Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase170008

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***************





Phan Thị Thu Mai





PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH
ENZYME PHYTASE




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội – Năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***************

Phan Thị Thu Mai





PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH
ENZYME PHYTASE


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG


Hà Nội – Năm 2012

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 14
1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 14

1.1.1 Cấu trúc của axit phytic 14
1.1.2 Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate 15
1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic 17
1.1.4 Ảnh hưởng của phytic tới môi trường 21
1.2 PHYTASE 21
1.2.1 Chức năng của phytase 21
1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của phytase 22
1.2.3 Nguồn phytase trong tự nhiên 23
1.2.4 Phân loại phytase 24
1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP) 25
1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys) 26
1.2.4.3 Purple axit phosphatase (PAP) phytases 27
1.2.5 Gen mã hóa phytase 27
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phytase từ vi sinh vật 29
1.2.6.1 Các yêu tố vật lý 29
1.2.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng 30
1.2.7 Điều khiển sinh tổng hợp phytase 31
1.2.8 Các ứng dụng của phytase 33
1.2.8.1 Ứng dụng của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản… 33
1.2.8.2 Ứng dụng của phytase trong công nghiệp thực phẩm 35
1.2.8.3 Ứng dụng của phytase trong cải tạo đất 36
1.2.8.4 Ứng dụng của phytase trong dược phẩm 36
1.2.8.5 Bán tổng hợp peroxydase 37
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE 37
1.3.1 Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt của phytase 37
1.3.2 Nghiên cứu về thay đổi pH hoạt động tối ưu của phytase 38
1.3.3 Nghiên cứu về khả năng bền axit và enzyme protease của phytase 39
1.3.4 Nghiên cứu về tăng hiệu suất của quá trình sản xuất phytase 40
1.3.5 Nghiên cứu về động vật và thực vật chuyển gen phytase 41

1.3.6 Những nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 41
1.4 LÊN MEN XỐP 43
1.4.1 Khái niệm về lên men xốp 43
1.4.2 Những ưu điểm và nhược điểm của lên men xốp 44
1.4.3 Các ứng dụng của lên men xốp 46
1.4.3.1 Sản xuất các axit hữu cơ 47
1.4.3.2 Sản xuất các hợp chất tạo hương và tạo vị. 47
1.4.3.3 Sản xuất enzyme 47
1.4.3.4 Sản xuất Fructooligosaccharides 47
1.4.3.5 Sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học 48
1.4.3.6 Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 48
1.4.3.7 Sản xuất cồn sinh học 48
1.5 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS 48
1.6 THU HỒI ENZYME 53
1.6.1 Chiết rút enzyme 53
1.6.2 Cô đặc enzyme – tủa enzyme 53
1.6.2.1 Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate 53
1.6.2.2 Tủa bằng dung môi hữu cơ 54
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 56
2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
NGHIÊN CỨU 56
2.1.1 Chủng vi sinh vật 56
2.1.2 Môi trường nghiên cứu 56
2.1.2.1 Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt và môi trường nhân giống 56
2.1.2.2 Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening
media)…………… 56
2.1.2.3 Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase 56
2.1.2.4 Môi trường nuôi xốp 57
2.1.3 Thiết bị 58
2.1.4 Hóa chất 58

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 59
2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase 59
2.2.2 Tuyển chọn chủng 61
2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 61
2.2.4 Phương pháp phân loại 61
2.2.4.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 61
2.2.4.2 Quan sát hình thái 65
2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh phytase
của chủng vi sinh vật nghiên cứu 66
2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh
trưởng ở chủng nghiên cứu 66
2.2.5.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng
tổng hợp phytase ở chủng nghiên cứu 67
2.2.6 Thu hồi enzyme 68
2.2.6.1 Chiết xuất enzyme 68
2.2.6.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 68
2.2.7 Nghiên cứu enzyme phytase 69
2.2.7.1 Gen mã hóa phytase 69
2.2.7.2 Các đặc tính của enzyme 70
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72
3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 72
3.1.1 Lựa chọn chủng ưa nhiệt 72
3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao 72
3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt 73
3.2 PHÂN LOẠI 74
3.2.1 Xác định trình tự ADNr 16S 74
3.2.2 Đặc điểm hình thái 77
3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 78
3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 78
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 81

3.4 THU HỒI ENZYME 88
3.4.1 Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau 88
3.4.2 Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau 89
3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901 90
3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần
gũi……… 90
3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô……… 90
DANH MỤC TÀI LIÊU THAM KHẢO 93




















DANH MỤC BẢNG, HÌNH
Tên bảng

Trang
Bảng 1. Hàm lượng phosphor và phytate ở một số loại thức ăn gia cầm phổ biến
6
Bảng 2. Các loại môi trường dùng cho lên men xốp……………………………….
47
Bảng 3. Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại 5 gen gyrA, rpoB, purH,
polC, groEL…………………………………………………………………………
53
Bảng 4. Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S…………………
54
Bảng 5. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên men xốp và lên
men dịch thể
63
Bảng 6. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60
o
C…………………………
64

Tên hình
Trang
Hình 1. Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và Anderson,
1914 (B)………………………………………………………………………………….
5
Hình 2. Sự tương tác của các ion kim loại với IP
6
………………………………………
8
Hình 3. Sự liên kết của IP
6
với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)…….

10
Hình 4. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate……………………………….
12
Hình 5. Cấu trúc không gian của phyA từ A. niger NRRL 3135………………………
16
Hình 6. Mô hình cấu trúc phytase β-propeller…………………………………………
17
Hình 7. Lên men xốp trong các túi nilon………………………………………………
34
Hình 8. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc………………………………………….
50
Hình 9. Sinh trưởng và vòng phân giải phytase của chủng SP1901 (trái) và D15 (phải)
trên PSM……………………………………………………………………… ………
62
Hình 10. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự AND r16S……………………………………….
65
Hình 11. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài thuộc nhóm
Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S
rRNA…………………………………………………………………………………….
66
Hình 12. Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901………………
67
Hình 13. Môi trường nhân giống thích hợp chủng SP1901……………………………
68
Hình 14. pH thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………………………….
69
Hình 15. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901……………………………
69
Hình 16. Thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………………

70
Hình 17. Chế độ thông khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………
70
Hình 18. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901………………………
71
Hình 19. Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901………………………
72
Hình 20. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống cho lên men xốp của chủng SP1901…………
72
Hình 21. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………
74
Hình 22. Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng
âm: không bổ sung nguồn các bon)……………………………………………………
75
Hình 23. Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng âm:
không bổ sung nguồn nitơ)………………………………………………………………
75
Hình 24. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………
76
Hình 25. Ảnh hưởng của hàm lượng Ca
2+
đến khả năng sinh tổng hợp phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………
77
Hình 26. Chiết xuất enzyme bằng các dung môi khác nhau…………………………….
78
Hình 27. Tủa enzyme bằng cồn và aceton……………………………………………….
80

Hình 28. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen phytase……………………………………
81
Hình 29. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901……………
82
Hình 30. pH hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901…………………………
84
Hình 31. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901…………………….
84
Hình 32. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của phytase chủng SP1901…
85
Hình 33. Ảnh hưởng của Ca
2+
đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở
60
o
C (trái), xử lý ở 70
o
C (phải)…………………………………………………
86
Hình 34. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất được sấy khô ở 50
o
C trong 24h
87
Hình 35. Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901…
88
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
ANFs Anti-nutritional factors
BPP ß-propeller phytase
DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene diamine tetracetic acid
GRAS Generally regarded as safe
GIT Gastro intestinal tract- ống dạ dày ruột
HAP Histidine acid phosphatase phytase
IP1, IP2, IP3,IP4,IP5 Inositol mono-, bis-, tris-, tetrakis-, pentakis-phosphate
IP
6
Phytic acid/ myo-inositol hexakisphosphate
IUB International Union of Biochemistry
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
NCBI National Center for Biomedical Informatics
PAP Purple acid phosphatase phytase
PDB Protein database bank
Pi Phosphate vô cơ
Tm Nhiệt độ biến tính
ppm Một phần triệu







MỞ ĐẦU
Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của
sinh vật, phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong
các cơ thể sống. Ở các cơ thể sống, phospho vô cơ dưới dạng phốtphat PO
4
3-
tham

gia vào cấu trúc các đại phân tử sinh học như ADN và ARN (hình thành liên kết
phosphoeste giữa gốc 3’OH và 5’phosphate của 2 nu kế tiếp, tham gia cấu thành
“đồng tiền năng lượng” trong các cơ thể sống ATP (adenosin triphosphate), là thành
phần chủ yếu trong màng tế bào (phospholipid), muối canxi phốtphat làm cứng
xương động vật…. Do độ hoạt động hóa học cao, không bao giờ người ta tìm thấy
nó ở dạng đơn chất trong tự nhiên và vì thế các cơ thể sống không thể hấp thụ P ở
dạng các hợp chất này.
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của
phospho trong tự nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu
và hạt lấy dầu (Axit phytic chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây
là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người và động vật. Axit phytic có khả năng tạo
phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các muối (phytate: muối của axit phytic
với Na
+
, phytin: muối của axit phytic với Ca
2+
, Mg
2+
) và các hợp chất khác như axit
amin, protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản sự hấp thu các chất này
của các cơ thể sống. Vì thế axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh dưỡng (an
anti-nutrient compound) trong thức ăn và thực phẩm.
Phytase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến
thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối
của axit phytic (phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6-
phosphate và các cấp độ thấp hơn của phản ứng phosphoyl hóa. Việc sử dụng
phytase không chỉ làm tăng khả năng hấp thu phospho vô cơ mà còn tăng khả năng
hấp thu các nguyên tố khoáng và khả năng tiêu hóa các hợp chất khác. Do đó dùng
phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần thức ăn là rất cần thiết.
Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ

vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động
vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong
đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta
thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ
thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường. Tuy nhiên, bổ
sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn
gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm tăng
chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là
thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có
trong thức ăn, giải phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh
dưỡng và khoáng khác. Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn
được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol
phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất
trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là mối quan tâm
của nhiều nhà khoa học.
Với tầm quan trọng trong ứng dụng cho ngành chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn đã đưa phytase vào danh mục thức ăn chăn nuôi được nhập
khẩu theo Quyết định số 88/2008/QĐ-BNN ngày 22/8/2008. Chính vì vậy, những
nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang
được nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm. Chúng ta đã biết đến phytase từ
Aspergillus niger với rất nhiều ưu điểm như: bền nhiệt, khả năng hoạt động ở pH
axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase trong hệ tiêu hóa
của vật nuôi. Tuy nhiên việc tìm kiếm các loài vi sinh vật khác có khả năng sinh
enzyme phytase cũng là một việc rất cần thiết.
Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn
về địa hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật,
cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại,
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh
enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp chế biến

thức ăn chăn nuôi và thực phẩm.
Những đóng góp của đề tài
- Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC,
groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi Bacillus.
- Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus
amyloliquefaciens.
- Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử dụng trực
tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động
vật.










CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
Các thuật ngữ axit phytic, phytate và phytin lần lượt để chỉ axit phytic tự do,
muối của axit phytic với Na
+
và muối của axit phytic với Ca
2+
, Mg
2+
. Trong nhiều
tài liệu, thuật ngữ axit phytic và phytate, phytin được sử dụng lẫn nhau và phần lớn

phospho tổng số trong các loại hạt tồn tại dưới dạng phytate, đây là dạng dự trữ
chính của phospho trong ngũ cốc, hạt đậu và các mô thực vật khác [111].
1.1.1 Cấu trúc của axit phytic
Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ,
không phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật [43, 44]. Sau Hartig,
cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng “globoid” (dạng cầu)
và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm
1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-phosphoic và sau đó năm 1968 được
duyệt lại là ‘myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis (dihydrogen) phosphate (IP
6
) bởi
IUPAC-IUB [44, 110].
Cấu trúc của phytic axit là đối tượng tranh cãi của ngành hóa học trong nhiều
năm ở thế kỷ 20 và cuối cùng 2 cấu trúc do Neuberg và Anderson đề xuất được
chấp thuận nhiều nhất [87, 88]. Nhiều ý kiến khác nhau cho rằng chúng là dạng
đồng hình và có hay không 3 phân tử nước gắn kết trong cấu trúc này, thì sau đó với
những phân tích về nguyên tử, chuẩn độ natri phytate với các ion kim loại, tinh thể
học tia X và cộng hưởng từ hạt nhân đã dẫn đến kết luận rằng cấu trúc do Anderson
đề xuất là dạng chiếm ưu thế hơn được tìm thấy trong các loài thực vật [43].

(A) (B)
Hình 1. Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và
Anderson, 1914 (B) [4, 87, 88]
1.1.2 Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate
Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại thực vật khác nhau, chúng chiếm
đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa dầu và hạnh nhân. Hầu
hết các loại thức ăn có nguồn gốc thực vật chứa 50-80% hàm lượng phospho tổng
số dưới dạng phytate. Ở thực vật, phytate được tìm thấy đầu tiên ở các loại hạt tuy
nhiên vị trí của chúng trong hạt lại khác nhau ở các loài thực vật khác nhau, ở ngô
tới 90% phytate tập trung ở phần mầm của hạt, trong khi đó ở lúa mỳ và gạo,
phytate tập trung chủ yếu ở lớp vỏ aleurone của hạt và cám bên ngoài [43, 44, 91,
92, 109]. Phytate trong các hạt chứa dầu và hạt các cây họ đậu thường liên kết với
các protein và tập trung chủ yếu trong các thể cầu (globoid), các thể vùi phân bố
trong toàn bộ hạt, ngược lại phytate ở hạt đậu nành lại có mặt ở những vị trí không
đặc trưng [109]. Ngoài ra phytate có thể được tìm thấy ở rễ, thân, quả, lá…và hạt
phấn của một số loài thực vật [10, 42, 51, 108, 122]. Trong số các loài thực vật
được sử dụng làm thức ăn gia súc, cây vừng, bí ngô, lanh có hàm lượng IP
6
cao nhất
tính theo khối lượng khô, có thể lên đến 3,7-4,7% [66]. Các loại thức ăn gia súc
khác IP
6
chiếm 1-3% trọng lượng khô [18].




Bảng 1. Hàm lượng phospho và phytate ở 1 số loại thức ăn gia cầm phổ biến
(Tyagi và cộng sự, 1998)

Thành phần
P tổng số (%)
P dạng phytate (%)
Ngũ cốc
Ngô
0,39
0,25
Gạo
0,15
0,09
Lúa mỳ
0,44
0,27
Lúa miến
0,3
0,22
Đại mạch
0,33
0,2
Bajra
0,31
0,23
Hạt chứa dầu
Lạc
0,6
0,46
Đỗ tương
0,88
0,56
Hạt bông

0,93
0,786
Hạt hướng dương
0,9
0,45

Phân tử IP
6
có chứa 28,2% phospho, trong đó thường tồn tại dưới các dạng
muối khác nhau như muối của magie trong gạo, lúa mỳ, đậu tằm và hạt vừng, muối
Ca-Mn-K trong hạt đậu nành [5, 67, 92, 93, 103, 134, 135]. Phytate được tích lũy
trong hạt trong suốt quá trình chín và trưởng thành, cùng với các hợp chất khác như
tinh bột, protein và lipid [46, 94, 105]. Năm 1980, Cosgrove và Irving đã đưa ra
những vai trò của phytate trong các loại hạt là: (i) là nguồn dự trữ phospho, (ii) là
nguồn dự trữ năng lượng, (iii) là chất cạnh tranh với adenosine triphosphate trong
suốt quá trình sinh tổng hợp phytin trong thời gian trưởng thành của hạt khi quá
trình trao đổi chất của hạt bị ức chế và trạng thái tiềm sinh, (iv) như là một chất bất
hoạt các ion hóa trị II cần cho sự điều khiển các quá trình của tế bào và được giải
phóng trong suốt quá trình nảy mầm dựa trên hoạt động của enzyme phytase sẵn có
trong thực vật, (v) là chất điều chỉnh hàm lượng Pi sẵn có trong hạt [22]. Ngoài ra,
axit phytic còn đóng vai trò là chất kháng nấm trên các cánh đồng, ngăn ngừa sự sản
sinh aflatoxyn ở các hạt đậu nành nhờ sự gắn kết với Zn
2+
[39].
IP
6
có thể được tìm thấy trong nhân hồng cầu ở các loài chim, cá nước ngọt và
rùa, cũng như được tìm thấy trong các loại đất hữu cơ [17, 27]. Ngoài ra, các phân
tử dưới IP
6

trong quá trình phosphoyl hóa như IP
5
, IP
4
, IP
3
, IP
2
và cả IP
6
cũng tham
gia vào quá trình truyền tín hiệu tế bào và hệ thống vận chuyển phosphate có mặt ở
hầu hết các mô động và thực vật [79]. Ở thực vật quá trình tổng hợp IP
6
diễn ra
thường xuyên tuy nhiên đã có những bằng chứng chứng minh rằng ở người đôi khi
có sự tổng hợp IP
6
từ D-glucose nhờ hoạt động của enzyme phosphoylase đối với
inositol-phosphate từ sự đóng vòng của glucose-6- phosphate. Một số loại mô của
động vật có vú như tinh hoàn, tuyến vú, não, gan, thận có thể tổng hợp 4g IP
6
mỗi
ngày [41, 112].
1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic
IP
6
là một cấu trúc tích điện âm ở dải pH rộng nên dễ dàng kết hợp với các ion
tích điện dương như các ion kim loại, các hợp chất tích điện âm hình thành các phức
khó tan làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất này trong ruột non. Do đó

phytate được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound)
[138]. Trong các điều kiện trung tính hoặc kiềm nhẹ, các ion kim loại thiết yếu như
Ca
2+
, Zn
2+
, Fe
2+
có mặt trong thức ăn có thể liên kết với axit phytic và hình thành
nên các phức IP
6
-kim loại kết tủa xuống. Độ bền vững của các kết tủa này theo thứ
tự: Zn
2+
> Cu
2+
>Co
2+
> Mn
2+
> Ca
2+
, trong khi đó ở pH 7,4 thứ tự này có thể là là:
Cu
2+
> Zn
2+
> Ni
2+
> Co

2+
> Mn
2+
> Fe
2+
> Ca
2+
[69, 150]. Các ion kim loại có thể
tương tác với các nhóm OH
-
của cùng một nhóm phosphate hoặc các nhóm
phosphate khác nhau trong phân tử IP
6
, thậm chí ion kim loại có thể liên kết với các
nhóm phosphate của các phân tử IP
6
khác nhau. Sự không hòa tan của các phức này
cũng là nguyên nhân chính gây ra giảm khả năng hấp thu các ion kim loại trong các
khẩu phần ăn có chứa hàm lượng axit phytic cao. Ngoài ra, sự có mặt đồng thời của
2 ion kim loại khác nhau làm tăng quá trình kết tủa của các phức IP
6
-kim loại [126].
Sự ảnh hưởng của IP
6
tới khả năng hấp thụ các ion kim loại này còn phụ thuộc vào
các yếu tố khác như cách thức chế biến thức ăn, các loại IP
6
khác nhau, sự có mặt
của các yếu tố khác cũng có tương tác với ion kim loại (yếu tố cạnh tranh với IP
6

)
như cellulose, axit oxalic, tannin, sự có mặt của phytase trong ruột hoặc phytase vi
khuẩn hay quá trình thích nghi trao đổi chất của cá thể với khẩu phần ăn giàu
phytate [138].

Hình 2. Sự tương tác của các ion kim loại với IP
6

Sự hình thành phức giữa IP
6
và canxi gây ra hiện tượng kháng vôi hóa
(anticalcifying) dẫn đến loãng xương (hình thành các vách trống trong xương) ở chó
và người [78, 151]. Tuy nhiên theo các nghiên cứu năm 1951 của Walker và cộng
sự, dưới cùng một điều kiện, hàm lượng axit phytic trong khẩu phần ăn có ảnh
hưởng đến sự hấp thụ Ca
2+
nhưng sự ảnh hưởng này không phải là mãi mãi, con
người có thể thích nghi với các khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao và tự điều
chỉnh sau một thời gian ngắn nên hàm lượng canxi hấp thụ được không có sự khác
biệt giữa chế độ ăn thông thường và chế độ ăn khi thí nghiệm [151].
Một báo cáo cũng đã nêu ra tình trạng suy dinh dưỡng ở quần thể dân cư ở
vùng bắc Ấn Độ, Pakistan, Iran và trong số những người Ả-rập du cư có liên quan
đến loại thức ăn chính làm từ ngũ cốc không lên men là chapatis (1 loại bánh mỳ
không có men) có chứa 1 lượng lớn phytate [113, 154].
Sự thiếu hụt magie liên quan tới khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao cũng
đã được đề cập tới ở gà và chuột [77, 117]. Bên cạnh đó các triệu chứng sự thiếu hụt
kẽm do khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao cũng đã được nghiên cứu ở người,
gà, lợn và chuột [23, 30, 68, 69, 89, 90]. Do các phức IP
6
-Ca-Zn ít hòa tan hơn so

với các phức IP
6
-Zn tương ứng nên sự hình thành của phức IP
6
-Ca-Zn thậm chí còn
kích thích các triệu chứng của sự thiếu hụt kẽm [15,138]. Ngoài ra khi bổ sung natri
phytate vào bánh mỳ trắng hoặc sữa cũng làm giảm sự hấp thụ sắt ở người xuống 15
lần [127]. Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng phytate không có ảnh hưởng tới sự
hấp thu sắt ở động vật mặc dù protein đậu nành (có chứa hàm lượng lớn phytate)
được cho là nguồn thức ăn giàu sắt [131]. Sau này những nghiên cứu của các nhà
khoa học đã tìm ra rằng dạng tồn tại chính của sắt ở trong cám lúa mỳ và đậu nành
là dạng mono, có khả năng sử dụng được trực tiếp cao, tương tự như khẩu phần ăn
có bổ sung sắt vô cơ hoặc ammoni sulfate sắt [82]. Sự bổ sung 1% phytate vào chế
độ ăn có albumin trứng làm giảm đáng kể khả năng hấp thụ đồng và mangan ở
chuột [24].
IP
6
là một cấu trúc tích điện âm nên IP
6
còn có khả năng tương tác trực tiếp
với các nhóm tích điện dương hoặc gián tiếp với các nhóm tích điện âm của các
protein tích điện dương có mặt trong thức ăn thông qua các ion kim loại tích điện
dương như Ca
2+
để hình thành nên các phức IP
6
- protein tích tụ lại và kết tủa xuống,
do đó làm giảm khả năng tiếp xúc với protease, dẫn đến giảm hiệu quả tiêu hóa
protein [14, 18, 58, 111, 130, 138, 146]. Bên cạnh đó, tính tan kém của protein còn
do bị axit phytic bao phủ điện tích dương làm thay đổi điểm đẳng điện của protein

[59, 111]. IP
6
có thể tạo phức với một số protein trong lúa mỳ, cám yến mạch, đậu,
mầm ngô, vỏ đậu nành, bột vừng, đậu nành, lạc cũng như hạt bong [31, 92]. Sự hình
thành phức giữa IP
6
-ion kim loại- protein dưới điều kiện trung tính hoặc kiềm khá
kém bền nhưng có thể dẫn tác động đồng thời gây thiếu hụt khoáng và giảm hiệu
quả tiêu hóa protein. Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu in vivo và nghiên cứu
in vitro ở động vật và người cho kết quả âm tính về tác động của IP
6
với khả năng
tiêu hóa protein, do đó ảnh hưởng của IP
6
đối với khả năng tiêu hóa protein vẫn còn
nhiều tranh cãi.
Ngoài khả năng tương tác với các ion kim loại, protein, IP
6
còn có khả năng
tạo phức trực tiếp (nhờ sự hình thành liên kết hydro) hoặc gián tiếp với tinh bột
(thông qua các phân tử protein) để hình thành nên các phức IP
6
- tinh bột làm giảm
hiệu quả tiêu hóa tinh bột, gây ra sự giảm đường huyết [137]. Ngoài ra sự tạo phức
đồng thời giữa IP
6
và protein, tinh bột có thể làm giảm sự tiêu hóa những chất này
từ khẩu phần ăn [5]. Tuy nhiên, sự tương tác giữa IP
6
và tinh bột vẫn chưa chi tiết

và vẫn cần rất nhiều các nghiên cứu invivo.









(A) (B)
Hình 3. Liên kết của IP
6
với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)
Bằng cách liên kết với các ion kim loại, protein IP
6
gián tiếp làm suy giảm
hoạt tính của một số các enzyme như protease, các enzyme tiêu hóa khác mà cần
các ion kim loại cho sự hoạt động cũng như tính bền vững của chúng. Một số các
metalloenzyme như cacboxypeptidase, leucine aminopeptidase, amylase,
phosphates kiềm và aminopeptidase chứa kẽm hoặc canxi có mặt một lượng nhỏ
trong ruột và cần thiết cho quá trình phân giải thức ăn. Phức IP
6
-Cu có thể làm giảm
tới 95% hoạt tính của cacboxypeptidase A do thay thể Cu
2+
bằng Zn
2+
trong phân tử
enzyme ở pH 7,5 [75, 124, 147]. IP

6
và EDTA có khả năng làm giảm hoạt tính của
α-amylase ở mức độ tương đương nhau [52]. Canxi là yếu tố tham gia vào quá trình
tự xúc tác của trypsinogen thành trypsin và sự bền vững của trypsin. Do đó, khi IP
6

liên kết với Ca
2+
thì sự sản sinh và tính bền vững của trypsin bị ảnh hưởng. Sự suy
giảm của enzyme phosphatase kiềm trong ruột và phytase trong ống dạ dày-ruột của
các động vật dạ dày đơn là do chế độ ăn nhiều canxi trong đó có sự hình thành phức
IP
6
-Ca [71]. Ngoài ra, các enzyme thymidinine kinase cũng bị ức chế mạnh mẽ bởi
sự liên kết IP
6
-Zn trong chế độ ăn chứa hàm lượng phytate cao [102].