tách dòng, biểu hiện gen mã hóa protein p24 của virus hiv-1 phân type crf01_ae lưu hành tại việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn đoán

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………



TRẦN MINH ĐỨC





TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN
P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH
TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ
HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN






LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………



TRẦN MINH ĐỨC





TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN
P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH
TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ
HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC









Hà Nội – 2010
Luận văn thạc Sỹ - 1 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỞ ĐẦU
Đại dịch HIV/AIDS đang là một vấn đề nan giải và là mối hiểm họa đối với
nhân loại. Kể từ khi ca nhiễm bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1981 cho đến
nay đại dịch HIV/AIDS đã gây ra cái chết cho hàng triệu người mỗi năm. Theo báo
cáo của tổ chức phòng chống AIDS toàn cầu (UNAIDS) thì tính đến hết năm 2009
trên thế giới có khoảng 33,3 triệu người vẫn đang sống chung với HIV, và riêng
trong năm 2009 có khoảng 1,8 triệu người tử vong do các bệnh liên quan đến
HIV/AIDS [36].
HIV/AIDS không những là nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong cao ở người mà
còn tác động tiêu cực tới sự phát triển kinh tế xã hội mỗi quốc gia, nhất là các nước
đang phát triển. Với cơ sở hạ tầng, trang thiết bị kỹ thuật y tế còn nhiều yếu kém thì
việc chăm sóc và điều trị bệnh nhân HIV/AIDS ở các nước này gặp rất nhiều khó
khăn. Vì vậy, công tác phát hiện và kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh được coi là

giải pháp phù hợp với điều kiện các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới.
Theo báo cáo của Bộ Y tế thì tính đến ngày 30/9/2010, cả nước có 180.312 người
đang sống chung với virus chết người này, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và
tổng số người chết do AIDS đã được báo cáo là 48.368 người. Số lượng người
nhiễm HIV cao sẽ là gánh nặng với xã hội và nền kinh tế [10].
Hiện nay, vấn đề sản xuất thuốc điều trị và vaccine phòng ngừa HIV/AIDS
vẫn là một bài toán hóc búa đối với nền y học thế giới. Mặc dù các nghiên cứu trong
những năm gần đây đã mang lại nhiều kết quả tích cực xong vẫn chưa có vaccine
phòng chống HIV. Trong bối cảnh diễn biến tình hình dịch bệnh ở nước ta hiện nay
ngày càng phức tạp, việc chẩn đoán sớm để có các biện pháp phòng ngừa hữu hiệu
là rất cần thiết.
Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện rất nhiều loại Kit chẩn đoán HIV
nhưng đa phần là nhập ngoại, các loại Kit này thường có giá thành cao và có thể
không phù hợp với các phân type HIV đang lưu hành tại Việt Nam. Do đó, việc
Luận văn thạc Sỹ - 2 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


nghiên cứu phát triến các bộ Kit chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao trên cơ
sở các kháng nguyên có nguồn gốc từ các chủng virus đang lưu hành trong nước có
ý nghĩa rất lớn cả về mặt khoa học cũng như thực tiễn.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu:
“Tách dòng, biểu hiện gen mã hóa protein P24 của virus HIV-1 phân type
CRF01_AE lưu hành tại Việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn
đoán”.
Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Vi sinh Vật học Phân tử – Viện
Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Luận văn thạc Sỹ - 3 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency
virus – HIV)
1.1.1. HIV là gì?
HIV (Human Immunodeficiency Virus) - virus gây suy giảm miễn dịch ở
người, là loại virus khi xâm nhập vào cơ thể gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc
phải (AIDS), dẫn đến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnh nhân dễ mắc
phải ưng thư và những tác động do chính HIV gây ra [1].
HIV chủ yếu lây nhiễm các tế bào quan trọng trong hệ thống miễn dịch của
người như là tế bào T trợ giúp (đặc biệt là T CD4+), các đại thực bào và các tế bào
đuôi gai. Lây nhiễm HIV dẫn đến sự giảm số lượng tế bào T CD4+ theo 3 cơ chế

chính sau: Một là, các tế bào nhiễm bị giết chết trực tiếp bởi virut; hai là, tăng tỉ lệ
tế bào chết theo chương trình; ba là, sự giết chết tế bào T CD4+ bị nhiễm bởi tế bào
lympho gây độc CD8. Khi số lượng tế bào T CD4+ suy giảm xuống dưới một mức
nhất định thì quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào bị mất, cơ thể dễ mắc các
bệnh nhiễm trùng cơ hội [54].
1.1.2. Đặc điểm của virus HIV
1.1.2.1. Giới thiệu chung
Về nguồn gốc của virus HIV gây suy giảm miễn dịch ở người thì vẫn là
một câu đố đối với các nhà khoa học kể từ khi trường hợp mắc bệnh đầu tiên được
phát hiện đầu những năm 80 của thế kỷ trước.
Ngày nay thì mọi người đều đồng ý rằng HIV có quan hệ họ hàng với virus
gây suy giảm miễn dịch ở khỉ - SIV (simian immunodeficiency virus). Đặc biệt là
công bố vào năm 1999 của một số nhà nghiên cứu tại Đại học Alabama, họ nhận
thấy rằng HIV-1(một type HIV) rất giống SIV tinh tinh (SIVcpz). Nguồn gốc động
Luận văn thạc Sỹ - 4 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


vật, thời gian và địa điểm chính xác của sự lây truyền hiện vẫn chưa rõ và là đề tài
cho các cuộc khảo sát và tranh luận [21].
HIV thuộc nhóm Lentivirus và thuộc họ Retroviridae.
Lentivirus (lenti có nghĩa là chậm), loài virus đặc trưng bởi thời gian dài ủ
bệnh. Lentivirus có thể truyền thông tin di truyền của mình vào DNA tế bào chủ và
loài duy nhất trong các Retrovirus có khả năng tái bản mà không thông qua phân
chia tế bào [61].
HIV có những đặc trưng của retrovirus:
• Là một loại virus RNA, nhưng có một enzyme phiên mã ngược, mà bản
chất là DNA polymerase phụ thuộc RNA. Với enzyme phiên mã ngược này cho
phép tổng hợp một DNA kép trong tế bào chủ mà retrovirus xâm nhập .
• DNA mới được tạo ra đều có những đoạn tự lặp lại, có kích thước khác

nhau được gọi là đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ vậy mà gắn được một cách ổn định
trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ và trở thành một tiền virus (provirus). Tiền virus
này sẽ như một gen của tế bào và truyền sang cho thế hệ khác khi có sự phân bào,
hoặc được phiên mã thành RNA thông tin, tổng hợp protein của virus để hình thành
một virus hoàn chỉnh.
HIV có các đặc trưng của một Lentivirus :
 Phát triển chậm.
 Không biến đổi tế bào nhưng lại làm tiêu huỷ tế bào.
 Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [1], [6].
1.1.2.2. Phân loại HIV
HIV là loại virus có tính biến đổi cao và dễ xảy ra đột biến. Điều này có nghĩa
là sẽ có nhiều chủng HIV khác nhau, thậm chí chúng có thể cùng lây nhiễm vào một
cá thể [39].
Dựa vào sự tương đồng về mặt di truyền người ta có thể phân loại các chủng
virus HIV thành các type, các nhóm và phân type. Có 2 type HIV: HIV-1 và HIV-2.
Cả 2 type này đều lây truyền qua đường tình dục, qua máu, từ mẹ sang con và
Luận văn thạc Sỹ - 5 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


chúng đều là nguyên nhân dẫn đến triệu chứng lâm sàng bệnh AIDS nhưng khó
phân biệt được là do type nào gây ra. HIV-1 thì có mức độ lây lan rộng, còn HIV-2
khó lây nhiễm hơn, thời kì ủ bệnh cũng dài hơn [40].
HIV-1 đã được Luc Montagnier và các cộng sự ở viện Pasteur Paris phát
hiện vào năm 1983 [48]. HIV-1 được chia ra làm 4 nhóm: Nhóm M (major), nhóm
O (outlier), 2 nhóm mới N và P (hình 1.1) [40].

Hình 1.1: Sơ đồ các phân type HIV-1 và HIV-2[40]
 Nhóm O thì chỉ xuất hiện giới hạn ở khu vực Tây-Trung phi.
 Nhóm N - một chủng được phát hiện năm 1998 ở Cameroon thì lại rất

hiếm xuất hiện.
 Nhóm P - một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm
miễn dịch ở khỉ được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009
[39].
 Nhóm M chiếm hơn 90% HIV-1 gây đại dịch trên toàn thế giới. Trong
nhóm M lại chia ra thành các phân type: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J và K.
Đôi khi có hiện tượng 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau, cùng hiện diện
trong tế bào người nhiễm và hòa trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1
virus lai mới. Nhiều virus thuộc chủng mới này có khả năng sống sót không
cao, nhưng chủng nào lây nhiễm được sẽ gọi là CRF (Circulating
Recombinat Forms). CRF A/E được coi là sự lai tạo giữa phân type A và 1
phân type gốc là E. Tuy nhiên, vì chưa tìm thấy được phân type E ở dạng
riêng rẽ nên hầu hết người ta coi CRF A/E là phân type E. (trên thực tế tên
gọi đúng hơn là CRF01_AE) [40].
Luận văn thạc Sỹ - 6 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


HIV-2 được phát hiện ở các bệnh nhân ở Cameroon vào năm 1985 và thường
chỉ thấy xuất hiện ở tây phi, rất ít gặp ở nơi nào khác [49]. HIV-2 cũng được chia
thành 8 phân type là A, B, C, D, E, F, G, H (hình 1.1) [34,42].
Trong giới hạn của luận văn này, tôi chỉ tìm hiểu loại HIV-1 là loại virus gây
ra đại dịch HIV/AIDS trên thế giới.
1.1.2.3. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của HIV
HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 – 120nm. Về cấu tạo thì HIV gồm 3
phần chính là lớp vỏ, lớp protein nền và lõi capsid (hình 1.2) [1].
 Lớp vỏ (Envelope): Vỏ ngoài có cấu tạo từ lớp lipid kép với các gai
glycoprotein. Mỗi gai có hai tiểu đơn vị glycoprotein có khối lượng
41kDa là gp41 cắm xuyên màng và glycoprotein có khối lượng
120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfua tạo thành gp160.

 Lớp Protein nền (Matrix protein): Nằm ngay sau lớp vỏ là lớp protein
nền có khối lượng phân tử 17kDa (p17).
 Lõi capsid: Có dạng hình trụ lệch tâm, được cấu thành bởi các protein
có khối lượng 24kDa (p24). Bên trong là hai sợi RNA đơn, protein lõi
(p7 và p9) và enzyme phiên mã ngược [1].

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc của virus HIV[50]

Luận văn thạc Sỹ - 7 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


1.1.2.4. Cấu trúc hệ gen HIV
Genome của HIV bao gồm hai chuỗi RNA đơn, giống nhau. Mỗi chuỗi có
kích thước khoảng 9200bp, gồm có 9 gen với 2 nhóm chính: nhóm gen cấu trúc
(gag, pol, env) và nhóm gen điều hòa (tat, rev, nef, vif, vpr, vpu) (hình 1.3) [50].
 Nhóm gen cấu trúc
 Gag (group-specific-antigen): mã hoá các kháng nguyên đặc hiệu
nhóm bao gồm các gen mã hóa tổng hợp protein nền, lõi capsid và các
cấu trúc protein lõi (nuclecapsid protein).
 Pol (polymerase): mã hóa tổng hợp protease, enzyme phiên mã
ngược và intergrase.
 Env (envelope): mã hóa tổng hợp kháng nguyên bề mặt gp160 với hai
tiểu phần là gp41 và gp120.
 Nhóm gen điều hòa
 Tat (Trans Activator of Transcription – yếu tố hoạt hóa phiên mã).
Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc, protein điều hòa (kể cả
gen tat). Gen tat mã hóa tổng hợp protein Tat, có 102 amino acid, protein
này chịu trách nhiệm hoạt hóa phiên mã virus thông qua việc tạo ra vị trí gắn
cho RNA pol 2 và các protein khác của tế bào.

 Rev (Regulator of Expression of Virion proteins – yếu tố điều hòa
sự biểu hiện các protein hạt virus) : Gen rev có chức phận điều chỉnh quá
trình nhân lên của virus thông qua gen tat và nef, mã hóa tổng hợp cho
protein Rev. Rev bao gồm 117 amino acid, protein này có chức năng chuyển
mRNA ra tế bào chất.
 nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hòa âm): mã hóa cho
protein Nef, ức chế hoặc tăng cường sự tái bản virus, phụ thuộc vào chủng và
loại tế bào. Trong các tế bào nhiễm, Nef sẽ thay đổi con đường vận chuyển
endosome, qua đó giảm sự biểu hiện các protein CD4, MHC I và MHC II ở
bề mặt tế bào nhiễm. Những thay đổi này có thể bảo vệ các tế bào nhiễm
HIV khỏi sự giám sát miễn dịch.
Luận văn thạc Sỹ - 8 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


 Vif (Virion Infectivity Factor - yếu tố lây nhiễm của virus): mã hóa
protein Vif, làm tăng tính thâm nhập của virus vào các tế bào chủ tự do và
giúp ngăn chặn sự xâm nhập của các enzyme tế bào chủ ngăn cản sự tái bản
virus vào các virion mới hình thành.
 Vpu (Viral Protein U - protein U của virus): mã hóa protein Vpu, có
tác dụng tăng cường sự giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm sự biểu hiện
của CD4, MHC I trên bề mặt tế bào.
 Vpr (Viral Protein R - protein R của virus): mã hóa protein Vpr, có
tác dụng tăng cường sự tái bản virus trong các tế bào ban đầu, là protein liên
kết với virion, ngăn cản pha G
2
/M, là tín hiệu định vị nhân [43], [44], [46].

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome HIV[44]
1.1.3. Chu trình virus HIV

HIV có khả năng xâm nhập rất nhiều loại tế bào: tế bào lympho T hỗ trợ (T
H
)
có thụ thể CD4, tế bào đơn nhân, đại thực bào và các tế bào tương tự như: tế bào tua
(ở da và niêm mạc (Langerhans), ở hạch lympho), tế bào thần kinh đệm (microglia)
của hệ thần kinh trung ương. Nhưng xét về sinh bệnh học, tế bào lympho T có CD4
và hệ thống đại thực bào đơn nhân là tế bào đích chính của HIV. CD4 là protein tiếp
nhận, giúp cho HIV gắn với tế bào [1], [17].
Sự xâm nhập và nhân lên của virus HIV có thể chia làm bốn giai đoạn chính:
Gắn kết và xâm nhiễm vào tế bào; phiên mã ngược và cài xen; sao chép và dịch mã;
lắp ráp và trưởng thành (hình 1.4).
Luận văn thạc Sỹ - 9 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Hình 1.4: Sơ đồ minh họa chu trình nhân lên của HIV-1[17]
Gắn kết và xâm nhiễm tế bào
HIV bắt đầu chu trình của mình bằng việc gắn protein vỏ gp120 với thụ thể
CD4 và đồng thụ thể trên bề mặt tế bào. Tương tác của gp120 với thụ thể và đồng
thụ thể gây ra một sự sắp xếp lại cấu trúc không gian của gp41, qua đó tạo ra sự
dung hợp màng virion và màng tế bào. Khi xâm nhiễm thì RNA và một số vật liệu
di truyền của virus được giải phóng vào trong tế bào chủ [18].
Phiên mã ngƣợc và cài xen
Sự phiên mã ngược tạo DNA mạch kép từ RNA genome virus dưới sự hoạt
động của enzyme reverse transcriptase xảy ra sau khi virus xâm nhiễm tế bào. Quá
trình sao chép ngược này có thể bị lỗi và dẫn đến xuất hiện các đột biến. Những đột
biến như vậy có thể gây ra sự kháng thuốc [1].
DNA mạch kép mới được đưa vào nhân tế bào, tại đây xảy ra hiện tượng cài
xen DNA virus vào genome của tế bào dưới sự xúc tác của enzyme integrase để tạo

thành các provirus. Các provirus này có thể tồn tại ở trạng thái không hoạt trong
nhiều năm, có thể sản sinh rất ít hoặc không sản sinh bản sao nào [19].
Sao chép và dịch mã
Ngay sau khi tế bào vật chủ nhận được tín hiệu hoạt động, provirus sử dụng
enzyme RNA polymerase của tế bào vật chủ để sao chép tổng hợp các vật liệu di
truyền của HIV như là các RNA genome và các mRNA có kích thước ngắn hơn.
Các mRNA được sử dụng như một khuôn để tổng hợp các protein virus HIV [19].
Luận văn thạc Sỹ - 10 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Bản phiên mã ban đầu có chiều dài xấp xỉ bằng phân tử RNA monomer
(khoảng 9,3 kb), sau đó một phần được gắn đuôi polyA ở đầu 3’ và gắn mũ
metylguanin ở đầu 5’ tạo thành các mRNA để dịch mã tạo các protein sớm và
protein muộn; phần còn lại không được gắn mũ và đuôi polyA sẽ đóng vai trò làm
RNA genome của các virus thế hệ sau [34].
Lắp ráp và trƣởng thành
Giai đoạn cuối cùng của chu trình tái bản virus, tạo thành các hạt virus HIV
hoàn chỉnh được bắt đầu tại màng sinh chất của tế bào chủ. Protein Env (gp160) đi
qua màng lưới nội chất và được vận chuyển vào phức hệ Golgi, nơi mà chúng sẽ bị
enzyme protease phân cắt tạo thành 2 glycoprotein vỏ gp41 và gp120. Các protein
này được vận chuyển vào màng sinh chất tế bào vật chủ. Các polyprotein Gag (p55)
và Gag-Pol (gp160) cũng liên kết với bề mặt phía trong màng và cùng với RNA
genome virus khi hạt virus định hình bắt đầu nảy chồi từ tế bào vật chủ.
Sự trưởng thành xảy ra ở cả dạng mới nảy chồi hoặc ở dạng hạt virus trưởng
thành sau khi được giải phóng khỏi tế bào vật chủ. Trong quá trình trưởng thành,
protease của HIV phân cắt các polyprotein thành các enzyme và protein cấu trúc.
Các thành phần cấu trúc khác nhau sau đó được lắp ráp thành hạt virus HIV trưởng
thành. Giai đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi các protease. Hạt virus trưởng thành
sau đó có thể đi lây nhiễm tế bào khác và bắt đầu một chu trình tương tự [20].

1.2. Protein P24
1.2.1. Cấu trúc và chức năng của P24
Protein p24 là thành phần chủ yếu cấu tạo nên lõi capsid của HIV-1 và hình
thành cấu trúc vỏ hình nón đặc trưng (hình 1.5), bao quanh phức hợp RNA-
nucleoprotein của hạt virus trưởng thành, đồng thời cũng là vị trí mà cycophilin A
gắn với nhóm protein Gag và có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân lên của
virus [25]. Protein p24 được mã hóa bởi gen Gag của HIV-1, gồm 231 amino acid
và có khối lượng phân tử xấp xỉ 24 kDa [23, 27].
Gen Gag của HIV-1 mã hóa tổng hợp cho một khung đọc mở của protein có
khối lượng phân tử 55kDa (p55). Protein p55 được cấu thành từ 3 protein thành
Luận văn thạc Sỹ - 11 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


phần, protein nền P17, protein P24 và protein nucleocapsid p15. Các protein thành
phần sẽ được giải phóng khi p55 bị thủy phân bởi protease hạt virus [24].
Trong virus HIV-1 trưởng thành, lõi capsid hình nón được cấu thành từ
khoảng 1500 phân tử protein P24. Các phân tử này đóng gói với nhau để tạo nên
cấu trúc mắt lưới 6 cạnh (hexamer) và bao bọc lấy RNA genome virus [30]. Sự
đóng gói genome virus và sự liên kết với các enzyme vào trong lõi capsid là rất cần
thiết trong quá trình xâm nhập các tế bào chủ của virus [31].

Hình 1.5: Cấu trúc lõi capsid[30]
Có khoảng 250 hexamer tham gia lắp ráp tạo nên một cấu trúc protein lõi
capsid hoàn chỉnh. Mỗi hexamer bao gồm 6 domain đầu N-terminal xếp vòng tròn
quanh một lõi trung tâm, bao bọc lấy vòng tròn này là 6 domain đầu C-terminal di
động ở phía ngoài (hình 1.6). Dựa vào cấu trúc tinh thể từng domain riêng rẽ và dựa
vào dữ liệu hiển vi điện tử lắp ráp của hexamer cho thấy, domain đầu C-terminal
tiếp xúc với đầu N-terminal bởi 6 trục và có độ xoay tròn là 60
0

. Do tính linh động
của của các domain cho phép các hexamer có cấu hình thích ứng một các linh hoạt
trong các trúc cong của protein capsid [31].
Luận văn thạc Sỹ - 12 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Hình 1.6: Cấu trúc Hexamer Capsid của virus HIV [31]
Protein p24 gồm có 2 domain, domain đầu N-terminal (N- terminal domain)
và domain đầu C-terminal (C- terminal domain) liên kết với nhau bởi 1 cầu nối có
tính linh hoạt (hình 1.7). Trong quá trình lắp ráp hạt virus chưa trưởng thành thì cả
2 domain của protein capsid tham gia cấu thành một phần của protein Gag. Protein
Gag bị thủy phân trong quá trình trưởng thành của virus giải phóng CA protein và
các tiểu phần CA tự do tự lắp ráp hình thành cấu trúc lõi capsid hình nón cụt [26].


Hình 1.7: Cấu trúc P24[26]
+ C-terminal domain: có vai trò quan trọng trong quá trình dimer hóa lõi
capsid, oligomer hóa Gag và hình thành hạt virus. Domain này cũng bao gồm đoạn
trình tự bảo thủ 20 amino acid được gọi là MHR (major homology region), trình tự
này là trình tự bảo thủ ở các retrovirus và nó có vai trò quan trọng trong lắp ráp,
trưởng thành và lây nhiễm của virus [28].
Luận văn thạc Sỹ - 13 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Cấu trúc của domain đầu C-terminal kéo dài từ vị trí amino acid 148 đến 23,
là domain hình cầu, được cấu thành từ 4 chuỗi xoắn và một chuỗi amino acid mở
rộng, tạo nên một cấu trúc dimer tương đối bền vững (hình 1.8) [32].

Hình 1.8: Cấu trúc domain đầu C-terminal của p24[32]

+ N-terminal domain: CA (1-145) là thành phần hình thành lên lõi virus và
gắn kết với cyclophilin A [28]. Phân tích cấu trúc dựa trên kỹ thuật MHMRS
(Multidimensional Heteronuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) cho thấy đặc
điểm cấu trúc của CA (1-145) không giống với protein vỏ virus, mà nó gồm có 7
chuỗi xoắn α, 2 chuỗi β kẹp tóc (hairpin) và vị trí tiếp xúc loop (hình 1.9) [29].

Hình 1.9: Cấu trúc domain đầu N-terminal của p24[29]
1.2.2. P24 và các ứng dụng trong chẩn đoán
Kháng nguyên p24 là protein cấu thành của lõi virus, bao bọc các chất liệu di
truyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của virus. Kháng nguyên p24 tồn tại
Luận văn thạc Sỹ - 14 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


dưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Phát hiện kháng
nguyên p24 thông thường được sử dụng trong các chẩn đoán [49] :
 Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh.
 Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV: P24 là một trong những
kháng nguyên xuất hiện rất sớm trước khi kháng thể kháng HIV được
tạo ra.
 Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV: Kháng nguyên p24 xuất hiện rất sớm
ở giai đoạn mới nhiễm. Sau một thời gian, kháng thể kháng p24 mới
được tạo ra. Cùng với sự xuất hiện kháng thể, nồng độ kháng nguyên
p24 tự do trong máu giảm. Ở giai đoạn cuối, cùng với sự giảm kháng
thể kháng p24, sự tái xuất hiện và gia tăng nồng độ p24 tự do là một
tiên lượng chuyển sang AIDS.
 Theo dõi đáp ứng điều trị với thuốc kháng virus.

 Phát hiện có sự nhân lên của virus.
Với đặc điểm là kháng nguyên xuất hiện sớm (3-6 tuần) ở giai đoạn cửa sổ
trong diễn biến quá trình nhiễm HIV/AIDS, p24 đã được nghiên cứu và ứng dụng
rộng rãi trong sản xuất các bộ Kit chẩn đoán sớm sự lấy nhiễm của virus. Trên thế
giới hiện có rất nhiều loại Kit chẩn đoán nhanh HIV đang được sử dụng. Hầu hết
các Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ELISA hay Western blot đều dựa vào việc
phát hiện p24 hoặc gp41 hoặc cả p24/gp41. So với các phương pháp chẩn đoán HIV
dựa trên việc phát hiện RNA của virus, phương pháp chẩn đoán HIV dựa trên việc
phát hiện kháng nguyên p24 có độ nhậy thấp hơn, và thường không được dùng là
phương pháp duy nhất cho chẩn đoán virus HIV [59]. Tuy nhiên phương pháp phát
hiện p24 đã được gộp vào các phương pháp chẩn đoán HIV thế hệ mới-phương
pháp chẩn đoán HIV thế hệ thứ 4, phát hiện đồng thời kháng thể kháng HIV và
kháng nguyên p24 trong các mẫu huyết thanh. Phương pháp được chứng minh là
nhạy hơn và có độ chính xác cao hơn so với các phương pháp chẩn đoán chỉ phát
hiện kháng thể kháng HIV [55,56]. Ngoài ra sự kết hợp giữa phát hiện kháng
nguyên p24 và gp41 có thể giúp xác định các phân type/các kiểu gen
Luận văn thạc Sỹ - 15 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


(subtypes/genotypes) khác nhau của HIV [57]. Nhiều nghiên cứu cho thấy phương
pháp phát hiện p24 của virus HIV có độ chính xác cao và rẻ tiền so với các phương
pháp phát hiện RNA của HIV [58].
1.3. Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải-AIDS (Acquired Immuno
deficiency Sydrome)
1.3.1 Khái niệm AIDS.
AIDS là tên viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Acquired Immuno Deficiency
Syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải). Trước đây, bệnh được gọi là
SIDA (viết tắt từ tiếng Pháp: Syndrome d'Immuno Deficience Acquise), nhưng do
tên này trùng với tên của Tổ chức phát triển quốc tế Thụy Điển SIDA và tên của Tổ

chức CIDA (Canađa) cũng gọi là "Si đa" nên thống nhất gọi là AIDS để tránh nhầm
lẫn và phù hợp với tên quốc tế.
AIDS là một bệnh mạn tính do HIV gây ra. HIV phá huỷ các tế bào của hệ
miễn dịch, khiến cơ thể bị nhiễm các bệnh nhiễm trùng cơ hội. AIDS được coi là
giai đoạn cuối của quá trình nhiễm HIV. Tuy nhiên, người bị nhiễm AIDS có những
triệu chứng khác nhau, tùy theo loại bệnh nhiễm trùng cơ hội mà người đó mắc
phải, và khả năng chống đỡ của hệ miễn dịch. Bản thân virus và nhiễm trùng được
gọi là HIV. Thuật ngữ AIDS được dùng để chỉ giai đoạn muộn hơn của bệnh. Như
vậy, thuật ngữ nhiễm HIV/AIDS được dùng để chỉ những giai đoạn khác nhau của
cùng một bệnh [2,33].
1.3.2 Lịch sử xuất hiện HIV/AIDS
Năm 1959, chứng bệnh AIDS được phát hiện lần đầu tiên tại Cộng hòa dân
Chủ Congo, nhưng thời điểm đó chưa ai biết bệnh đó là do HIV gây ra [51]. Mãi tới
năm 1981, bệnh AIDS trên lâm sàng mới được phát hiện tại Mỹ. Đó là 5 trường hợp
đồng tính luyến ái nam bị viêm phổi nặng ở Los Angeles, và nhiều trường hợp ung
thư da Kaposi được báo cáo ở New York. Đến cuối 1982, dựa trên những trường
hợp AIDS đầu tiên được thông báo, CDC (trung tâm kiểm soát dịch bệnh của Mỹ –
Centers for Disease Control) đã đưa ra tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm
Luận văn thạc Sỹ - 16 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chưa có phương pháp xét nghiệm căn nguyên [14],
[52].
Năm 1983, Barre Sinoussi trong nhóm nghiên cứu của Montagnier (Viện
Pasteur - Paris) đã phát hiện được virus có liên quan đến bệnh hạch nên đặt tên là
LAV (Lymphadenopathy Associated Virus). Năm 1984, Gallo đã phân lập được 1
virus có ái tính với Lympho T của người nên đặt tên là HTLV typ III (Human T-
Lymphotrophic Virus typ III). Cùng năm đó, Levy đã phân lập được 1 virus có liên
quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch và đặt tên là ARV (AIDS Related Virus).

Đến hội nghị định danh quốc tế năm 1986, cả 3 được thống nhất gọi là virus gây
bệnh suy giảm miễn dịch trên người, viết tắt là HIV-1 [53,35].
Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được HIV thứ 2 ở Tây Phi, đặt tên là
HIV-2. HIV-2 có những đặc tính rất giống với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ
viết tắt là SIV cũng ở Tây Phi. Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học, HIV-2 có thể đã
có ở Tây Phi từ năm 1966. Như vậy, có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm
60 của thế kỉ này hoặc trước đó vài chục năm, nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát
thành đại dịch AIDS/SIDA. Để ghi nhận công lao là những người đầu tiên phát hiện
ra virus HIV, Luc Montagnier và Francoise Barré – Sinoussi đã được trao giải
thưởng Nobel Y học năm 2008 [4,35].
1.3.3 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.3.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới
Theo UNAIDS, ước tính đến hết năm 2009 trên thế giới có khoảng 33,3 triệu
người đang sống chung với HIV, 1,8 triệu người đã tử vong do các bệnh liên quan
đến AIDS. Đây vẫn là con số đáng báo động với tình hình phòng chống HIV/AIDS
trên toàn thế giới [36].
Trong năm 2009 trên thế giới có khoảng 2,6 triệu người nhiễm mới, so với
3,1 triệu người nhiễm mới năm 1999 và 3,2 triệu người năm 1997 thì đã giảm đáng
kể nhưng số lượng người nhiễm vẫn ở mức cao . Với 1,8 triệu người nhiễm mới trên
Luận văn thạc Sỹ - 17 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


tổng số 2,6 triệu người nhiễm mới thì Châu Phi, nhất là vùng sa mạc Sahara vẫn là
trung tâm của đại dịch AIDS [36].
Các khu vực khác trên thế giới như Tây, Trung, Đông âu, Trung á và Bắc mỹ
có tỉ lệ nhiễm mới là tương đối ổn định trong vòng 5 năm trở lại đây. Tuy nhiên các
bằng chứng gần đây lại cho thấy sự lây nhiễm HIV gia tăng trở lại ở những người
nam có quan hệ tình dục đồng ở các nước phát triển. Ở Đông Âu và Trung Á tỉ lệ
lây nhiễm cao xảy ra chủ yếu ở nhóm đối tượng tiêm trích ma túy và bạn tình của

họ (hình 1.10) [36].


Hình 1.10: Bản đồ tình hình dịch HIV/AIDS trên thế giới năm 2009[39]
Ở Châu Á có khoảng 4,9 triệu người đang sống chung với HIV, có 360 nghìn
trường hợp nhiễm mới trong năm 2009. Tình hình dịch bệnh ở đây tập trung chủ
yếu nhóm đối tượng nghiện hút, mại dâm, khách mua dâm và những người nam có
quan hệ tình dục đồng giới, đặc biệt là ở các nước đang phát phát triển như là Ấn
độ. Có đến 90% người nhiễm HIV ở Ấn Độ tin rằng họ bị nhiễm HIV do quan hệ
tình dục không an toàn, nhưng sự sử dụng chung bơm kim tiêm nhiễm bệnh là
phương thức lây truyền chính ở các bang Đông Bắc Ấn Độ [36].


Luận văn thạc Sỹ - 18 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


1.3.3.2 Tình hình HIV/AIDS ở Việt Nam
Tại Việt Nam, trường hợp nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện vào 12/1990,
12/1992 có thêm 11 trường hợp bị nhiễm HIV và đến tháng 06/1999, toàn quốc đã
có 13.623 trường hợp nhiễm HIV, 2.532 bệnh nhân AIDS và 1.320 người đã tử
vong vì AIDS. Theo Bộ Y tế, tính đến 30/11/2010 số trường hợp nhiễm HIV hiện
còn sống là 181.355 trường hợp, số bệnh nhân AIDS hiện còn sống là 42.729 và
48.641 trường hợp tử vong do AIDS [12].
Cùng với sự đô thị hóa, phát triển kinh tế xã hội đang diễn ra một cách mạnh
mẽ, sự di dân tự nhiên tập trung vào các thành phố lớn đã gia tăng đột biến dân số ở
các khu vực này, làm cho diễn biến tình hình lây nhiễm HIV/AIDS ở đây càng trở
lên phức tạp và khó kiểm soát. Số lượng người ở nhiễm HIV/AIDS được báo cáo
tính đến hết ngày 31/3/2010, vẫn tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn mà điển
hình là thành phố Hồ Chí Minh với 42.454 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống,

tiếp theo là Hà Nội với 16.830 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Hải Phòng với
6.577 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Thái Nguyên với 5.635 trường hợp
nhiễm HIV hiện còn sống, Sơn La với 5.206 trường hợp nhiễm HIV hiện còn
sống [9,12].
Dịch bệnh được phát hiện đầu tiên ở thành phố HCM, nhưng đã lây lan và có
mặt ở hầu khắp các tỉnh thành trên cả nước. Cho đến hết 11/2010, đã có trên 74%
số xã, phường và 97,8% số quận/huyện trong toàn quốc đã có báo cáo về người
nhiễm HIV/AIDS. Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có số người nhiễm
HIV/AIDS được báo cáo cao nhất, chiếm khoảng 23% số người nhiễm HIV/AIDS
được báo cáo của cả nước [10].
Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và
tiêm chích ma tuý. Phân tích hình thái nguy cơ lây nhiễm cho thấy, trong số những
người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 9 tháng đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm
qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ
đường lây. Điều này nhấn mạnh nguy cơ tăng tỷ lệ nhiễm HIV ở đối tượng nghiện
chích ma tuý cũng như nguy cơ lan truyền từ người tiêm chích ma tuý sang các
Luận văn thạc Sỹ - 19 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


nhóm khác trong cộng đồng. Bên cạnh đó, hình thức lây nhiễm HIV qua đường tình
dục cũng đang có dấu hiệu gia tăng. Trong 5 năm trở lại đây, tỷ lệ nhiễm HIV báo
cáo do lây nhiễm qua quan hệ tình dục không an toàn theo từng năm tăng dần từ
12% năm 2004 lên 29% năm 2009 và tính đến cuối tháng 9/2010 tỷ lệ này là 38%.
Tình hình lây nhiễm HIV ngày càng trở nên phức tạp bởi sự lây lan giữa hai nhóm
đối tượng có nguy cơ cao này [9,10].
1.3.4 Dịch tễ học
1.3.4.1 Các phương thức lây truyền của HIV
Người nhiễm là nguồn truyền nhiễm duy nhất cho cộng đồng, không có ổ
chứa nhiễm trùng tự nhiên ở động vật. HIV có thể phân lập từ máu, tinh dịch, dịch

tiết âm đạo, nước mắt, sữa mẹ và các dịch khác của cơ thể, tuy nhiên chỉ có máu,
tinh dịch và dịch tiết âm đạo đóng vai trò chính trong lây truyền HIV [3].
Có 3 phương thức lây truyền đã được xác định [3]:
 Lây truyền qua đường tình dục
 Lây truyền theo đường máu
 Lây truyền từ mẹ sang con.
1.3.4.2 Diễn biến huyết thanh người nhiễm HIV/AIDS
Sau khi HIV xâm nhập vào trong tế bào chủ, huyết thanh người có những
diễn biến thay đổi và được chia làm 3 giai đoạn [5]:
 Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection):
Sau nhiễm HIV 1-2 tuần, chưa tìm thấy kháng nguyên (KN) và kháng thể
(KT) kháng HIV trong huyết thanh nhưng từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6 sau nhiễm
HIV, thường thấy KN p24 xuất hiện và sự hình thành KT kháng HIV type IgM
(IgM-anti-HIV). Sau đó KN p24 giảm dần đồng thời với sự xuất hiện KT kháng p24
và KT kháng HIV type IgA. Kháng thể IgM và IgA xuất hiện sớm nhưng không qua
được nhau thai nên không truyền sang cho thai nhi.
 Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (Latent infection):
Luận văn thạc Sỹ - 20 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Ở giai đoạn này, KT kháng p24 mất dần đồng thời với sự giảm dần của nồng
độ IgM anti-HIV để thay thế bằng sự hình thành IgG anti-HIV. Thời kỳ này có thể
kéo dài từ 3 tháng đến 10 năm thậm chí có thể kéo dài lâu hơn nữa tuỳ thuộc vào
khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể. IgG anti-HIV xuất hiện muộn sau khi
nhiễm HIV 6-8 tuần nhưng lại tồn tại lâu dài, ổn định trong suốt quá trình nhiễm
HIV nên đã được sử dụng để xét nghiệm sàng lọc. IgG anti-HIV trong máu người
mẹ nhiễm HIV có thể qua nhau thai để sang thai nhi và nó có thể tồn tại trong máu
con tới 15-18 tháng vì vậy nên xét nghiệm tìm IgG anti-HIV ở trẻ trước 18 tháng
tuổi luôn dương tính.

 Giai đoạn nhiễm trùng cấp: (Acute infection):
Giai đoạn này có sự xuất hiện của hội chứng AIDS. Thời kỳ đầu có biểu hiện
suy giảm miễn dịch do sự giảm sút tế bào TCD4 cũng như sự rối loạn miễn dịch của
tế bào lympho B và đại thực bào nên lâm sàng có hạch sưng ở nhiều nơi kéo dài 2-4
tháng nhưng điều trị viêm không tác dụng. Sau đó, hệ miễn dịch suy giảm trầm
trọng, hội chứng AIDS xuất hiện toàn diện. Trong huyết thanh bệnh nhân thấy sự
xuất hiện trở lại của KN p24 và có thể thấy sự xuất hiện của KN gp41, KT kháng
gp41, KT kháng gp120 (hình 1.11).










Hình 1.11: Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm
HIV[5]
Luận văn thạc Sỹ - 21 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



1.4. Tình hình nghiên cứu HIV ở việt nam
Trong những năm gần đây thì HIV đã thu hút được sự quan tâm của các nhà
khoa học trong và ngoài nước. Các nghiên cứu này không những có ý nghĩa về mặt
khoa học mà còn có nghĩa về mặt thực tiễn rất cao.
Trong nghiên cứu “Sơ lược tình hình nhiễm HIV-1 và các đột biến kháng

thuốc trong điều trị ban đầu ở Hải Phòng, Việt Nam” của nhóm tác giả Nhật Bản và
Việt Nam, được công bố 2/2009 trên tạp chí AIDS RESEARCH AND HUMAN
RETROVIRUSES, đã nghiên cứu về các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc và
sự lưu hành các phân type HIV-1 ở Hải Phòng. Trong công trình này, các tác giả đã
khảo sát 1355 mẫu huyết thanh người nhiễm HIV, trong đó 760 mẫu từ những
người nghiện ma túy, 91 mẫu từ gái mại dâm, 94 mẫu từ các thủy thủ, 200 mẫu từ
các phụ nữ có thai, 210 mẫu từ người cho máu. Phân tích cây phân loại di truyền
cho thấy phân type HIV-1 phổ biến nhất là CRF01_AE chiếm tới 98,3%, 1,4 %
thuộc phân type B và 0,3% là chủng tái tổ hợp giữa B và C cũng được phát hiện
[45].
Một nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả ở Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW về
“HIV-1 phân type CRF 01_AE trong những người tiêm trích ma túy ở Hà Nội, Việt
Nam”, đã cho thấy đặc điểm lưu hành của các phân type HIV ở đối tượng tiêm trích
ma túy ở Hà Nội. Kết quả phân tích 17 mẫu bệnh phẩm được lấy từ 12 vùng thuộc
Hà Nội thì đa số thuộc phân type CRF 01_AE và chỉ có một mẫu duy nhất là thuộc
CRF 01/C tái tổ hợp [48].
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả ở thành phố Hồ Chí Minh được công bố
vào năm 2003, xác định 200 mẫu bệnh phẩm được thu thập ngẫu nhiên ở một số
tỉnh ở miền Nam và tại thành phố Hồ Chí Minh thì có đến 198 mẫu bệnh phẩm
thuộc phân type CRF 01_AE (99%) và chỉ có 2 mẫu bệnh phẩm thuộc phân type B
(2%) [47].
Luận văn thạc Sỹ - 22 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Ngoài các công trình nghiên cứu về HIV đã được công bố còn có rất nhiều
công trình khác thuộc các đề tài, dự án cấp nhà nước do các nhóm nghiên cứu ở các
Viện nghiên cứu và các trường Đại học đã và đang tiến hành.
1.5. Các kỹ thuật phát hiện HIV trong cơ thể
Phát hiện HIV là một việc rất quan trọng trong chẩn đoán, điều tra dịch tễ

học, theo dõi diễn biến của bệnh và giúp cho điều trị hiệu quả [3,].
1.5.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV
Các phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV có thể là phát hiện
bản thân virus ở dạng hoàn chỉnh, RNA/cDNA virus hoặc phát hiện những KN đặc
trưng của virus [5, 8].
* Phân lập virus hoàn chỉnh
Bệnh phẩm có thể là máu, dịch não tuỷ, dịch sinh dục, sữa mẹ, mảnh cắt tổ
chức nhưng phổ biến nhất là sử dụng bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi.
Sau khi phân lập, bạch cầu đơn nhân của người bệnh được nuôi cấy trong
môi trường nhân tạo có thêm những bạch cầu của người lành (có CD4) để virus
thâm nhiễm, nhân lên đạt đủ mật độ để phát hiện ra bằng các kỹ thuật riêng như tìm
KN hay protein đặc trưng của virus. Đây là một kỹ thuật có giá trị, được cho là
chuẩn vàng, nhưng cho kết quả chậm sau khoảng 15 ngày nuôi cấy, đòi hỏi trang
thiết bị hiện đại và tốn kém nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu, xác định chủng virus
được phân lập, đánh giá tính kháng thuốc, chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh và ở những
bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bất thường. Độ nhạy của xét nghiệm chẩn đoán
HIV ở trẻ sơ sinh khi mới sinh khoảng 43% và khi trẻ trên 3 tháng có thể đạt 90-
95% [4].
* Phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử kết hợp với phƣơng pháp miễn
dịch [7].
Kỹ thuật:
 Bệnh phẩm cần phát hiện virus (KN) được ủ với KT đặc hiệu kháng
HIV (IgG anti-HIV). Sau đó, ủ tiếp với KT đơn dòng của chuột chống
IgG người có gắn vàng Au (ký hiệu là α-IgG-Au).
Luận văn thạc Sỹ - 23 - Trần Minh Đức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Kết quả: Nếu phản ứng dương tính, ta có phức hợp KN-IgG-α-IgG-Au và khi
quan sát dưới kính hiển vi điện tử sẽ nhìn rõ các hạt vàng và nơi HIV khư trú.

1.5.2 Phát hiện kháng nguyên của HIV
KN HIV, đặc biệt KN lõi p24 có trong huyết thanh, huyết tương, dịch não
tuỷ có thể được phát hiện bằng phương pháp ELISA tóm bắt kháng nguyên
(Capture ELISA) hoặc bằng kỹ thuật RIA.
Nguyên lý chung của các kỹ thuật này là dùng KT đa dòng (polyclonal
antibody) kháng HIV cố định trong các giếng nhựa hoặc trên các viên bi
polystyrene tiếp xúc với bệnh phẩm cần thử, sau đó, ủ tiếp phức hợp này với KT
kháng HIV có gắn enzyme hoặc chất phóng xạ. Enzyme sẽ làm biến đổi màu cơ
chất. Khi đo màu cơ chất hoặc đo hoạt tính phóng xạ có thể định tính và định lượng
KN.
Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các KN của virus nhưng trên
thực tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các KT chủ yếu hướng tới các protein chính
trong lõi nucleocapsid như p24. Vì vậy, kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện
KN p24. Dấu hiệu mất KN p24 ở những người đã có phản ứng huyết thanh học HIV
dương tính là dấu hiệu nói lên sự khởi đầu của AIDS lâm sàng [11].
Đây là xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (98-99%) nhưng độ nhạy chỉ đạt 10-
25% ở trẻ sơ sinh và 50% ở trẻ lớn hơn [16].
1.5.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong công
tác xét nghiệm, theo dõi điều trị và nghiên cứu sinh học di truyền của virus và là
công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi tiến triển bệnh, chỉ
định và theo dõi hiệu quả điều trị thuốc, nghiên cứu tính kháng thuốc.
+ Các kỹ thuật định tính
- Kỹ thuật PCR
PCR thường ít được sử dụng hơn so với chẩn đoán huyết thanh học và chỉ
được sử dụng trong một số trường hợp nghi là mới nhiễm HIV còn đang trong giai