Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (cylas formicarius)

Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen
cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)


Lê Xuân Thao


Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Phạm Bích Ngọc
Năm bảo vệ: 2012


Abstract. Chương I. Tổng quan tài liệu: Vai trò và giá trị của cây khoai lang; Bọ hà
hại khoai lang (Cylas formicarius); Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium
rhizogens và ứng dụng; Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringensis(Bt).
Chương II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu, hóa chất và thiết bị;
Phương pháp nghiên cứu; Chuyển gen thông qua Agrobacterium; Đánh giá cây trồng
chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus; Tách, tinh sạch DNA tổng số; Kiểm
tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR; Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm
ethidium bromide và đọc kết quả trên máy soi gel; tách protein tổng thực vật; Xác
định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford; Xác định hoạt lực diệt côn
trùng của protein lên sâu non bọ hà; Phương pháp sử lý số liệu. Chương III. Kết quả
và thảo luận: Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus; Kết quả chuyển gen
cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens; Kết quả tách protein tổng số;
Kết quả kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng của protein biến nạp.

Keywords. Vi sinh vật học; Khoai lang; Nghiên cứu tạo rễ; Chuyển gen


Content

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lương thực quan trọng ở vùng nhiệt đới và một
số khu vực ôn đới bao gồm các vùng phía nam của châu Âu và châu Mỹ. Củ khoai lang tích
lũy lượng tinh bột khá cao. Khoai lang giàu năng lượng, vitamin, cũng như hàm lượng
protein từ 2% đến 10% khối lượng chất khô. Tổ chức FAO đánh giá khoai lang là thực phẩm
bổ dưỡng tốt của thế kỷ 21, đang được thị trường thế giới ưa chuộng
Ở nước ta, khoai lang là cây trồng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất lương
thực, đứng thứ 3 sau lúa và ngô. Năng suất khoai lang bình quân ở nước ta là 8,73 tấn/ha,
thấp hơn so với năng suất bình quân của các quốc gia ở châu Mỹ và một số nước châu Á.
Năng suất thấp ngoài các nguyên nhân về giống khoai lang địa phương đã thoái hóa , việc
canh tác khoai lang chưa thực hiện đúng quy trình kỹ thuật thì nguyên nhân chủ yếu là do
tổn thất vì sâu bệnh , đă
̣
c biê
̣
t la
̀
do bọ hà hại khoai . Ở Việt Nam, các vùng khô hạn miền núi
phía Bắc, các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên củ khoai lang bị bọ hà gây hại rất nặng, nhất là
trong các vụ hè thu tỷ lệ củ bị hại có thể lên đến 30 – 50%, thậm chí lên đến 100% . Thiệt hại
chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đường đục làm cho củ
khoai xuất hiện những vết thâm, mùi hắc và vị đắng khi ăn.
Việc chuyển gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoai lang thông qua hệ
thống chuyển gen ở thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium đang là hướng đi mới. Tuy nhiên,
cho tới nay, tạo cây khoai lang chuyển gen gặp nhiều khó khăn. Do vậy tối ưu hóa quy trình
chuyển gen thông qua Agrobacterium, cũng như thử nghiệm hoạt động của cấu trúc gen biến
nạp thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ là rất cần thiết.
Với mục đích làm cơ sở cho việc nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà, căn
cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: ―Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà
(Cylas formicarius)‖
2. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang thông
qua vi khuẩn Agrobacterium.
- Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang gen cry3 thông qua Agrobacterium rhizogens
sử dụng làm mô hình đánh giá hoạt động cấu trúc của gen chuyển.
3. Nội dung của đề tài
- Tối ưu một số yếu tố trong quy trình chuyển gen vào khoai lang KB1 nhờ vi khuẩn
A.rhizogens thông qua biểu hiện của gen gus.
- Chuyển gen cry3 vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens và kiểm tra
biểu hiện của cấu trúc gen chuyển trong các dòng rễ tơ.


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vai trò và giá trị của cây khoai lang
1.1.1. Sơ lược về cây khoai lang
Khoai lang trồng ở vùng nhiệt đới cây thân thảo sống lâu năm, trồng ở vùng ôn đới,
thường có dạng bụi. Chúng là cây giao phấn, ngày ngắn, không ra hoa khi ngày dài quá 13
giờ 30 phút, do đó ít khi ra hoa ở những vùng có vĩ độ ôn đới trên 30 độ Bắc hay Nam.
Khoai lang có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, được con người trồng cách
đây trên 5000 năm. Hiện nay, khoai lang được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và một số
vùng cận nhiệt đới, ôn đới.
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cây khoai lang
Trong 100g củ khoai lang tươi trung bình có 68g nước; 0,8g protein; 0,2g lipid; 28,5g
glucid và 1,3g cellulose, có thể cung cấp cho cơ thể khoảng 122 calo. Ngoài ra trong khoai
lang tươi còn có nhiều vitamin và muối khoáng. Trong 100g khoai lang khô có 11g nước,
2,2g protein, 0,5g lipid, 80g glucid, 3,6g cellulose, nhiều vitamin và muối khoáng.
Theo số liệu thống kê của FAO, trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm lương thực,

13% làm thức ăn gia súc, 3% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau.
Phần loại bỏ đi rất ít chiếm 6%, phần thân lá ngọn vừa được sử dụng làm rau xanh cho con
người đồng thời là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi gia súc. Do giá trị dinh dưỡng cao, thuận
tiện trong chế biến với nhiều mục đích khác nhau, ngày nay cây khoai lang ngày càng khẳng
định giá trị của mình trong nền kinh tế. Cho đến nay khoai lang được trồng phổ biến trên cả
nước. Tuy nhiên do có những hạn chế về năng suất, bảo quản chế biến sau thu hoạch nên
những năm gần đây diện tích trồng giảm, năng suất thấp và chưa ổn định.
1.2. Bọ hà hại khoai lang (Cylas formicarius)
1.2.1. Đặc điểm sinh học của bọ hà hại khoai lang
Bọ hà khoai lang, Cylas formicarius, thuộc chi Ipomea. Bọ hà trưởng thành có mình thon,
chân dài, đầu đen, mắt kép hình bán cầu hơi lồi ra hai bên đầu. Râu đầu 10 đốt. Ngực, đốt cuối râu và
mắt màu đỏ. Bụng và cánh màu xanh đen bóng. Đốt cuối râu bọ đực trưởng thành hình ống dài, của
con cái có hình trứng. Ngực trước có chiều dài gấp đôi chiều rộng, đốt đùi nở to. Bọ hà trưởng thành
dài 6-8,5mm.

Hình 1.1. Bọ hà trƣởng thành
(nguồn:

Tuỳ thuộc vào điều kiện sống mà vòng đời của bọ hà có thể kéo dài từ 4-6 tuần. Pha trứng
kéo dài từ 5-8 ngày. Sâu non có kích thước 6mm1,6mm. Ở 30
0
C thời gian phát dục của sâu non bọ
hà là 15-20 ngày. Nhộng có kích thước 5,0  1,6mm, thời gian phát dục của pha nhộng là 5-7 ngày.
Sau khi vũ hoá, bọ hà trưởng thành nằm trong đường đục 6-9 ngày. Khi bọ hà trưởng thành chui ra
khỏi củ khoai, ăn thêm và tiến hành giao phối. Sau 2-3 ngày bọ hà trưởng thành bắt đầu đẻ trứng.
1.2.2. Tập tính sống và gây hại của bọ hà
Bọ hà trưởng thành ăn phần biểu bì của lá, cuộng, dây và củ khoai khiến cho cây héo và chết.
Nhưng điều này không ảnh hưởng gì đến sản lượng củ. Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục
ăn thịt củ và thải phân ngay trong đường đục. Để phản ứng lại sự gây hại của bọ hà, củ khoai sinh ra
chất độc có mùi đặc biệt. Chất độc này có thể gây hại đối với phổi và tim của người và gia súc khi ăn

củ bị hà.
Do ưa ánh sáng tán xạ nên bọ hà trưởng thành có thể hoạt động cả ban ngày và ban đêm, tuy
nhiên mọi hoạt động diễn ra mạnh mẽ nhất vào lúc chiều tối, ở các ruộng rậm rạp
1.3. Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogens và ứng dụng
1.3.1. Giới thiệu vi khuẩn A. rhizogens
Vi khuẩn A. tunefaciens gây ra bệnh khối u (crown gall), A. rhizogenes gây bệnh
lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm.
Tác nhân gây bệnh của vi khuẩn A. tumefaciens, A. rhizogenes được xác định là do
sự có mặt của plasmid Ti (tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing) ở A.
rhizogenes
Giống như Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng
lượng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và vir (virulence).

Hình 1.2. Cấu trúc plasmid Ri của A. rhizogenes

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là vùng biên trái
T
L
-DNA và biên phải T
R
-DNA. T
L
-DNA và T
R
-DNA. Hai vùng này đều có kích thước
khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA xen kẽ không được
chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng T
R
-DNA mang các gen mã hóa tổng hợp
DNA, vùng T

L
-DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs) trong đó có bốn locus 10, 11, 12
và 15 mã hóa cho rol A, B, C và D.
Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ
tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở
mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng
hơn cả trong việc cảm ứng kiểu hình rễ tơ.
1.3.2. Hệ vector nhị thể
Kích thước quá lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid (200 đến 800kb) gây nhiều khó
khăn trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác sử dụng
để thiết kế gen vào các vector này. Nên các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành
một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ
(mang các gen vir) đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật.


Hình 1.3. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái)
và rễ tơ do A. rhizogenes (phải)
- Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các
gen không cần thiết như gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự biên trái (T-border
left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm:
- Vector bổ trợ: cấu trúc gồm các gen vir được tách và đưa vào chung một plasmit
đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmit này được cải biến loại bỏ gen
kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, những vẫn duy khả năng thâm nhập vào tế
bào thực vật.
1.3.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ

Hình 1.4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra
a: Bằng hệ thống bioreactor
b, c: Thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy
(Nguồn:o/content/vol11/issue2/full/6/f4.jpg&imgrefurl)

Rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra.
Hê
̣
thống rê
̃
đa bô
̣
i la
̀
nơi ly
́
tươ
̉
ng đê
̉
sa
̉
n sinh ra ho
́
a chất thư
̣
c vâ
̣
t va
̀
chu
́
ng rất ô
̉

n đi
̣
nh về di
truyền. Rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, sinh trươ
̉
ng nhanh. Đặc biệt hơn
ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ
hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh
sạch các dược phẩm sinh học này.
Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein tái tổ hợp hay
các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ như SEAP protein huỳnh
quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B, fungal phytase, và đặc biệt hơn cả là các
kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể.

Hình 1.5. Một số ứng dụng của rễ tơ
(nguồn:
1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng lên quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium
Trong thực tế Agrobacterium thường chỉ gây hại ở cây hai lá mầm. Vì vậy tần suất
chuyển nạp gen ở cây hai lá mầm cao hơn nhiều so với cây một lá mầm.
Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc vào một số yếu
tố như tiền xử lý mô thực vật, nguồn vật liệu gây nhiễm, nồng độ vi khuẩn, thời gian lây
nhiễm và đặc biệt là khả năng tái sinh của thực vật sau biến nạp
1.4. Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringiensis (Bt)
1.4.1. Sơ lược về Bt
Bt là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, kỵ khí hoặc hiếu khí tùy tiện, là chủng vi
khuẩn đất điển hình. Sinh trưởng ở nhiệt độ 15-45
0
C nhưng thích hợp nhất ở nhiệt độ 29-
32
0

C. Genome của Bt có kích thước 2,4 - 5,7Mb, phần lớn có chứa một hay nhiều plasmid
khác loại.

Hình 1.6. Bào tử và tinh thể độc ở Bacillus thuringiensis
A-Tế bào Bt dưới kính hiển vi điện tử; B - Tinh thể độc; C- Tinh thể độc phóng to;
sp- bào tử; c-tinh thể độc
(Nguồn:
Bt có khả năng sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (, ,  - exotoxin) và
nội bào (- endotoxin). Trong các protein tinh thể độc, - endotoxin là một họ protein tinh thể
độc chính gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng. Trong các loại độc tố, thì -endotoxin (Cry
toxins), -exotoxin là các độc tố được nghiên cứu nhiều nhất về mặt phân tử và phổ tác dụng
với côn trùng.
1.4.2. Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt
1.4.2.1 Các gen nội độc tố cry
Năm 1989, Whiteley đã xây dựng một hệ thống phân loại các gen cry. Dựa trên sự
khác nhau về trọng lượng protein, phổ tác dụng với côn trùng được chia thành năm nhóm
chính bao gồm: Gen thuộc lớp cry I (A, B, C) gây độc với các côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy;
Các gen thuộc lớp Cry II gây độc lên cả hai Bộ Cánh vảy và Hai cánh; Gen cry III (A, B, C,
D, E) gây độc với ấu trùng thuộc Bộ Hai cánh; Các gen thuộc lớp cry IV gây độc với côn
trùng thuộc Bộ hai cánh; Nhóm gen cry V có độc tính với côn trùng thuộc Bộ Cánh cứng và
Cánh vảy

Bảng 1.2. Phân loại độc tố cry (Nguồn: Tổ chức y tế thế giới, 1999)
Gene
Hình dạng
tinh thể độc
Trọng lƣợng
protein (kDa)
Tác động lên côn
trùng

Cry I [phân nhóm: A(a), A(b), B,
C, D, E, F, G]
Thoi
130-160
Bộ cánh vảy
Cry II [phân nhóm A, B, C]
Tháp
68-71
Bộ cánh vảy, hai
cánh
Cry III [phân nhóm A, B, C]
Thoi
66-73
Bộ hai cánh
Cry IV [phân nhóm A, B, C, D]
Thoi/tháp
72-135
Bộ hai cánh
Cry V-IX
Nhiều loại
35-129
Nhiều loại
1.4.2.2. Các gen ngoại độc tố khác
Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xương sống và
không xương sống, hồng cầu động vật có vú.
Nhóm gen vip: Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh dưỡng trong chu trình phát
triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt côn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein
độc do gen cry mã hóa. Cơ chế tác dụng độc của các loại protein Vip bước đầu cho thấy
giống như cách tác dụng của tinh thể - endotoxins.
1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng

Tinh thể độc có thể chiếm đến trên 25% trọng lượng khô của tế bào có bản chất là
protein, được tổng hợp trong pha cân bằng của Bt

Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry 3A
(nguồn: http:// www.bioc.cam.ac.uk/UTOs/Ellar.html)

Các protein độc của Bt hoạt động có chung một cơ chế tác động gây độc chung với
côn trùng gồm 3 bước chính: Hoạt hóa tiền độc tố; Gắn độc tố lên các tế bào biểu bì ruột;
Làm mất cân bằng áp suất thẩm thấu và phá vỡ tế bào làm côn trùng chết.

Hình 1.8. Mô hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng [56]

1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen
Có rất nhiều các nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng tái sinh cây khoai lang in
vitro và các nghiên cứu hệ thống chuyển gen sử dụng vector chỉ thị bằng phương pháp
bắn gen hay thông qua Agrobacterium. Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã công
bố về tạo cây khoai lang chuyển gen có ích như gen cry kháng côn trùng qua hệ thống
chuyển gen bằng Agrobacterium
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về hệ thống tái sinh và hệ thống chuyển
gen vào cây khoai lang sử dụng vector mang gen chỉ thị để nhằm mục đích hoàn thiện
qui trình chuyển gen làm cơ sở cho bước chuyển gen sau này.


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
a. Thực vật:
Thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá, đoạn thân và chồi giống
khoai lang KB1 thu thập từ Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam, nuôi cấy trong điều kiện

in vitro.
b. Chủng vi khuẩn:
- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834/PTN289 (Viện Sinh học phân tử và
Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức)
- Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3
2.1.2. Hóa chất
Các môi trường nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: YMP
- Môi trường nuôi cấy thực vật MS
- Môi trường đồng nuôi cấy và cảm ứng tạo rễ tơ: WPM
Các loại kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxime, Spectinomycine.
Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học mua
từ các hãng nổi tiếng như Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New
England Biolabs
2.1.3. Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô thực vật; dùng trong sinh học phân tử của phòng
Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium
2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium
Agrobacterium được nuôi ở nhiệt độ 28
0
C trên các môi trường: Trên môi trường thạch
YEP bổ sung 50 mg/L spectinomycine trong 36-48 giờ. Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi
trong 5ml môi trường YEP lỏng bổ sung 50mg/L spectinomycine, sau 8 giờ, chuyển toàn bộ
5ml dịch nuôi cấy trên sang 45ml môi trường YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine
nuôi lắc 220 vòng/phút, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với
tốc độ 6000-6500 vòng/ phút, ở 4
0
C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi

trường 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD
600
 0.5-0.9.
2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá
Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro được cắt thành
những mảnh nhỏ có kích thước 1cm
2
, sau đó được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phòng, tiếp đến được đặt lên môi trường WPM và nuôi trong
tối 48 giờ, ở nhiệt độ 26
0
C

 2
0
C. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cảm ứng các mảnh lá
được chuyển sang môi trường chọn lọc.
2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus.
Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất
X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên
kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là
phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.
2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số
Các mẫu sau biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc, sau 30 ngày lựa chọn các
dòng rễ trắng, đầu rễ không bị thâm đen, sinh trưởng tốt để nuôi sinh khối trên môi trường
WPM lỏng. Sau 30-45 ngày mang đi tách và tinh sạch DNA tổng số theo phương pháp của
Gawel và Jarret (1991).
2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR
Các dòng sinh khối rễ sau khi tách DNA được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp
mồi cry3, virC để kiểm tra và khẳng định sự hiện diện của gen cry3 trong các dòng rễ biến nap.

Trình tự các cặp mồi cry3 và virC được sử dụng để đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry3
vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogenes
cry3_F
5’-GTTTAAGGATTATGTTTCCGCCCT-3’
cry3_R
5’-ATTCAAGGTTTTGGACATCCAGAG-3’
virC_F
5'-ATCATTTGTAGCGACT-3'
virC_R
5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3'

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT
Thành phần
Thể tích (µl)
1
Nước deion khử trùng
12,5
2
Buffer 10x
2,5
3
dNTPs
2,0
4
DNA
5,0
5
Taq polymerase
1,0

6
Primer F
1,0
7
Primer R
1,0
Tổng
25

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc
Phản ứng
Nhiệt độ (
0
C)
Thời gian (giây)
Số chu kỳ
1
Biến tính
95
180
1
2
Biến tính
93
30
35
3
Gắn mồi
52

30
4
Kéo dài chuỗi
72
70
5
Hoàn tất chuỗi
72
10 phút
1
6
Kết thúc phản ứng
4
∞


2.2.5. Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm Ethidium Bromide và đọc kết quả trên
máy soi gel
Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra kết quả DNA tổng số,
kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kĩ thuật PCR…
Mẫu DNA tách chiết được điện di với dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100-
130V, cường độ dòng điện 60 – 80mA. Kết thúc mẫu được nhuộm với EtBr: Bản gel được
lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (10g/ml) trong thời gian 20 phút. Gel được
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.
2.3. Tách protein tổng số thực vật
Rễ khoai lang nuôi cấy invitro 30-45 ngày trong môi trường WPM lỏng, được sử
dụng để tách protein tổng số: Rễ được rửa sạch, làm khô, nghiền nhỏ và bổ xung đệm chiết
PBS + tween 0,05%. Kết thúc thời gian chiết mẫu được ly tâm 12000 vòng/phút trong thời
gian 10 phút, ở 4
0

C. Thu phần dịch nổi
2.4. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.
- Dựng đường chuẩn.
Từ dung dịch chuẩn BSA có nồng độ 0; 0,25; 0,5; 1; 2,5mg/ml, được thêm dung dịch
thuốc thử Bradford và đo OD ở bước song 595nm. Từ các giá trị OD thu được dựng đường
chuẩn và xây dựng phương trình tuyến tính.
- Xác định nồng độ protein trong mẫu.
Mẫu được bổ xung thuốc thử Bradford và đo OD ở bước song 595nm.
Từ các giá trị OD
595
thu được và phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein
với mật độ quang tính được hàm lượng protein trong các mẫu phân tích.
2.5. Xác định hoạt lực diệt côn trùng của protein lên sâu non bọ hà
2.5.1. Nuôi sâu non bọ hà
Nuôi khoảng 200 bọ hà trưởng thành trong hộp nhựa có 3-4 củ khoai lang. Giữ các
hộp này trong tối ở 30
0
C. Để thu được sâu non đồng đều cho thí nghiệm, cứ sau 3 ngày lại
chuyển bọ trưởng thành sang một hộp khoai mới. Sau 2 tuần, mỗi hộp sẽ có khoảng 500 sâu
non cho thí nghiệm. Sử dụng sâu non tuổi 2 cho thí nghiệm.
2.5.2. Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà
Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà bao gồm 15 thành phần (phụ lục 2). Các thành
phần này được trộn lẫn với nhau, thêm agar (40g/l) và khử trùng.
2.5.3. Đánh giá hoạt lực của protein lên sâu non bọ hà
Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà được khử trùng, làm nguội, đổ vào các giếng với
200l thức ăn/giếng. Để khô ở nhiệt độ phòng. Bổ xung thêm 20g; 40g/ml prtein tách
chiết ở trên lên bề mặt thức ăn, để bay hơi tự nhiên. Sử dụng đệm pha loãng protein làm đối
chứng. Mỗi giếng thả một sâu non tuổi 2 và nuôi trong tối ở 28

0
C. Quan sát đĩa sâu hàng
ngày để đếm số sâu chết ở các giếng.
2.6. Phƣơng pháp sử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng ANOVA với độ tin cậy 95%.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus
3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng biến nạp
Thời gian
lây nhiễm
(phút)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
10
100x3
16
19

20
18,33+4,33
18,33+4,33
20
100x3
42
45
41
42,67+4,33
42,67+4,33
30
100x3
30
31
27
29,33+4,33
29,33+4,33

Qua biểu hiện tạm thời của gen gus trên các mô lá, kết quả cho thấy sự khác biệt là có
ý nghĩa (α = 0,05) trong các khoảng thời gian lây nhiễm là 10 phút, 20 phút và 30 phút. Dựa
vào kết quả trên chúng tôi chọn thời gian lây nhiễm 20 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp
Đồng nuôi
cấy (ngày)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus

Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
2
100x3
20
20
21
20,33+0,33
20,33+0,33
3
100x3
19
20
23
20,67+4,33
20,67+4,33
4
100x3
20
21
21
20,67+0,33
20,67+0,33

Qua bảng trên cho thấy khi thời gian đồng nuôi cấy tăng từ 2 đến 4 ngày tỷ lệ các mẫu dương
tính khi nhuộm gus khác nhau không nhiều (từ 20,33% và 20,67%). Kết quả sự khác biệt
không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian đồng nuôi cấy 2
ngày cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp
Mật độ tế bào
vi khuẩn
(OD)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu
xanh khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
0,5
100x3
14
13
14
13,67+0,33
13,67+0,33
0,6

100x3
17
19
22
19,33+6,33
19,33+6,33
0,7
100x3
29
30
32
30,33+2,33
30,33+2,33
0,8
100x3
36
35
38
36,33+2,33
36,33+2,33
0,9
100x3
22
20
25
22,33+6,33
22,33+6,33

Theo bảng trên cho thấy kết quả dương tính khi nhuộm gus cao nhất đối với dịch
huyền phù vi khuẩn có OD

600
= 0,8 đạt 36,33%. Với α=0,05 kết quả cho thấy sự khác biệt
trong hiệu quả biến nạp giữa các giá trị OD là có ý nghĩa. Chúng tôi sử dụng mật độ tế bào vi
khuẩn có giá trị OD
600
= 0,8 cho các nghiên cứu tiếp theo.

A

B
Hình 3.1. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Mẫu lá âm tính B. Mẫu lá dương tính (chuyển xanh do gen Gus)
3.1.4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng (AS) đến khả năng biến nạp
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ chất cẩm ứng AS đến khả năng biến nạp
Nồng độ AS
(µM)
Tổng số
mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus
Giá trị trung
bình
Tỷ lệ % các
mảnh bắt màu
xanh
Lần 1
Lần 2
Lần 3
0
100x3

30
32
32
31+1,33
31+1,33
100
100x3
39
42
40
40,33+2,33
40,33+2,33
150
100x3
40
38
41
39,67+2,33
39,67+2,33
200
100x3
39
42
42
41,00+3,00
41,00+3,00
Kết quả bảng trên cho thấy khi bổ xung thêm AS vào biến nạp thì hiệu quả biến nạp
tăng lên rõ rệt giữa mẫu đối chứng với các mẫu có sử dụng AS. Tuy nhiên giữa các mẫu có
bổ xung AS thì sự khác nhau trong hiệu quả biến nạp là không nhiều (α=0,05). Vì vậy để
giảm chi phí chúng tôi lựa chọn bổ xung AS có nồng độ 100µM vào môi trường biến nạp cho

các thí nghiệm chuyển gen cry.

A

B
Hình 3.2. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Rễ âm tính B. Rễ dương tính (chuyển xanh do gen gus)
3.2. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens
3.2.1. Sơ bộ đánh kết quả chuyển gen thông qua A. rhizogens mang vector pIBT/cry3
Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogens, mẫu lá được đặt trên môi trường
chọn lọc WPM. Tỷ lệ cảm ứng tạo rễ của các mẫu trên môi trường chọn lọc có 500 mg/L
cefotaxime và kanamycine 50mg/L sau khi nhiễm với A. rhizogens và mẫu đối chứng.

Hình 3.3. Rễ tơ ở các mô chuyển gen

Thí
nghiệm
Tổng số
mẫu
Số mô
sống sau
1 tuần
Số mô
sống sau 2
tuần
Số mô
sống sau 3
tuần
Số mô
sống sau

4 tuần
Số mô cảm
ứng tạo rễ
Biến nạp
300
235
197
149
103
18
Đối chứng
50
0
0
0
0
0
Ở mẫu đối chứng các mẫu bị vàng và chết ở ngay tuần đầu tiên khi nuôi trên môi
trường chọn lọc. Ở mẫu biến nạp các mô sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo
thời gian. Các dòng rễ tơ này tiếp tục được chọn lọc trên môi trường nuôi cấy lỏng tạo sinh
khối để tách DNA và kiểm tra bằng phản ứng PCR.

A

B

C

D
Hình 3.4. Kết quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang KB1

A. Mẫu lá đối chứng không biến nạp gen sau 2 tuần trên môi trường WPM + cefotaxime 500
mg/L + kanamycine 50mg/L
B. Mẫu lá biến nạp A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 sau 2 tuần trên môi trường WPM +
cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
C. Mẫu rễ đối chứng không biến nạp gen sau 2 tuần nuôi lỏng trên môi trường WPM +
cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
D. Mẫu rễ biến nạp A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 sau 2 tuần nuôi lỏng trên môi trường
WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
3.2.2. Kết quả tinh sạch DNA khoai lang tổng số
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra tách DNA tổng số
M: marker 1kb; 1-12: Các dòng rễ tơ khoai lang.
Kết qua cho thấy chúng tôi đã tách thành công DNA tổng số trên 12 dòng rễ tơ khoai
lang KB1. DNA tổng số được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua A. rhizogens
+
-

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
M

Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi cry3
M: Thang chuẩn DNA 1kb
(-): Đối chứng âm với đệm TE 1X
(+): Đối chứng dương sử dụng vector pIBT/cry3
1-12: Các dòng rễ khoai lang.

M
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
-
+

Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi virC
M: Thang chuẩn DNA 1kb
(-): Đối chứng âm với đệm TE 1X
(+): Đối chứng dương với vi khuẩn A. rhizogens
1-12: Các dòng rễ khoai lang.
Từ hình 3.6 và 3.7 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công gen cry3 vào 01
dòng khoai lang KB1 (mẫu 9).
3.3. Kết quả tách protein tổng số
Với hệ số tương quan R
2
= 0,98748. Chúng tôi thu được phương trình tuyến tính giữa
nòng độ protein và giá trị OD
595
như sau.
Y = 0,2748x + 0,022
941bp
1000bp
750bp
~700bp
750bp
500bp
Bảng 3.5. Hàm lƣợng protein trong các dòng KB1
Mẫu
OD

595

Protein (mg/ml)
1
0,000
0,00
2
0,071
0,25
3
0,173
0,50
4
0,345
1,00
5
0,689
2,50
6
0,113
0,404
7
0,272
0,910
Trong đó: Từ mẫu 1 đến 5: protein chuẩn BSA
Mẫu 6: Dòng khoai lang có kết quả PCR âm tính
Mẫu 7: Dòng khoai lang có kết quả PCR dương tính
3.4. Kết quả kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng của protein biến nạp
Bảng 3.6. Hoạt lực diệt côn trung của protein lên sâu non bọ hà
Dòng rễ

tơ
Protein
(µg/giếng)
Tổng số
sâu thử
Số sâu chết
Tỷ lệ trung bình
sâu chết (%)
Lần 1
Lần 2
Lần 3
1
0
3x3
0
0
1
11,11+0,03
2
20
3x3
0
0
0
0,00+0,00
40
3x3
0
1
0

11,11+0,03
3
20
3x3
1
1
0
22,22+0,03
40
3x3
2
2
2
66,67+0,00
Trong đó: 1: Mẫu đối chứng (sử dụng đệm PBS)
2: Mẫu có kết quả PCR âm tính với gen cry 3
3: Mẫu có kết quả PCR dương tính với gen cry 3

Sâu non ở mẫu đối chứng (trái) và mẫu 2
(phải) (dòng rễ tơ âm tính với gen cry3)

Sâu non chết ở mẫu 3 (dòng rễ tơ dương
tính với gen cry3)
Hình 3.8. Kết quả thử hoạt tính protein độc lên sâu non bọ hà



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết Luận
- Xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai

lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen
chỉ thị gus.
Thời gian biến nạp: 20 phút
Thời gian đồng nuôi cấy: 2 ngày
Nồng độ chất cảm ứng AS bổ xung vào huyền phù vi khuẩn: 100µM
OD huyền phù vi khuẩn: 0,8
- Bước đầu đã thu nhận được 01 dòng khoai lang KB1 mang gen cry3 kháng bọ hà.
- Bước đầu đã xác định được protein tạo thành từ dòng khoai lang chuyển gen cry3
có hoạt tính độc đối với sâu non bọ hà tuổi 2.
Kiến nghị
Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất kiến nghị như sau:
- Tiếp tục tách, tinh sạch và định lượng protein cry3 được mã hóa bởi gen cry3
trong các dòng rễ tơ chuyển gen
- Tiến hành thử protein cry3 đã được tinh sạch lên sâu non bọ hà để đánh giá hiệu
quả diệt sâu non bọ hà một cách chính xác.
- Tiếp tục tạo các dòng rễ tơ chuyển gen từ các giống khoai lang khác, sử dụng các
cấu trúc gen khác nhau và đánh giá hoạt động các gen được chuyển, để hoàn thiện
phương pháp chuyển gen vào khoai lang.



References

Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong
cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003),
Áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. Nhà xuất
bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
3. Phan Văn Chi (2003), ―Khối phổ trong nghiên cứu proteomics‖, Tạp chí Công nghệ Sinh

học, 1(1), tr. 11-24.
4. Nguyễn Hoài Hương, Bùi Thế Vinh (2009), Thực hành hóa sinh, Đại học Quốc Gia,
TPHCM.
5. Bùi Thị Hương (2002), Phân lập và phân loại và xác định tính chất sinh hoá và sinh học
phân tử của một số chúng Bacillus thuringiensis ở Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ sinh
học, tr. 1-4.
6. Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng
côn trùng để chuyển vào cây trồng, Luận văn Tiến sĩ Sinh học, tr. 22-28; 33-36.
7. Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo quản nhân giống
và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomea batatas L.), Luận văn Thạc sĩ sinh học,
Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội.
8. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2007), Công nghệ gen trong nông
nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.
9. Đinh Thế Lộc (1977), Kỹ thuật canh tác cây khoai lang, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà
Nội, tr. 5-13.
10. Ngô Xuân Mạnh (1996), Nghiên cứu các chỉ tiêu phẩm chất và một số biện pháp chế
biến nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng khoai lang trồng vụ đông ở miền Bắc Việt
Nam, Luận án phó Tiến sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I,
Hà Nội.
11. Nguyễn Trung Nam, Vũ Đình Hoà, Đinh Sơn Quang, Nguyễn Thị Bích Thuỷ, Võ Thị
Thứ, Lê Trần Bình (2001), ―Sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục
vụ cho việc phân lập gen kháng bọ hà ở khoai lang‖, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học,
Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.206-213.
12. Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ và kỹ thuật thâm canh, Nhà xuất
bản Lao động xã hội, Hà Nội. Tập 1.
13. Phạm Bích Ngọc, Đinh Thị Phòng, Egnin M., Prakash C.S., Lê Trần Bình (2002), ―Hoàn
thiện phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens‖, Tạp chí Khoa
học và Công nghệ, 40, tr. 142-149.
14. Lâm Đại Nhân (2000), Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein
vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở Việt Nam, Luận văn

Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36.
15. Nguyễn thị Kim Oanh, Elske Van de Fliert, Ann R. Braun (2001), Quản lý dịch hại tổng
hợp cây khoai lang, Trung tâm Khoai tây quốc tế, tr. 106-113.
16. Nguyễn Công Tạn (2012), Vị thế mới của cây khoai lang trong nền nông nghiệp, Nhà
xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
17. Lê Thị Bích Thảo (2003), Nghiên cứu biểu hiện và tinh chế protein lai HSP2, Luận văn
Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36.
18. Nguyễn Văn Toản, Nguyễn Văn Đĩnh và Nguyễn Bích Thuỷ (1997), ―Kết quả bước đầu
sử dụng vật liệu ngăn ngừa bọ hà (Cylas farmicarius) trong bảo quản khoai lang tươi‖,
Tạp chí BVTV, 1, tr. 26-28.
19. Nguyễn Thị Bích Thuỷ (1997), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của bọ hà (Cylas
formicarius fabricius) và biện pháp phòng chống chúng trong thời kỳ bao quản khoai
lang tươi, Luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp, tr. 40-42; 54-59; 80-83.
20. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Nhà xuất
bản Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Tập 1.

Tài liệu tiếng Anh
21. Amoah, B.K., H. Wu, C. Sparks and H.D. Jones (2001) ―Factors influencing
Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue‖,
Journal of Experimental Botany, 52(358), pp.1135-1142.
22. Bo Yu. Hong Zhai. Yuping Wang. Ning Zang. Shaozhen He. Qingchang Liu (2007),
―Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using embryogenic
suspension cultures in sweetpotato, Ipomoea batatas (L.) Lam.‖, Plant Cell Tiss Organ
Cult, 90, pp. 265–273.
23. Briew L. O., Henrry R. J. (2000), Transgenic Cereal, American Association of Cereal
Chemist St. Paul, Minnesota, USA, pp. 649-656.
24. Cannon R. J. C. (1997) ―Bacillus thuringiensis use in agriculture: A molecular
perspective‖, Biol. Rev., 71, pp. 561-636.
25. Cao-guo Y., Martha A. M., Gregory W. W., Micheal G. K. and Juan J. E. (1997), ―The
Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium

cells of susceptible insects‖, Appl. Environ. Microbiol, 63, pp. 532-536.
26. Carozzi, N. B., V. C. Kramer, G.W.Warren, S.Evola, and M.G. Koziel (1991),
“Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase
chain reaction product profile‖, Appl. Environ. Microbiol, 57, pp. 3057-3061.
27. De Maagd R., H. Van Der Klei, P. L. Bakker, W. J. Stiekema, and D. Bosch (1996)
―Different domains of Bacillus thuringiensis δ-endotoxins can bind to insect midgut
membrane protens on ligand blots.‖, Appl. Environ. Microbiol, 62, pp. 2753-2757.
28. De Maagd R.A., A. Bravo, and N. Crickmore (2001) ―How Bacillus thuringiensis has
evolved specific toxins to colonize the insect world.‖, Trends in Genetic, 17, pp. 193-
200.
29. Dix P. J. (1986), Plant Cell Culture Technology, Yeoman M.M, Oxford, Blackwell
Scientific Publication, pp.143-201.
30. Drake, P.M.W., D.M. Chargelegue, N.D. Vine, C.J. van Dolleweerd, P. Obregon, and
J.K.C. Ma (2003), ―Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from
transgenic tobacco roots‖, Plant Molecular Biology, 52(1): p. 233-241.
31. Ekobu M, Solera M, Kyamanywa S, Mwanga RO, Odongo B, Ghislain M, Moar WJ
(2010), ―Toxicity of seven Bacillus thuringiensis Cry proteins against Cylas
puncticollis and Cylas brunneus (Coleoptera: Brentidae) using a novel artificial diet‖, J
Econ Entomol, 103(4), pp. 1493-502.
32. FAOSTAT (1998), FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations)
Statistics Database (Online). Accessed June 1999. Available .
33. Francis R. and Donald H. D (1996), Report on Molecular of Bacillus thuringiensis,
Bacillus thuringiensis conferences in Thailand, pp. 2-3; 8-13.
34. Gawel N.J and Jarret R.L (1991), ―A modified CTAB DNA extraction procedure for
Musa and Ipomoea‖ Plant Molecular Biology Reporter, 9, pp. 262-266.
35. Gill S. S., E. A Cowles, and P. V. Pietranto (1992), ―The mode of action of Bacillus
thuringiensis endotoxins‖, Annu. Rev. Entomol., 37, pp. 615-636.
36. Grachulski P., L. Masson, S. Borisova, M. Puzstai-Carey, J L. Schwartz, R. Brousseau,
and M. Cygler (1995), ―Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal
structure and channel formation‖, J. Mol. Biol., 254, pp. 447-464.

37. Gregory C. Philips, John F. Hubstenberger, and Elizabeth E. Hansen. (1995), ―Plant
regeneration from callus and cell suspension cultures by somatic embryogenesis‖, Plant
Cell, Tissue and Organ Culture. Springer, pp. 80-82.
38. Guo-Qing Song, Hideo Honda, and Ken-Ichi Yamaguchi (2004), ―Efficient
Agrobacterrium tumefaciens-mediated transformation of Sweet potato (Ipomoea
batatas (L.) Lam) from stem explants using a two-step kanamycin-hygromycin
selection method‖, In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant, 40, pp. 359–365
39. Hamid Rashid, Asma Afzal, M. Haroon Khan, Zubeda Chaudhry and Salman A. Malik
(2010), ―Effect of bacterial culture density and acetosyringone concentration on
Agrobacterium-mediate transformation in wheat‖ Pak. J. Bot., 42(6), pp. 4183-4189.
40. Hai-Kun Liu. Chao Yang. Zhi-Ming Wei (2004), ―Efficient Agrobacterium tumefaciens -
mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system‖,
Planta, 219, pp.1042–1049.
41. Höfte H., and H. R. Whiteley (1989), ―Insecticidal crystal proteins of Bacillus
thuringiensis‖, Microbiological Reviews, 53, pp. 242-255.
42. Jansson, R. K. Raman,K.V. (1991), Sweetpotato pest management, West view press.
India.
43. Jefferson R.A. (1987) ―Gus fusions: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene
fusion marker in higher plants‖. EMBO J, 16, pp. 2901-2907.
44. Jin Xu, Yu Zhen Wang, Heng Xia Yin and Xiao Jing Liu (2009), ―Efficient
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Malus zumi (Matsumura) Rehd
using leaf explant regeneration system‖, Electronic Journal of Biotechnology, 12(1),
pp. 3-7.
45. Jinjuan Shen, Pingzhong Cai, Feng Qing, Zhiyong Zhang, and Gũiue Wang (2012), ―A
primary study of high performance transgenic rice through maize UBI-1 promoter
fusing selective maker gene‖, Pak. J. Bot, 44(2), pp. 501-506.
46. Juan J. Estruch. Gregory W. Warren, Martha A. Mullins, Gordon J. Nye, Joyce A. Craig
and Michael G. Koziel. (1996), ―Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative
insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects‖,
Proc. Natl. Acad. Sci, 93, pp. 5389-5394.

47. Li J., J. Carroll, and D. J. Ellar (1991), ―Crystal structure of insecticidal δ-endotoxin from
Bacillus thuringiensis at 2.5A
0
resolution‖, Nature, 353, pp. 81-821.
48. Li J., P. A. Koni, and D. J. Ellar (1996), ―Structure of the mosquitocidal δ-endotoxin cyt
B from Bacillus thuringiensis.”, Journal of Moleculer Biology, 257, pp. 129-152.
49. Liu J. R. and Cantliffe D. J. (1984), ―Somatic embryogenic and plant regeneration in
tissue cultures of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)‖, Plant Cell Reports, 3, pp. 112-
115.
50. Loguercio L. L., Barreto M. L., Rocha T. L., Santos C. G. and Paiva E. (2002),
―Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier
screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective
against tropical fall armyworm‖, Jounal of Applied Microbiology, 93, pp. 269-277.
51. Lucckmini K. W. (1994), ―Plant regeneration of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)‖,
Plant Cell Reports, 3, pp.112-115.
52. Luo H. R, Santa Maria M, Benavides J, Zhang D. P, Zhang Y. Z and Ghislain M. (2006),
―Rapid genetic transformation of sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam) via
organogenesis‖, African Journal of Biotechnology, 5(20), pp. 1851-1857.
53. Marfalane R., Jackson G. V (1989), Cylas formicarius, Sweetpotato weevil, Published by
the Pacific Commission, BPDC noumea cedex, new caledonia, pp.1-4.
54. Marceline Egnin, Adalgisa Mora, and Channapatna S. Prakash (1998), ―Factors
enhancing Agrobacterium tumefaciens - Mediated gene transfer in Peanut (Arachish
ypogaea L.)‖, In Vitro Cellular & Developmental Biology. Plant, 34 (4), pp. 310-318.
55. McCormac, A.C., H. Wu, M. Bao, Y. Wang, R. Xu., M.C. Elliott and Chen Dong-Fang
(1998), ―The use of visual marker genes as cell specific reporters of Agrobacterium-
mediated TDNA delivery to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum
vulgare L.)‖, J.Euphytica, 99, pp. 17-25.
56. Mohamed A Ibrahim, Natalya Griko, Matthew Junker, and Lee A Bulla (2010), ―Bacillus
thuringiensis‖, Bioeng Bugs, 1(1), pp. 31–50.
57. Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997), ―Production of diosgenin by hairy root

cultures of Trigonella foenum-graecum L.‖ Plant Cell Reports 16(9), pp. 632-636.
58. Moran R., Garcia R., Lopez A., Zaldua Z., Mena J., Garcia M., Armas R., Somonte D.
and Pimentel E. (1998), "Transgenic sweetpotato plants carrying delta-endotoxin gene
from Bacillus thuringiensis var. tenebrionis". Plant Science 139, pp. 175-184
59. Newel, C.A., Lowe, J.M., Merryweather, A., Rooke, L.M. and Hamilton, W.D.O. (1995),
―Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas Lam.) with Agrobacterium
tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and
snowdrop lectin‖ Plant Science, 107, pp. 215-227.
60. Nina Sevón, Kirsi Marja Oksman Caldentey (2002), ―Agrobacterium rhizogenes -
Mediated transformation: Root cultures as a source alkaloids‖, Planta Med, 68, pp.
859-868.
61. Otani, M., Mii, M., Handa, T., Kamada, A. and Shimada, T (1993), ―Transformation of
sweet potato (Ipomoea batatas (L) Lam) plants by Agrobacterium rhizogenes”, Plant
Science, 94, pp. 151- 159.
62. Pineda CR, Toro PN, Narvaez J, Orozco Cardenas ML, Laignelet A, Cárdenas H (2002),
―Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens of embryogenic cell
suspensions of plantain "dominico Harton" (Musa AAB Simmonds)‖, Informusa, 11,
pp. 9-13.
63. Prakash C. S., Varadarajan U. (1992), Genetic transformation of sweetpotato.
Sweetpotato Technology for the 21
st
century, Tuskegee University, pp. 27-37.
64. Prakash CS, Varadarajan U (1992), ―Genetic transformation of sweetpotato by particle
bombardment‖, Plant Cell Rep, 11, pp. 53-57.
65. R Pratap Chandran and V P Potty (2008), ―Induction of hairy roots through the mediation
of four strains of Agrobacterium rhizogenes on five host plants‖, Indian Journal of
Biotechnology, 7, pp. 122-128.
66. Rolando García González, Danalay Somonte Sánchez, Zurima Zaldúa Guerra, Jesús
Mena Campos, Alina López Quesada, Rolando Morán Valdivia, Ariel D. Arencibia,
Karla Quiroz Bravo and Peter DS. Caligari. (2008), ―Efficient regeneration and

Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of recalcitrant sweet potato
(Ipomoea batatas L.) cultivars‖, AsPac J. Mol. Biol. Biotechnol., 16 (2), pp. 25-33.
67. Selvapandiyan A., Arora N., Rajagopal R., Jalati S. K., Venkatesan T., Singh S. P. and
Raj K. Bhatnagar (2001), "Toxicity analysis of N-terminus-deleted tvegetative
insecticidal protein from Bacillus thuringiensis", Appl. Environ. Microbiol, 57(12), pp.
5855-5858.
68. Sevon N, Drager B, Hiltunen R, Oksman-Caldentey K M (1997), ―Characterization of
transgenic plants derived from hairy roots of Hyoscyamus muticus‖, Plant cell reports,
16 (9), pp. 605-611.
69. Sheng-Jiun Wu & CS (2012), ―Two disulfide mutants in domain I of Bacillus
thuringiensis Cry3Aa δ-endotoxin increase stability with no effect on toxicity‖,
Advances in Biological Chemistry, 2, pp. 123-131.
70. Shoja H.M (2010), Contribution to the study of the Agrobacterium rhizogenes plast
genes, rolB and rolC, and their homologs in Nicotiana tabacum, PhD dissertation,
University of Strasborg.
71. Sikuli. N.N, Demeyer, K (1997), ―Influence of the ion-composition of the medium on
alkaloid production by "hairy roots" of Datura stramonium‖, Plant cell, tissue and
organ culture, 47 (3), pp. 261-267.
72. Simon Deroles, Mary Anne Lila Smith & Carmella Lee. (2002), ―Factors affecting
transformation of cell cultures from three dicotyledonous pigment-producing species
using microprojectile bombardment‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70, pp.
69–76.
73. Sullivan J. N., Asher C. J. and Blamey F.P. (1997), Nutrient disorder of sweetpotato. Australian
Centre for International Agricultural Research, pp. 9-15.
74. Sylvain E., Michel G., Josette C., Christophe B., Ste’phane P. and Vincent S. (2002),
―Correspondence of high levels of beta- endotoxin I and the presence of cry 1B in
Bacillus thuringiensis‖, Applied Environmental Microbiology, pp 4182- 4186.
75. Thomas D.J.I., Morgan J.A.W., Whipps J.M. and Saunders J.R. (2001), ―Plasmid transfer
between Bacillus thuringiensis subsp. israelensis strains in laboratory culture, river
water, and Dipteran larvae‖, Appl. environ. Microbiol., 67, pp. 330–338.

76. Trick HN, Finer JJ (1998), ―Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation
of soybean [Glycine max (L.) Merrill] embryogenic suspension culture tissue.: Plant
Cell Rep, 17, pp. 482–488.
77. Veena V. and Christopher G. T. (2007), ―Agrobacterium rhizogenes: recent developments
and promising applications‖, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 43,
pp. 383-403.
78. Victor A. Doss, K. Anup Kumar, R Jayakumar, and Vaithilingam S. (2002), "Cloning and
expression of vegetative insecticidal protein (vip3V) gene of Bacillus thuringiensis in
Escherichia coli". Protein expression and purification, 26, pp. 82-88.
79. Vijayachandra.K. (1995), Development of Agrobacterium transformation system for rice. Ph.D
thesis Madurai Kamaraj Uni, India, pp. 1-13; 27-30.
80. Vilas P. Sinkar, Frank F. White, and Milton P. Gordon (1987), ―Molecular biology of Ri-
plasmid—A review‖, J. Biosci, 11(1–4), pp. 47–57.
81. Wahlroos T, Susi P, Tylkina L, Malyshenko S, Zvereva S (2003), ―Agrobacterium -
mediated transformation and stable expression of the green flurescence protein in
Brassica rapa‖, Plant Physiol.Biochem, 41, pp.773-778.
82. Walter A. H., Conrad K. B., Philip A. L., (1992), ―Sweetpotato rsearch: Curent status and
future needs―. Sweepotato technology for the 21st century. Tuskeege University, pp. 3-
6
83. Wang J. S. (1998), "Efficient embryogenic callus formation and plant regeneration in
shoot tip cultures of sweetpotato". Mern. Fac. Agr. Kagoshima Univ, 34, pp. 61-64.
84. Warren G. W., Koziel M. G., Mullins M. A., Nye B. C. and Estruct J. J. (1996), Novel
pesticidal proteins and strains, Patent WO 96/10083, World Intellectual Property
Organization.
85. Wongsamuth, R., and P.M. Doran (1997), ―Production of monoclonal antibodies by
tobacco hairy roots‖, Biotechnol Bioeng, 54(5): p. 401-415.
86. Whiteley H. R. and Schnef, H. E. (1986), "The molecular biology of parasporal crystal
body formation in Bacillus thuringiensis". Annual review of Microbiology, 40, pp. 549-
576.
87. Woolfe J.A (1992), Sweetpotato an untapped food resource, Cambridge.

88. Yasutaka Nishiyama, Takashi Yamakawa (2004), ―Effect of medium composition on the
production of anthocyanins by hairy root cultures of Ipomoea batatas‖, Plant
Biotechnology, 21(5), pp. 411–414.
89. Youngjin Park, Mohd Amir F. Abdullah, Milton D. Taylor, Khalidur Rahman, and
Michael J. Adang (2009), ―Enhancement of Bacillus thuringiensis Cry3Aa and Cry3Bb
Toxicities to Coleopteran Larvae by a Toxin-Binding Fragment of an Insect Cadherin‖,
Applied and Environmental Microbiology, 75 (10), pp. 3086–3092.
90. Zimmerman E. C. (1994), Australian Weevils (Coleoptera: Curculionoidea), CSIRO,
Australia.