Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus
HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam
Người hướng dẫn : PGS.TS Đinh Duy Kháng
Sinh viên : Phạm Thu Trang
Tình hình HIV trên thế giới 2009
•
Ước tính đến năm 2011, Việt Nam có khoảng 311.500 người bị
nhiễm bệnh.
•
Tại Việt Nam tính đến ngày 31/12/2010
•
183.938 người
•
44.938 người
•
49.477 người
Phân bố các phân type HIV-1 M theo vùng địa lý (2008)
Glycoprotein gp 120
Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV
Phức hợp gp120-CD4-đồng thụ thể
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
•
Plasmid mang gen gp120 của virus HIV phân type B lưu hành ở
Việt Nam (mẫu số 6, Quảng Ninh) được tách dòng thành công tại
Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN.
•
Các hóa chất, sinh phẩm và trang thiết bị tại Phòng Vi sinh vật
học phân tử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN.

Phương pháp nghiên cứu
•
Nhân bản gen mã hóa protein gp120B của virus HIV bằng phương pháp PCR.
•
Gắn sản phẩm PCR vào vector.
•
Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli.
•
Cắt DNA bằng enzyme giới hạn.
•
Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
•
Biểu hiện gen trong tế bào E.coli tái tổ hợp.
•
Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni
2+
.
•
Phương pháp Western Blot.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen gp120B
Khuếch đại gen gp120B_EX bằng cặp mồi biểu hiện
ĐC1: Thang DNA chuẩn 1kb
ĐC2: sản phẩm PCR.
Tạo vector tái tổ hợp pET32a(+) mang gen gp120B_EX
ĐC 1: Plasmid gốc vector pET32a(+)
ĐC 2-12: DNA plasmid có khả năng mang gen
gp120B_EX
ĐC1: Thang DNA chuẩn 1 kb.
ĐC2-6: Các dòng plasmid 3, 4, 8, 10, 12 cắt bằng BamH I và Xho I

ĐC7: Đối chứng (đoạn gen gp120B_EX)
Tinh sạch DNA plasmid
ĐC1-3: Tương ứng với dòng plasmid tái tổ hợp số 4, 10, 12
Gen gp120B_EX trong vector biểu hiện pET32a(+) đã được giải trình tự
Kiểm tra khung đọc của gen gp120B trong vector pET32a(+)
Biểu hiện gen gp120B trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 Star
TM
(DE3)
ĐC 1: Thang Protein chuẩn
ĐC 2,4: Mẫu không cảm ứng
ĐC 3,5: Mẫu cảm ứng bằng IPTG 1mM
Kiểm tra trạng thái tồn tại của protein gp120B tái tổ hợp
M: Thang Protein chuẩn
ĐC: Mẫu trước cảm ứng
C: protein thu được ở pha cặn
HT: Mẫu protein thu được ở pha nổi
Ảnh hưởng của nồng độ IPTG
ĐC M: Thang Protein chuẩn
ĐC 0: Mẫu không cảm ứng
ĐC 0,25; 0,5; 1: Mẫu cảm ứng bằng ITPG tương ứng nồng độ 0,25mM, 0,5mM, 1mM
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
ĐC M: Thang Protein chuẩn
ĐC 0: Mẫu không cảm ứng
ĐC 1, 2, 3,4: Mẫu cảm ứng với thời gian tương ứng 1h, 2h, 3h, 4h
Tinh chế protein gp120B tái tổ hợp
ĐC 1: Thang protein chuẩn (Fermentas)
ĐC 2-8: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột sau khi tinh sạch
ĐC 9: Dịch phá tế bào bằng siêu âm, ĐC 10: Dịch chảy qua cột
Nghiên cứu khả năng phản ứng của GP120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng Western
blot

Hình A: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh dương tính với HIV
Hình B: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh âm tính với HIV
ĐC 1: Thang protein chuẩn
ĐC 2: Protein tái tổ hợp GP120B
ĐC 3: Protein tái tổ hợp Thioredoxin