
ức chế 50% hoạt động của vi rút. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN
do khả năng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y
tế thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút.
1.4.3. Giám sát sự kháng thuốc virút cúm
Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm
Các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn (SOP) nhằm tạo tiền đề
cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự kháng thuốc của vi rút cúm
tại phòng thí nghiệm.
Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm

Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi
rút thuộc Hiệp hội quốc tế về cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác(ISIRV)
khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác định biểu hiện kháng thuốc của các
chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất huỳnh quang, sau đó các chủng có
biểu hiện kháng thuốc sẽ được xác định vị trí đột biến liên quan đến kháng thuốc trên
gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự gen thông thường hoặc realtime RT-
PCR. Quy trình này hiện nay đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu
của TCYTTG tại CDC-Altanta, Melbourne-Úc và NIID-Nhật Bản. Theo quy trình
này, các chủng mang đột biến kháng thuốc sẽ được giám sát sự tiến hóa trong quá
trình tiến hóa chung của vi rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình
đặc thù của vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam.







7

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi rút cúm thuộc nhóm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H3N2,
A/H5N1, A/H1N1 đại dịch 09 phân lập được tại phòng thí nghiệm cúm từ năm 2001
đến 2012 từ các nguồn: Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005, chương trình giám
sát cúm quốc gia 2006 – 2012 và giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012.
Các chủng vi rút được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà
Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh
Hóa.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau
khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế
neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được giải
trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến kháng
thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút (ref). Tuy
nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi rút, toàn bộ chủng
cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA.
2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm
Chủng vi rút: Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng
bao gồm: 42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09
thu thập từ tháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từ năm 2003 đến
2012 và 28 chủng H5N1 thu thập từ năm 2004 đến 2012
Kỹ thuật xét nghiệm: Phân lập vi rút, xác định nồng độ oseltamivir ức chế
neuraminidase và giải trình tự gen
Sinh phẩm: Tế bào MDCK (CDC) phân lập vi rút cúm; Giải trình tự gen sử dụng bộ
kit của hãng ABI, Mỹ, mồi được cung cấp bởi CDC; xác định nồng độ oseltamivir ức
chế neuraminidase sử dụng bộ kit của hãng Life Technology, Mỹ, oseltamivir được
cung cấp bởi hãng Roche.
2.4. Phân tích số liệu
Các giá trị IC
50
thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm
JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ. Giá trị ngưỡng và mức độ kháng
oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm Graphpad
Prism 6.0.2, Mỹ.
Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi được
giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến kháng
thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA và Bioedit phiên bản 7.2.3; cây
gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử

dụng phương pháp Maximum Likelihood. Các trình tự phân đoạn gen HA và NA
tham chiếu thuộc các phân típ vi rút tương ứng được thu thập từ ngân hàng dữ liệu
DNA (www.ncbi.com).



8

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ

3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 - 2012
Số lượng các vi rút lưu hành trong mỗi năm cũng như ưu thế của từng phân típ vi
rút thể hiện sự khác nhau. Phân típ vi rút A/ H1N1 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (100%) trong
các năm 2001, 2002 và 2006, và tỷ lệ này giảm tại năm 2003 (74%), 2008 (54%).
2009 (4,5%) và hoàn toàn không xuất hiện trong các năm sau. Sự xuất hiện lần đầu
tiên của phân típ A/H1N1pdm09 vào năm 2009 với tỷ lệ 65,1% (2009) và ở mức
46,4% năm 2010, 98,3% năm 2011và không phát hiện trong năm 2012. Phân típ
A/H3N2 không có đại diện trong nghiên cứu tại các năm 2001, 2002, 2006 (0%)
nhưng là phân típ vi rút có mặt hầu hết trong các năm nghiên cứu (9/12 năm) với tỷ
lệ dao động từ 1,7% (2011) đến 100% (2012). Với vi rút cúm gia cầm A/H5N1, lần
đầu tiên được ghi nhận gây bệnh cho người vào năm 2003 cũng có mặt trong nghiên
cứu (5%) và tiếp tục xuất hiện với tỷ lệ dao động từ 3,1% (2009) đến 60% (2005). Vi
rút A/H5N1 không xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam vào các năm 2006, 2011 và
2012.
3.2. Xác định giá trị IC
50
ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A
Toàn bộ vi rút sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng để xác định giá trị ngưỡng
cho từng phân típ, tuy nhiên phần mềm Graphad prism tự động loại bỏ các cá thể có
những giá trị vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (IQR) vì vậy số cá thể vi rút sử dụng

trong xây dựng giá trị ngưỡng không tương đồng với tổng số vi rút sử dụng trong
nghiên cứu, cụ thể: số vi rút cúm A/H1N1 sử dụng là 30/42 vi rút; A/H1N1pdm09 là
152/157 vi rút và A/H5N1 là 21/28 vi rút. Kết hợp với phân tích tứ phân vị, chúng tôi
có thể xác định được giá trị IC
50
ngưỡng của các vi rút tương đương với giá trị trung bình
IC
50
và giá trị trung vị (Q2) (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Giá trị IC
50
trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu
và giá trị IC
50
của các vi rút trong bộ chứng chuẩn.

Vi rút Số vi rút
Giá trị IC
50

trung bình (nM)

A/H1N1 30/42 0,413
A/H1N1pdm09 152/157 0,334
A/H3N2 115/115 0,164
A/H5N1 21/28 2,947
Vi rút chứng Giá trị IC
50
(nM)
A/Mississippi/03/2001

(A/H1N1)
0,5
A/Perth/265/2009
(A/H1N1pdm09)
0,6
A/Fukui/20/2004 (A/H3N2) 0,2
A/Vietnam/1194/2004
(A/H5N1)
1,3


9

3.2.1. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1
Giá trị ức chế 50% (IC
50
) của 30 chủng vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu có
giá trị trung bình dao động trong khoảng 0,061 – 0,765nM. Độ tập trung của giá trị
cho thấy tổng số 30/42 cá thể có giá trị IC
50
dưới giá trị IC
50
trung bình (0,413nM) và
12 cá thể còn lại có IC
50
lớn hơn giá trị ngưỡng. So sánh với vi rút chuẩn
A/Mississippi/03/2001 có giá trị IC50 là 0,5nM, giá trị IC
50
ngưỡng được xác định
cho phân típ vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu này chính là giá trị IC

50
trung bình đã
được xác định là 0,413 ± 0.352 nM
3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1pdm09
Với các chủng A/H1N1pdm09, sự dao động giá trị IC
50
trong tổng số 152 vi rút
được phân tích không nhiều, độ tập trung cao của 147/ 152 cá thể vi rút xung quanh
giá trị IC
50
trung bình 0,334nM được ghi nhận tại biểu đồ 3.3, tương tự giá trị IC
50

của vi rút tham chiếu chuẩn A/Perth/265/2009 là 0,6nM, vì vậy giá trị ngưỡng của vi
rút được xác định là 0,334 ± 0,286 nM.
3.2.3. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H3N2
Toàn bộ vi rút thuộc phân típ A/H3N2 có giá trị IC
50
vi rút trung bình dao động từ
0,04 đến 0,29 nM . Giá trị IC
50
trung bình 0,164 nM của các vi rút H3N2 tương
đương với giá trị IC
50
0,2 nM của vi rút tham chiếu chuẩn A/Fukui/20/2004, giá trị
IC
50
ngưỡng của phân típ vi rút cúm A/H3N2 được xác định là 0,164 ± 0,126 nM.
3.2.4. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H5N1
Tổng số 21/28 chủng vi rút cúm A/H5N1 được chấp nhận phân tích kết quả theo

chương trình Graphpad prism. Cụ thể theo từng vi rút cho thấy giá trị IC
50
nhỏ nhất
là 0,13 nM, lớn nhất là 8,98 nM. Các vi rút A/H5N1 có giá trị IC
50
tập trung gần
hoặc dưới giá trị IC
50
trung bình 2,947 nM (17/21), giá trị IC
50
của vi rút chủng vi rút
tham chiếu chuẩn A/Vietnam/1194/2003 (A/H5N1) là 1,3 nM. Giá trị ngưỡng của
phân típ cúm A/H5N1 được xác định là 2,947 ± 2,539 nM.
3.3 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A
3.3.1. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1
Tổng số 42 vi rút A/H1N1 lưu hành từ năm 2001 đến 2009 được thu thập, sử
dụng thử nghiệm ức chế neuraminidase, đã xác định được 12 vi rút H1N1 có giá trị
IC
50
cao hơn giá trị ngưỡng trong nghiên cứu. Toàn bộ các vi rút này được xác định
là vi rút lưu hành trong năm 2008 và 2009 (Bảng 3.3).
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi xác định được hai chủng cúm A/H1N1pdm09
là A/Vietnam/33419/09 có giá trị IC
50
125.99nM năm 2009 và A/Vietnam/36530/11
127.91nM năm 2011. Giá trị IC
50
của các chủng này tăng từ 350 – 400 lần so với
giátrị IC
50

ngưỡng của vi rút








10

Bảng 3.3. Giá trị IC
50
của H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009

Năm Tên chủng/Số chủng
Giá trị IC
50
(nM)±SD
Giá
trị
IC
50

ngưỡn
g
Giá trị IC
50
/ Giá
trị IC

50
ngưỡng
2001 8 0,28 ± 0,09
0,413
0,68
2002 4 0,51 ± 0,32 1,23
2003 14 0,33 ± 0,14 0,79
2006 3 1,06 ± 0,09 2,57
2008
A/Vietnam/TX285/08 534,23 ± 3,58 1294
A/Vietnam/TB289/08 1624,44 ± 4,52 3933
A/Vietnam/TX200/08 456,11 ± 5,38 1104
A/Vietnam/TX233/08 453,28 ± 9,39 1097
A/Vietnam/BT241/08 678,45 ± 6,12 1643
A/Vietnam/LS324/08 59,98 ± 2,35 145
2009
A/Vietnam/32036/09 704,20 ± 4,80 1705
A/Vietnam/EL197/09 581,24 ± 4,78 1407
A/Vietnam/Q271/09 464,86 ± 6,49 1126
A/Vietnam/31808/09 527,95 ± 15,75 1278
A/Vietnam/34381/09 575,72 ± 5,81 1273
A/Vietnam/N116/09 565,95 ± 11,17 1370
Chứng A/Mississippi/03/2001 458,2 1109

3.3.2 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1pdm09
H1N1pdm09. Ngoài ra, số liệu trong bảng 3.4 còn thể hiện giá trị IC
50
của ba
chủng H1N1pdm09 đã được thực hiện năm 2009 (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Giá trị IC

50
của H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011

Năm Tên chủng
Giá trị IC
50
(nM)±SD
Giá trị IC
50

ngưỡng
Giá trị IC
50
/ Giá trị
IC
50
ngưỡng
2009
A/Vietnam/32043/09
429,5 ±
10,25
0,334
1422
A/Vietnam/32060/09
323,66 ±
12,68
1072
A/Vietnam/32067/09 889,2 ± 9,73

2944

A/Vietnam/33419/09
125,99 ±
13,44
417
2011 A/Vietnam/36530/11
127,91 ±
9,84
356
Chứng A/Perth/261/2009 191,2 572


11

3.3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H3N2
Kết quả thử nghiệm NAI thực hiện trên 157 chủng vi rút A/H3N2 cho thấy giá trị
IC
50
của các chủng H3N2 dao động trong khoảng 0,038 – 0,29nM, không phát hiện
cá thể vi rút nào có giá trị nào vượt giá trị ngưỡng (0,164nM) từ 10 lần trở lên.
3.3.4. Mức độ giảm độ nhạy, kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm
A/H5N1
Số chủng vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu là 28 vi rút phân lập trên bệnh nhân
nhiễm vi rútA/H5N1trong giai đoạn từ 2004-2010. Kết quả nghiên cứu đã xác định
được 2 vi rút A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08 lưu hành năm
2008 có giá trị IC
50
đạt mức 19,04nM và 14,48nM. Hai vi rút này có giá trị IC
50
cao
hơn giá trị ngưỡng lần lượt là 6 lần và 5 lần. Ngoài ra, chủng

A/Vietnam/HN30408/05 có giá trị IC
50
đã được xác định năm 2005 tăng 30 lần so với
giá trị ngưỡng (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Giá trị IC
50
của hai chủng H5N1 năm 2005 và 2008
Năm Tên chủng
Giá trị IC
50
(nM)±SD
Giá trị
IC
50

ngưỡng
Giá trị IC
50
/ Giá
trị IC
50
ngưỡng
2005 A/Vietnam/HN30408/05 90 ± 5,82
2,947
30
2008
A/Vietnam/HN31412/08 19,04 ± 2,34

6
A/Vietnam/HN31413/08 14,48 ± 2,09

5
Chứng A/Vietnam/HN30408/05 90 30

3.3.5. Nhận định kết quả kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A lưu
hành 2001 – 2012
Kết quả bảng 3.7 cho thấy nhóm 12 vi rút cúm A/H1N1 với biểu hiện giá trị IC
50

cao hơn giá trị ngưỡng từ 145 - 3933 lần được xếp vào nhóm các vi rút giảm mạnh
độ nhạy cảm với thuốc oseltamivir Tương tự, nhóm 5 chủng vi rút H1N1pdm09 cũng
được xếp vào nhóm các vi rút giảm mạnh độ nhạy với oseltamivir khi giá trị IC
50
của
vi rút nhóm này cao hơn giá trị ngưỡng từ 356 đến 2944 lần. Vi rút H5N1 với giá trị
IC
50
chỉ lớn hơn giá trị ngưỡng 5-6 lần được đánh giá ở mức có biểu hiện giảm độ
nhạy (hai vi rút) và vi rút có giá trị IC
50
lớn hơn giá trị ngưỡng 30 lần được xác định
là giảm độ nhạy với osetlamivir. Toàn bộ số chủng vi rút cúm A/H3N2 trong nghiên
cứu đều được xác định là nhạy cảm với oseltamivir.
3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A liên quan đến
kháng thuốc oseltamivir
Các vi rút được phân tích trong nghiên cứu này là A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H5N1
thuộc phân típ NA1 (N1), vì vậy một số đột biến tương đồng và thường gặp trên phân
đoạn gen mã hóa N1 được ghi nhận là H275Y, N295S hoặc I117V sẽ được phân tích
bằng phương pháp phân

12

Bảng 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir

Năm Tên chủng
Giá trị IC
50
/
Giá trị IC
50

ngưỡng
Nhận định kết quả
Vi rút A/H1N1
2008
A/Vietnam/TX285/08

1294
Giảm mạnh độ nhạy cảm
(GMĐNC) của vi rút với
oseltamivir
A/Vietnam/TB289/08

3933
A/Vietnam/TX200/08

1104
A/Vietnam/TX233/08

1097
A/Vietnam/BT241/08

1643
A/Vietnam/LS324/08 145
2009
A/Vietnam/32036/09 1705
A/Vietnam/EL197/09

1407
A/Vietnam/Q271/09 1126
A/Vietnam/31808/09 1278
A/Vietnam/34381/09 1273
A/Vietnam/N116/09 1370
Vi rút A/H1N1pdm09
2009
A/Vietnam/32043/09 1422
GMĐNCcủa vi rút với
oseltamivir
A/Vietnam/32060/09 1072
A/Vietnam/32067/09 2944
A/Vietnam/33419/09 417
2011 A/Vietnam/36530/11 356
Vi rút A/H5N1
2005
A/Vietnam/HN30408
/05

30
GMĐNCcủa vi rút với
oseltamivir
2008
A/Vietnam/HN31412
/08
6
Có biểu hiện giảm ĐNCủa
vi rút với oseltamivir
A/Vietnam/HN31413
/08
5
tích trình tự chuỗi thông thường (Sanger sequecing). Kết quả sẽ được xác nhận khi so
sánh với trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút không có biểu hiện giảm độ nhạy
hoặc kháng oseltamivir và các vi rút tham chiếu chuẩn.
3.4.1. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1 liên
quan đến kháng thuốc oseltamivir
Năm vị trí đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir trên phân
đoạn gen mã hóa NA của các vi rút cúm A/H1N1 thường gặp là Q137K, Y156H,
I223V, S247G và H275Y. Kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa NA của
12 vi rút cúm A/H1N1 cho thấy: toàn bộ các vi rút này đều phát hiện đột biến tại vị
trí 275. Cụ thể, trình tự nucleotide đã có sự thay đổi từ CAC sang TAC, và protein
thay đổi tại vị trí này được ghi nhận là H275Y. Không phát hiện các đột biến liên
quan khác tại vị trí 137, 156, 223 hoặc 247.
13

3.4.2. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09
liên quan đến kháng thuốc oseltamivir
Vi rút cúm A/H1N1pdm09 được ghi nhận các đột biến liên quan đến hiện tượng giảm
độ nhạy hoặc kháng oseltamivir bao gồm I223M, I223K, S247N, H275Y và đồng đột

biến tại hai vị trí Q313K và I427T.









Hình 3.1. Đột biến tại vị trí 275 tr
ên
protein NA của các chủng cúm A/H1N1









Hình 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên
protein NA của các chủng cúm
A/H1N1pdm09
Tương tự với kết quả phân tích phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H1N1,
tổng số 5 vi rút A/H1N1pdm09 có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir đều xuất
hiện đột biến H275Y trên protein NA. Các đột biến khác tại các vị trí I223M, I223K,
S247N không được phát hiện trên các vi rút này.
3.4.3. Vị trí đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA của các chủng vi rút cúm

A/H5N1 liên quan đến kháng thuốc oseltamivir
Trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm gia cầm A/H5N1, các vị trí axit amin
thay đổi liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir bao gồm I117V, Q136L,
D199G, S247N, H275Y, N295S. Trong nghiên cứu này toàn bộ 28 vi rút cúm
A/H5N1 được phân tích trình tự chuỗi nucleotide (1413 nucleotide). Kết quả cho thấy
trong 3 vi rút có biểu hiện tăng IC
50
và đột biến tại vị trí H275Y phát hiện trên vi rút
A/Vietnam/HN30408, không phát hiện trên hai vi rút còn lại A/Vietnam/HN31412/08
và A/Vietnam/HN31413/08. Tuy nhiên đột biến tại vị trí I117V được phát hiện trên
hai chủng này.











Hình 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein
NA - A/H5N1

Hình 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA -
A/H5N1
14

Ngoài ra, chủng A/Vietnam/HN31209/07cũng được phát hiện mang đột biến I117V
trên phân đoạn gen mã hóa NA nhưng không xác định được giá trị IC
50
. Các đột biến
còn lại Q136L, D199G, S247N, N295S không được xác định trong nghiên cứu này.
3.5 Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-
2012
Vi rút được xác định giảm độ nhạy oseltamivir dựa vào hai yếu tố quyết định, mức độ
giảm độ nhạy (biểu hiện kiểu hình) và xuất hiện điểm đột biến liên quan đến kháng
thuốc xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa NA (kiểu gen) của cùng một vi rút. Bảng 3.8
cho thấy trong tổng số 20 vi rút được phát hiện có biểu hiện tăng IC
50
ở các mức độ
giảm độ nhạy khác nhau đều có xuất hiện đột biến liên quan. Đột biến được ghi nhận
phổ biến đó là H275Y (Histidine chuyển sang Tyrosine) xuất hiện trên 18/20 vi rút,
đột biến I117V chỉ xuất hiện trong 2 vi rút có giá trị IC
50
lớn hơn ngưỡng 5-6 lần.

Bảng 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến
Năm
Phân

típ
Tên chủng
Giá trị IC
50
/
Giá trị IC
50

ngưỡng
Nhận định kết quả Đột biến
2008
A/H1N1
A/Vietnam/TX285/08 1294
GMDNC của vi rút với
oseltamivir
(trung bình 1448 lần)


A/Vietnam/TB289/08 3933

A/Vietnam/TX200/08 1104

A/Vietnam/TX233/08 1097

A/Vietnam/BT241/08 1643

A/Vietnam/LS324/08 145 H275Y
2009
A/Vietnam/32036/09 1705

A/Vietnam/EL197/09 1407

A/Vietnam/Q271/09 1126

A/Vietnam/31808/09 1278

A/Vietnam/34381/09 1273

A/Vietnam/N116/09 1370
2009
A/H1N1pd
m09
A/Vietnam/32043/09 1422
GMDNC của vi rút với
oseltamivir
(trung bình 1242 lần)

A/Vietnam/32060/09 1072

A/Vietnam/32067/09 2944
H275Y
A/Vietnam/33419/09 417

2011 A/Vietnam/36530/11 356
2005
A/H5N1
A/Vietnam/HN30408/05 30
Giảm ĐNC của vi rút
với oseltamivir
H275Y

2008
A/Vietnam/HN31412/08 6 Có biểu hiện giảm
ĐNC của vi rút với
oseltamivir

A/Vietnam/HN31413/08 5
I117V
Tỉ lệ giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc theo từng phân típ trong khoảng thời gian từ
2001 đến 2012 được xác định 28,5% (12/42) đối với chủng cúm A/H1N1, 3,2%
(5/157) chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 và một chủng chủng vi rút A/H5N1giảm
15

nhạy cảm với oseltamivir; phân típ A/H3N2 được xác định nhạy cảm với oseltamivir
được thể hiện qua bảng 3.9.
Bảng 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa
trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen)
Chủng vi rút Năm
Số chủng kháng
oseltamivir/
Tổng số chủng

Tỉ lệ
kháng
oseltami
vir
theo
năm
(%)
Tỉ lệ
kháng

oseltamivir

chung
(%)
Phương
pháp NAI
Phương
pháp giải
trình tự
gen
A/H1N1
2001-2007 0/29 0/29
0

28,5
(12/42)
2008 6/7 6/7
85,7
2009 6/6 6/6
100
A/H1N1pdm09

2009 4/86 4/86
4,7

3,2 (5/157)
2010 0/13 0/13
0
2011 1/58 1/58
1,7

A/H3N2 2003-2012 0/115 0/115
0 0
Đối với vi rút cúm A/H5N1, xác định 3 chủng vi rút đảm bảo tiêu chuẩn về kiểu
hình và kiểu gen trong giới hạn giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir trong nghiên
cứu. Do số lượng vi rút cúm A/H5N1 hạn chế nên chúng tôi không phân tích tỷ lệ
theo năm.
3.6 Sự tương đồng về phân đoạn gen mã hóa HA và NA giữa các vi rút cúm A có
biểu hiện giảm độ nhạy osletamir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong
giai đoạn nghiên cứu.
3.6.1. Sự tương đồng về gen giữa các chủng vi rút cúm A/H1N1 giảm độ nhạy
cảm oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H1N1 trên thế giới
Cây gia hệ HA của vi rút A/H1N1 được xây bởi phương pháp Maximum
Likelihood bằng trình tự các phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H1N1 trong
nghiên cứu , các vi rút đại diện trong khu vực (Trung Quốc, Malaysia, Úc), châu Âu
và châu Mỹ và các vi rút dự tuyển văc xin trong giai đoạn nghiên cứu: A/New
Caledonia/20/1999, A/Wellington/1/2001, A/Solomon Island/3/2006 và
A/Brisbane/59/2007. Phân tích cây gia hệ cho thấy phân đoạn gen mã hóa HA của vi
rút H1N1 lưu hành tại Việt Nam 2001 – 2009 được chia thành 2 nhóm chính nhóm 1
và nhóm 2. Các vi rút trong nhóm 1 lại được phân tách thành các nhómphụ : 1A ,1B
và 1C , tương tự nhóm 2 có các nhóm phụ 2A, 2B và 2C. Các vi rút trong nghiên cứu
có biểu hiện giảm độ nhạy osletamivir đều nằm trong nhóm phụ 2B. Theo phân tích
cây gia hệ, các vi rút biểu hiện kháng oseltamivir không tạo các clade riêng và tương
đồng cao với các vi rút lưu hành trong cùng thời gian. Cây gia hệ phân đoạn gen mã
hóa NA cũng có sự phân nhánh rõ rệt. các chủng kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt
Nam hai năm 2008 và 2009 được nhóm vào nhóm 2C và không xác địnhsự khác biệt
về di truyền học giữa các vi rút giảm độ nhạy oseltamivir và các vi rút cùng lưu hành
trong cùng thời gian tại Việt Nam và các nước trong khu vực (Hình 3.5.).
16

Hình 3.5. Cây gia hệ phân đoạn gen mã
hóa HA các chủng vi rút cúm A/H1N1,
2001-2009

Hình 3.9. Cây gia hệ phân đoạn gen
mã hóa HA các chủng vi rút cúm
A/H1N1- clade 2, 2001-2009




















Hình 3.11.Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng vi rút
cúm A/H5N1, 2003-2010
17

3.6.2. Sự tương đồng về gen giữa các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 giảm độ

nhạy cảm oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 trên thế giới
Các chủng cúm H1N1pdm09 năm 2009 và 2010 tại Việt Nam có độ tương đồng cao
với các chủng lưu hành tại Thái Lan và Trung Quốc, không thể hiện sự phân nhánh rõ
ràng so với chủng gốc A/California/07/99. Bốn phân đoạn gen mã hóa HA của các vi
rút A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy cảm oseltamivir năm 2009 tương đồng cao với các
chủng lưu hành trong cùng năm.Vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir năm 2011
nằm trong phân nhánh cùng với các vi rút khác lưu hành cùng năm. Phân đoạn gen
mã hóa NA của các chủng H1N1pdm09 thể hiện sự tương đồng cao với chủng dự
tuyển văc xin A /California/07/99 và các chủng khác lưu hành tại các nước láng giềng
Thái Lan, Trung Quốc và các nước trong khu vực Singapore, Đài Loan-Trung Quốc,
Úc từ năm 2009-2011 (Hình 3.9).
3.6.3. Sự tương đồng về gen giữa các chủng vi rút cúm A/H5N1 giảm độ nhạy
cảm oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H5N1 trên thế giới
Phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút H5N1 phát triển thành nhiều clade khác nhau,
tính đến 2012, có tổng số 10 clade được đề cập đến (0-9). Vi rút H5N1 lưu hành tại
miền Bắc Việt Nam (6 chủng) từ năm 2003-2005 tập trung tại calde 1. Chủng H5N1
giảm độ nhạy cảm với oseltamivir A/Vietnam/HN30408/2005 nằm trong phân nhánh
của các vi rút lưu hành năm 2004 và 2005. Các vi rút thu thập được trong những năm
tiếp theo thể hiện sự phân tách rõ rệt sang clade 2, vi rút H5N1 tại Việt Nam nằm
trong phân nhánh 2.3.4 cùng các chủng vi rút đến từ Trung Quốc. Hai chủng
A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008 mang đột biến liên quan
đến kháng thuốc tại vị trí I117V trên protein NA và có biểu hiện giảm độ nhạy cảm
với oseltamivir cũng nằm trong phân nhánh 2.3.4.3. Vi rút H5N1 trên người nhạy
cảm hoặc giảm sự nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam phân đoạn gen
mã hóa HA đều có sự tiến hóa chung với các chủng lưu hành trên gia cầm tại Việt
Nam và có sự tương đồng với các chủng H5N1 gây bệnh tại miền Nam Trung
Quốc.Phân tích cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA cho thấy vi rút
A/Vietnam/HN30408/2005 mang đột biến H275Y biểu hiện giảm độ nhạy với
oseltamivir được nhóm vào nhóm 2A. Và 2 vi rút đã được xác định mang đột biến
I117V trên protein NA (A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008

nằm trong nhóm 2B (Hình 3.11).
CHƯƠNG IV - BÀN LUẬN
4.1 Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu
Số lượng 342 chủng cúm A thu được trong nghiên cứu trong giai đoạn 2001-2012
với các phân típ đại diện cho từng năm lưu hành đã đảm bảo tính bao quát của nghiên
cứu. Với số lượng 42 vi rút cúm A/H1N1; 157 vi rút cúm A/H1N1pdm09; 115 vi rút
cúm A/H3N2 và 28 vi rút cúm A/H5N1 phản ánh quy mô của hoạt động giám sát
cúm tại Việt Nam. Trong giai đoạn 2001-2005, giám sát cúm chưa thành hệ thống,
chỉ được thực hiện tại một số điểm giám sát của Hà Nội vì vậy số lượng vi rút thu
thập trong các năm này thấp dao động từ 4 vi rút (2001) đến 19 vi rút (2003). Tỷ lệ
của các phân típ vi rút thu thập trong từng năm của nghiên cứu tương đồng tỷ lệ lưu
hành các phân típ vi rút cúm A trong kết quả giám sát. Tuy nhiên, nghiên cứu sử
dụng vi rút phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng dương tính với RT-PCR, vì vậy một số
18

phân típ vi rút sẽ không có mặt trong nghiên cứu khi sự lưu hành của phân típ này
với tỷ lệ quá thấp ví dụ năm 2012 có ghi nhận sự lưu hành của A/H1N1pdm09,
nhưng không phân lập được vi rút.Trong năm 2006, không ghi nhận trường hợp
nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt nam, tiếp theo các năm 2011 và 2012 số người nhiễm vi
rút cúm A/H5N1 có được ghi nhận tại Việt nam, tuy nhiên các trường hợp này chỉ
được xác định tại khu vực phía Nam. Như vậy, kết quả thu thập vi rút cúm gia cầm
A/H5N1 trong nghiên cứu này đã phản ánh đúng tình hình nhiễm cúm A/H5N1 trên
người tại miền Bắc, Việt nam trong giai đoạn 2003-2012.
4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông
qua giá trị ức chế 50% (IC
50
)
4.2.1 Giá trị IC
50
ngưỡng của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy sự tương tác của oseltamivir
tới mỗi phân típ vi rút cúm khác nhau không giống nhau cho dù có cùng kiểu dạng
protein NA thể hiện ở giá trị IC
50
trung bình cho các phân típ vi rút cúm mang
protein NA1 lưu hành tại Việt Nam. Kết quả của chúng tôi phù hợp với những nghiên
cứu trước đó tại Úc, Anh và Nhật. Sự khác nhau này có thể giải thích do mỗi vi rút
cúm xâm nhập vào các quần thể người khác nhau có thể tạo ra các biểu hiện kiểu
hình (phenotype) khác nhau trong quá trình tiến hóa. Ngoài ra, sự khác nhau về giá trị
ngưỡng của típ/phân típ vi rút cúm có thể do mỗi neuraminidase của từng loại cúm có
sự tương tác khác nhau với oseltamivir. Theo dõi được sự đa dạng trong tương tác
của vi rút cúm với oseltamivir theo từng năm ta có thể xây dựng được cơ sở dữ liệu
về giá trị IC
50
của từng vi rút cúm theo từng phân típ, tạo nền tảng để thực hiện công
tác giám sát kháng thuốc của vi rút cúm tại miền Bắc Việt Nam nói riêng và mở rộng
ra toàn quốc nói chung. Sự tương tự về kết quả trong nghiên cứu được khẳng định,
tuy nhiên giá trị thực tế của IC
50
tại mỗi quốc gia sẽ khác nhau. vì vậy việc xác định
giá trị ngưỡng IC
50
cho từng quốc gia, từng khu vực địa lý là cần thiết trong việc tiến
hành giám sát sự kháng thuốc tại từng quốc gia.
4.2.2 Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir
Sự thay đổi về độ mẫn cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút cũng là một biểu
hiện của sự thay đổi để thích nghi và phát triển trên vật chủ của vi rút cúm. Thông
qua giá trị ức chế 50% của oseltamivir (IC
50
) với các vi rút cúm A, nghiên cứu của

chúng tôi đã xác định được tổng số 20 vi rút cúm thuộc các phân típ A/H1N1,
A/H1N1pdm09 và A/H5N1 yêu cầu một nồng độ oseltamivir cao để ức chế sự phát
triển của mình.Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của các vi
rút cúm A/H1N1 giảm độ nhạy với oseltamivir vào các năm 2008 và 2009 với tỷ lệ
85,7% và 100%gợi ý về sự tự biến chuyển cơ bản về kiểu hình của phân típ vi rút
cúm này. Điều này được khẳng định khi kết quả nghiên cứu tương tự với các chủng
A/H1N1 lưu hành tại Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ và Châu Âu giai đoạn 2006 – 2009.
Kết quả tại nghiên cứu cũng cho thấy mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir của
phân típ vi rút này gần như tuyệt đối khi giá trị IC
50
được xác định cao hơn giá trị
ngưỡng từ 1104 đến 3933 lần. Có thể nhận định phân típ A/H1N1các năm 2008 và
2009 trong nghiên cứu có khả năng kháng hoàn toàn thuốc kháng vi rút oseltamivir.
Để có thể xác định toàn diện về hiện tượng này, nghiên cứu hồi cứu về độ nhạy cảm
của A/H1N1 nên được thực hiện với cỡ mẫu đủ lớn và đại diện cho các vùng tại Việt
19

Nam. Sự kháng thuốc mạnh mẽ của A/H1N1 sẽ là quan ngại lớn cho sức khỏe cộng
đồng nếu phân típ vi rút này tiếp tục lưu hành trong các năm tiếp theo, tuy nhiên từ
năm 2010 phân típ vi rút này đã không được xác nhận trong báo cáo của hệ thống
giám sát quốc gia tại Việt Nam cũng như hệ thống giám sát cúm toàn cầu.
Vi rút cúm A/H1N1pdm09 đã xuất hiện và bắt đầu lưu hành từ năm 2009 bằng đại
dịch xảy ra từ tháng 5/2009 đến tháng 4/2010 trên toàn thế giới. Cũng như các vi rút
cúm A khác, hiện tượng giảm độ nhạy cảm với oseltamivir có thể xảy ra, nhất là
trong giai đoạn đầu mới xuất hiện, khi văc xin đặc hiệu chưa có và oseltamivir là
công cụ chủ yếu để điều trị nhiễm vi rút. Tỉ lệ kháng thuốc của H1N1pdm09 năm
2009 trong thời điểm đại dịch được cho là hợp lý khi chúng tôi tham khảo nghiên cứu
của Moghadas về mô hình kháng thuốc trong đại dịch cúm (năm 2008)và Hurt về sự
kháng thuốc của vi rút cúm trong đại dịch (năm 2012). Tỷ lệ H1N1pdm09 giảm nhạy
cảm với oseltamivir trong nghiên cứu của chúng tôi dường như cao hơn các nước

trong khu vực, sự khác biệt này có thể giải thích do phạm vi nghiên cứu chỉ nằm
trong giới hạn miền Bắc Việt Nam và thực hiện trên quần thể là vi rút phân lập,
không phải tổng số mẫu dương tính với vi rút cúm (được xác định bằng phương pháp
RT-PCR). Vì vậy, để xác định chính xác tỷ lệ giảm độ nhạy với thuốc kháng vi rút,
cần phải mở rộng nghiên cứu cũng như sự thống nhất một cách đánh giá tỷ lệ của hệ
thống giám sát cúm toàn cầu trong tương lai. Mức độ giảm độ nhạy với oseltamivir
của vi rút cúm A/H1N1pdm09 lưu hành tại Việt Nam được xác định ở mức độ mạnh
khi độ chênh lệch với giá trị ngưỡng được xác định từ 356 đến 2944 lần cao hơn giá
trị IC
50
ngưỡng, kết quả trên cho thấy sự đa dạng về đáp ứng với oseltamivir trong
nhóm vi rút có cùng biểu hiện về kiểu gen đột biến liên quan H275Y. Kết quả nghiên
cứu này cũng tương tự với các thông báo từ các nước khác như Mỹ, Anh và Úc…
trong cùng thời gian.
Nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện ra trường hợp kháng thuốc đầu tiên của vi
rút cúm A/H5N1 vào năm 2005 - vi rút A/Vietnam/HN30408/2005 - với giá trị IC
50

cao hơn 30 lần so với giá trị ngưỡng được đánh giá ở mức giảm độ nhạy cảm với
oseltamivir, vi rút này thuộc clade 1 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn
2003-2005. Khi phân tích sâu về kiểu gen cho thấy, đây là vi rút có đột biến không
hoàn toàn, chỉ có 6 trong tổng số 10 clone có nguồn gốc từ vi rút này được phát hiện
có đột biến H275Y, vì vậy việc biểu hiện kiểu hình đa dạng của các vi rút mang đột
biến là có thể và liên quan nhiều đến hiện tượng "quasi-species. Ngoài ra, cá thể vi
rút này cũng được ghi nhận hiện tượng đột biến xuất hiện dưới áp lực của điều trị, do
vậy việc kiểm soát điều trị hay xây dựng phác đồ điều trị thuốc kháng vi rút phù hợp
sẽ góp phần kiểm soát hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm. Ngoài ra, chúng tôi
cũng phát hiện hai vi rút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.4.3 lưu hành năm 2008, có
đột biến tại vị trí I117V và có biểu hiện giảm độ nhạy với giá trị IC
50

cao hơn giá trị
ngưỡng 5-6 lần tương tự với các nghiên cứu của Hurt (2012) và Takano (2012) thu
được giá trị IC
50
sau đột biến I117V trong nghiên cứu giả định tại phòng thí nghiệm
cùng cho kết quả tăng hơn 5-6 lần so với giá trị trung bình.
Nghiên cứu với 115 chủng H3N2 chúng tôi nhận thấy giá trị IC
50
của phân típ vi
rút cúm này ít có sự khác biệt giữa các cá thể vi rút và không phát hiện sự giảm nhạy
cảm với oseltamivir trong giai đoạn từ năm 2003 đến 2012. Tham khảo các tài liệu về
20

sự kháng thuốc của vi rút H3N2 cho thấy dường như vi rút chủ yếu kháng
amantadine (thuốc điều trị cúm được sử dụng trước oseltamivir) và chỉ kháng
oseltamivir ở mức độ thấp. Chúng tôi cho rằng đó có thể do khả năng gắn kết giữa
protein NA của vi rút H3N2 với thuốc tốt hơn H1N1 và các đột biến tuy có xảy ra
trên phân đoạn gen mã hóa NA nhưng khả năng gây hiện tượng kháng thuốc không
mạnh.
Việc giám sự kháng thuốc của vi rút cúm thường xuyên tại PTN mới được
TCYTTG khuyến cáo thực hiện từ năm 2009. Do vậy, phương pháp giám sát chuẩn
thức vẫn được điều chỉnh hàng năm cho phù hợp với sự thay đổi của vi rút cúm và
tình hình nhiễm cúm của từng quốc gia. Với phương pháp áp dụng cho nghiên cứu,
chúng tôi xác định được các chủng vi rút cúm kháng oseltamivir. Với các bệnh phẩm
lâm sàng dương tính với cúm nhưng không phân lập được vi rút, trong tương lai gần,
chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp giải trình tự gen với từng nucletotide xác định
(pyrosequencing) để xác định trực tiếp đột biến liên quan đến kháng thuốc trên bệnh
phẩm lâm sàng. Như vậy, việc giám sát kháng thuốc tại PTN sẽ bao quát được không
những các chủng vi rút kháng thuốc mà còn những bệnh phẩm lâm sàng nghi ngờ
mang vi rút cúm kháng thuốc.

4.3 Sự liên quan của các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA với quá trình
kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam
Tác dụng ức chế neuraminidase của oseltamivir thông qua sự bám kết của
oseltmivir vào các vị trí hoạt động của enzym neuraminidase tại vị trí Glu276,
Ala246, Arg224, và Ile222. Ái lực gắn bám sẽ quyết định hiệu quả hoạt đông ức chế
của oseltamivir. Bất cứ sự đột biến, thay đổi của axit amin trên protein NA tại các vị
trí này hoặc các vị trí xung quanh đều ảnh hưởng đến ái lực gắn bám hoặc làm thay
đổi vị trí tương tác với oseltamivir sẽ dẫn đến hiện tượng giảm độ nhạy, hoặc kháng
oseltamivir. nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện đột biến tại vị trí H275Y và
I117V trên protein NA, trong đó vị trí H275Y chiếm ưu thế 90% (18/20 vi rút) trong
khi đột biến I117V chỉ chiếm 10% (2/20 vi rút). Chỉ đột biến tại vị trí I117V chỉ được
đề cập trong phân típ cúm A/H5N1, không xuất hiện trong các vi rút cúm người phân
típ N1 (A/H1N1 hoặc A/H1N1pdm09). Đột biến này cũng phát hiện trên vi rút cúm
A/H5N1 lưu hành trên gia cầm năm 2007-2008 tại Việt Nam, chứng tỏ sự liên hệ
giữa vi rút cúm lưu hành trên gia cầm và trên người và cho phép nghĩ đến hiện tượng
đột biến tự nhiên, không chịu áp lực của thuốc kháng vi rút oseltamivir. Sự nguy
hiểm của vi rút cúm gia cầm mang gen kháng thuốc có khả năng lây bệnh cho người
đã được chứng minh khi vi rút cúm A/H7N9 lưu hành tại Trung quốc gần đây. Phân
đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H7N9 được xác định có đột biến R292K và đã
làm mất/giảm hiệu lực của thuốc Taminflu và tỷ lệ tử vong cao của những người
nhiễm bệnh đã được ghi nhận.
Ngoài năm trường hợp H1N1pdm09 được khẳng định kháng thuốc trên cả kiểu
hình và kiểu gen, chúng tôi còn xác định được 4 trường hợp khác cũng mang gen
kháng thuốc. Tuy nhiên, do không thể xác định mức kháng thuốc (kiểu hình), một
điều kiện quan trọng của việc khẳng định sự kháng thuốc cho nên các chủng này chỉ
dừng lại ở mức ghi nhận có mang đột biến liên quan đến kháng thuốc.
21

Trong nghiên cứu này, hai đột biến H275Y và I117V được phát hiện đều là đột

biến đơn lẻ, nhưng các báo cáo về hiện tượng xuất hiện các đột biến kép giả định
thực hiện trong phòng thí nghiệm dẫn đến giá trị IC
50
tăng gấp 1800 lần đối với
oseltamivir, 500 lần với peramivir so với giá trị ngưỡng trung bình. Trường hợp bệnh
nhân nhiễm cúm mang đột biến kép tại vị trí I223R và H275Y trên protein NA đã
được đề cập tại Mỹ. Do đó, cần phải xây dựng một chương trình giám sát kháng
thuốc một cách chủ động với những phương pháp xác định cập nhật cùng các quy
trình thử nghiệm hiện đại, thực hiện trên các bệnh phẩm thu thập từ chương trình
giám sát cúm. Đó cũng là biện pháp tích cực trong việc phòng tránh sự lây lan của vi
rút mang gen kháng thuốc trong cộng đồng.
4.4 Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến
và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian.
Sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA quyết định sự thay đổi về đặc tính
kháng nguyên, yếu tố quyết định sự xuất hiện các vụ dịch hoặc đại dịch trong cộng
đồng. Phân đoạn gen mã hóa NA tuy không đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa
của vi rút cúm A, nhưng protein NA với vai trò là một trong hai protein bề mặt của vi
rút cúm sẽ ảnh hưởng rất lớn trong quy trình tạo đáp ứng miễn dịch trong cộng đồng.
Sự thay đổi các axit amin trong protein NA không chỉ ảnh hưởng đến chức năng
ezyme của neuramindase như đã đề cập trong nghiên cứu mà còn ảnh hưởng đến khả
năng tạo miễn dịch trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này chúng tôi tìm hiểu sự liên
quan về mặt di truyền học của vi rút cúm có mang đột biến liên quan đến giảm độ
nhạy hoặc kháng oseltamivir và các vi rút cúm cùng phân típ lưu hành tại miền Bắc
Việt Nam cũng như các chủng lưu hành trong cả nước và thế giới thông qua phân tích
cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA
và NA của các phân típ vi rút A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 trong nghiên cứu
đã cho thấy một sự tương đồng của các vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir với
các vi rút lưu hành trong cùng một thời gian tại các khu vực địa lý khác nhau. Các vi
rút cúm mang đột biến trên protein NA trong nghiên cứu đều tập trung trên cây gia
hệ cùng với các vi rút lưu hành tại Việt Nam trong cùng giai đoạn tương ứng trên cây

gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA. Đột biến kháng thuốc (H275Y) trên phân đoạn gen
mã hóa NA không ảnh hưởng đến sự thay đổi của phân đoạn gen mã hóa HA trên các
vi rút phân típ A/H1N1 tại miền Bắc Việt Nam và trên thế giới, các vi rút này không
phân tách thành các nhóm riêng như đột biến trên gen M (S31N) liên quan đến kháng
thuốc amatadine của vi rút cúm A/H3N2.
Các vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu được nhóm vào hai clade chính trong
cây gia hệ HA là clade 1 và clade 2.3.4 và không phát hiện sự khác biệt của các vi
rút mang đột biến H275Y hoặc I117V trên cây gia hệ. Kết quả này có thể do cá thể
vi rút mang đột biến với số lượng thấp trong nghiên cứu, tuy nhiên cũng không loại
trừ trường hợp cũng giống như phân típ cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 các đột biến
tương tự trên phân đoạn gen mã hóa NA không ảnh hưởng đến quá trình tiến hóa của
phân đoạn gen mã hóa HA. Nhận định này càng được thuyết phục khi clade 2.3.4 trên
cây gia hệ có tập trung một số vi rút phân lập từ gia cầm có đột biến I117V
(A/duck/Vietnam/NCVD100/2207)
22

Như vậy, các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA (H275Y hoặc I117V) được
phát hiện trên một số vi rút trong nghiên cứu tuy ảnh hưởng đến khả năng tương tác
với oseltamivir, nhưng không ảnh hưởng đến sự thay đổi về mặt di truyền của phân
đoạn gen mã hóa HA, và sẽ không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của chính vi
rút đó.
23

KẾT LUẬN
1. Đã xác định giá trị IC
50
ngưỡng của các phân típ cúm A lưu hành tại Việt
Nam, 2001-2012

Vi rút A/H1N1 0,413 ± 0.352 nM

Vi rút A/H1N1pdm09 0,334 ± 0,286 nM
Vi rút A/H3N2 0,164 ± 0,126nM
Vi rút A/H5N1 2,947 ± 2,539 nM
2. Tỉ lệ và mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir củacác phân típ chủng vi-rút
cúm A tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 được xác định
 Với vi rút A/H1N1: 28,5% (12/42) vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với oseltamivir
trung bình 1448 lần so với giá trị IC
50
ngưỡng; tỉ lệ thay đổi theo năm.
 Với vi rút A/H1N1pdm09: 3,2% (5/157) vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với
oseltamivir trung bình 1242 lần so với giá trị IC
50
ngưỡng; tỉ lệ thay đổi theo năm.
 Với vi rút A/H3N2: 100% (115/115) không có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với
oseltamivir, giá trị trung bình IC50 (0,164 nM), không vượt giá trị IC
50
ngưỡng.
 Với vi rút A/H5N1: trong 28 vi rút, phát hiện 01 vi rút giảm độ nhạy cảm với
oseltamivir: A/Vietnam/HN30408/05 (90nM) và 02 vi rút có biểu hiện giảm độ
nhạy cảm với oseltamivir: A/Vietnam/HN31412/08 (19,04 nM) và
A/Vietnam/HN31413/08 (14,48 nM)
3. Về sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với
oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên
thế giới trong giai đoạn 2001-2012
 Hai đột biến H275Y và I117V được xác định trên protein NA liên quan đến giảm
sự nhạy cảm của vi rút cúm A với oseltamivir, trong đó đột biến H275 chiếm tỷ lệ
90% (18/20) được phát hiện trên các chủng vi rút cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09
và A/H5N1. Đột biến I117V chiếm 10% (2/20) chỉ phát hiện trên phân típ
A/H5N1.
 Phân đoạn gen mã hóa HA và NA của các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ

nhạy cảm với oseltamivir thuộc các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09 và
A/H5N1 thể hiện sự tương đồng về di truyền học với các phân típ vi rút tương
ứng lưu hành trong cùng thời gian tại Việt Nam và một số nước trong khu vực.
 Các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến giảm độ nhạy của
oselatmivir không ảnh hưởng đến sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA của
các phân típ vi rút tương ứng lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn
2001-2012.

24

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục và mở rộng hệ thống giám sát cúm trên toàn quốc để tăng cường khả
năng kiểm soát dịch và khả năng lây lan của các chủng kháng thuốc nếu có.
2. Thiết lập hệ thống giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm, xây dựng quy trình
chuẩn cho xét nghiệm mức độ kháng thuốc (thử nghiệm ức chế
neuraminidase).
3. Phối hợp nghiên cứu, giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm gia cầm trong
các ổ chứa tự nhiên nhằm tạo cơ sở dữ liệu cho công tác phòng và điều trị.
4. Phối hợp nghiên cứu với đơn vị lâm sàng trong việc định hướng lựa chọn thuốc
trong điều trị, dự phòng và phòng chống dịch.