Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng cung

Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in
vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng
cung

Phạm Huy Cường

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Đô
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào
lympho nuôi cấy in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và
người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau. Đánh giá tác dụng tăng
cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol. Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để
có thể đánh giá chính xác. Thử tác dụng thuốc ở liều lượng khác nhau hơn. Xây dựng
mô hình thực nghiệm ung thư do hóa chất để thử tác dụng miễn dịch in vitro

Keywords: Sinh học; Sinh học thực nghiệm; Miễn dịch; Cây Trinh nữ hoàng cung

Content
MỞ ĐẦU

Trinh nữ hoàng cung (THNC) là một loại cây thuốc được sử dụng là thuốc cổ truyền ở
nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TNHC (Crinium latifolium (L.) đã
được dùng như loại thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thư,
lao, viêm do vi khuẩn sinh mủ.
Viên nang Crila biệt dược của Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ lá cây Trinh nữ Crila
được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học.
Các phân đoạn đã chứng minh là có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống ung thư
mạnh nhất (gồm các alkaloid và flavonoid) cũng đã được chiết và làm thành viên nén có tên là

Crilin T. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro trên mô hình
bệnh nhân ung thư đã có suy giảm miễn dịch, bằng cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của
bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và thử các nồng độ thuốc khác nhau và
theo dõi đáp ứng miễn dịch chống ung thư bởi các dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα ở mức độ ARN
và protein bằng phương pháp RT-PCR và ELISA một cách tương ứng. Đề tài này nhằm mục
đích:

2
1. Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào lympho nuôi cấy
in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và người bình thường về lâm
sàng với hai liều thuốc khác nhau.
2. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây Trinh nữ hoàng cung
Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) còn được gọi là Náng lá rộng, Tỏi lá rộng, Tây nam
văn châu lan, Thập bát học sĩ - Crinum latifolium L., thuộc họ Náng Amaryllidaceae.
TNHC là một loài có thân như củ hành tây to, đường kính 10-15 mm, bẹ lá úp vào
nhau thành một thân giả dài khoảng 10-15 cm, có chiều lá mỏng kéo dài từ 80-100 cm, rộng
3-8 cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá
có một có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm
6-18 hoa, trên một cán dài 30-60 cm. Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ.
Cây TNHC có nhiều nước Đông Nam Á và Nhật bản, gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật
Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào. Ở Việt Nam cây mọc hoang ven suối
trong rừng và cây thường phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nóng khô từ Đà Nẵng đến tận
mũi Cà Mau, đặc biệt là ở một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa - Vũng Tàu.

Hình 1.1. Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

1.1.1. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học của
cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L
 Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2--
epoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2-Epipancrassidine,
1,2--epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3), Latindine, Latisodine, Latisoline
(Latisodine-O--D-glucopyranosyl), (-) Lycorine, (-) Lycorine-1-0--glucoside, Pratorimine,
Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine-1-0--D-glucpside.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine, Cherylline
(S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne (Bulbispermine,
Demethylcrinamine), Hipeastrine, Latifine (S), Powelline, Undulatine.

3
+ Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.): 9-
Octadecenamide
b
, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine,
Crinane-3--ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6-hydroxybuphannidrine,
1,2-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one, Lycorin và
Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan,
kaemperol-3-O--glucopyranoside.
 Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.
+ Cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có 32 chất bay hơi và saponin, acid
hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-3-
4-di-O--D-glucopyranosit.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam

Viên nang Crila ra đời từ cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC của
Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự trong và ngoài nước. Viên nang Crila được sản xuất từ
các alkaloid có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ lá cây TNHC, điều trị u xơ tử cung và
phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Viên nang Crila đã được Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm định lượng hàm lượng alkaloid bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). “Nghiên cứu định tính, định lượng
crinamidin trong dược liệu và viên nang TNHC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao”.
1.2. Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thƣ
1.2.1. Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư
Ung thư là bệnh ác tính được sinh ra từ các tế bào bình thường bị biến đổi. Các tế bào ác
tính phát triển vô hạn định và sẽ giết chết cơ thể chủ. Có nhiều bằng chứng cho thấy sự đáp
ứng miễn dịch chống ung thư như: một số ít ung thư tự thoái triển, có rất nhiều lympho và đại
thực bào thâm nhiễm khối u, thoái lui của di căn sau khi loại bỏ các khối u nguyên phát. Tỷ lệ
mắc bệnh ung thư cao hơn sau ức chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch (AIDS, trẻ sơ sinh,
người già, bệnh nhân ghép tạng). Hệ miễn dịch tham gia bảo vệ cơ thể bằng hai cơ chế.
1.2.2. Suy giảm miễn dịch
Suy giảm miễn dịch (SGMD) hay thiếu hụt miễn dịch cũng như mọi hệ thống,
ngoài sự hoạt động bình thường thì trong những trường hợp nhất định do những nguyên nhân
đã biết hay chưa biết do những tổn thương tiên phát hay thứ phát của một cấu thành nào đó
mà dẫn đến những rối loạn. Cho nên, hệ thống miễn dịch có thể hoạt động một cách quá mức
gây nên tình trạng quá mẫn, hay hoạt động yếu không đạt yêu cầu gọi là thiểu mẫn, thiểu năng
miễn dịch hay suy giảm miễn dịch (SGMD)
1.2.3. Ung thư vòm mũi họng
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là bệnh đứng hàng đầu trong các ung thư khu vực
tai mũi họng - đầu mặt cổ. UTVMH là bệnh mang đặc điểm vùng. Trên thế giới hình thành 3
khu vực địa lý, ở tỷ lệ mắc bệnh hoàn toàn khác nhau.
1.2.4. Nguyên nhân gây UTVMH
- Yếu tố di truyền
- Các yếu tố môi trường: Virus, thức ăn…

4
1.3. Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch
Tình trạng suy giảm miễn dịch có thể gặp ở hầu hết các loại bệnh lý do đó phạm vi chỉ
định dùng thuốc kích thích miễn dịch rất rộng rãi. Vì vậy từ khi phát hiện ra chất kích thích
miễn dịch thì các nghiên cứu về chúng phát triển cả về chiều rộng lẫn chiều sâu.
1.3.1. Vai trò của các cytokin
Một hệ thống phức tạp như hệ thống miễn dịch muốn hoạt động được cần phải có sự
tương tác giữa các tế bào. Để thực hiện được sự tương tác, các tế bào đó phải nhận biết được
và truyền đi các thông tin, với vai trò trung gian của các thụ thể. Các thông tin được mang tới
bởi những protein hay peptid rất nhỏ gọi là cytokin
1.3.2. Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư
1.3.2.1. Interleukin-2 (IL-2)
Năm 1976 một lymphokin gây phân bào giúp cho lympho bào tăng sinh và duy trì
trong các mẫu nuôi cấy lympho T bình thường gọi là IL-2. IL-2 là một polypeptide có 133
acid amin và TLPT khoảng 15kD do tế bào Th1 hoạt hóa sản xuất ra.
1.3.2.2. Yếu tố hoại tử u - Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα)
TNFα được sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào sau đó đi vào máu rồi đến các mô và cơ
quan khác, TNFα còn được tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên (NK), các tế bào u hắc tố
và một vài dòng tế bào ung thư.
1.3.3. Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch
Trên thực tế cũng như lâm sàng levamisole đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng. Đến
nay levamisol vẫn là thuốc kích thích miễn dịch cổ điển mà các nghiên cứu đã làm sáng tỏ
mọi vấn đề về cơ chế tác dụng, công thức hóa học, cấu trúc phân tử. Vì vậy, Levamisol được
sử dụng trong thực nghiệm nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi in vitro của công trình này,
với vai trò là chứng dương.
1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC
Một số alkaloid của TNHC: Crinafolin và crinafolidin đã được Ghosal (1985) thử
nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả tốt.
Phan Thị Phi Phi và cs (2003), sử dụng mô hình chiếu xạ bán cấp để đánh giá khả

năng phục hồi tế bào lympho T, NK cả về số lượng và chức năng tiết 2 cytokin IL-2 và TNFα
của viên Crila cho thấy: Viên Crila kích thích khả năng hồi phục tế bào lympho T, NK về cả
số lượng và chức năng tiết.


Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2012 đến tháng 12/2012.
 Các mẫu máu bệnh nhân được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội.

5
 Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, thu dịch nổi, chiết tách ARN và phân tích được tiến hành tại
Phòng thí nghiệm của Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà nội.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
2.2.1. Bệnh nhân
10 ml máu được lấy từ bệnh nhân UTVMH giai đoạn trước điều trị tia xạ, hóa chất
nằm tại khoa xạ 1 và xạ 3, Bệnh viện K Hà Nội từ tháng 3/2012, tuổi từ 12 đến 78 tuổi.
2.2.2. Người bình thường
10 ml máu được lấy từ người khỏe mạnh về lâm sàng, tuổi từ 20 đến 60 là cán bộ, sinh
viên trường Đại học Y Hà Nội.
2.2.3. Vật liệu nghiên cứu
Thuốc viên nén Crilin T hàm lượng 250 mg/viên, được cung cấp bởi Nguyễn Thị
Ngọc Trâm, Công ty Thiên dược, Bình Dương, Việt nam.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Nuôi cấy tế bào lympho
 Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho
 Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy
 Tổng hợp cADN

 Kỹ thuật RT-PCR
 Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào
lympho


Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kiểm tra chất lƣợng ARN chiết tách đƣợc
Chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR với mồi của gen B2M thì vẫn cho kết quả
dương tính với các băng đậm rõ nét (Hình 3.1A). Như vậy việc xác định sự biểu lộ các gen
IL-2 và TNFα bằng phản ứng RT-PCR có độ nhạy cao là khả quan.
3.2. Phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, IL-2 và TNFα
Các cặp mồi này đều được khuếch đại đơn mồi với các tế bào dòng CTLL-2 (IL-2) và L929
(TNFα), chúng đều được thử điều kiện tối ưu và cho kết quả dương tính với 01 băng duy nhất cho
mỗi gen nghiên cứu và gen nội chuẩn B2M (Hình 3.1 A, B, C).

6

Hình 3.1. RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào dòng
chuẩn
3.3. Phản ứng RT-PCR đa mồi của gen B2M với IL-2/TNFα
Các cặp mồi sẽ được khuếch đại đồng thời và tránh được sự gắn mồi không đặc hiệu
và tạo ra nhiều sản phẩm không mong muốn. Kết quả cho thấy không có băng không đặc hiệu
(Hình 3.2 A và 3.2 B).

Hình 3.2. Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn.
Với kết quả này, PCR đa mồi sẽ được dùng để xác định sự biểu lộ gen IL-2 và TNFα ở
các mẫu nuôi cấy lympho bào của người bình thường và bệnh nhân ung thư vòm.
3.4. Sự biểu lộ IL-2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với
thuốc thử.

7




Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của
IL-2 ở lympho người bình thường nuôi cấy

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân ung
thư vòm mũi họng
Cả bệnh nhân và người thường đều cho kết quả như nhau và điều đặc biệt là Crilin T
cho kết quả kích thích tăng tiết IL-2 cao hơn so với chứng dương và chứng âm. Để đánh giá
sự tiết IL-2 của bệnh nhân so với người thường bằng RT-PCR (Hình 3.3 và Hình 3.4) có khác
nhau hay không thì không phải dễ vì hình ảnh có độ phân dải, đậm nhạt khác nhau. Cần phải
đối chiếu với kết quả ELISA, sẽ bàn luận sau.






3.5. Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử.










8


Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường nuôi
cấy

Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư vòm
mũi họng nuôi cấy
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR đối với biểu lộ mARN TNFα ở lympho bào bệnh
nhân ung thư vòm mũi họng chỉ ra trong Hình 3.6. Các băng của B2M cũng tương đương
nhau, trong khi đó ở hai nồng độ Crilin T đều cho biểu lộ nhiều hơn so với nhóm chứng.
Nếu so sánh sự biểu lộ mARN của TNFα ở bệnh nhân và người thường thì thấy rằng
Crilin T làm tăng biểu lộ TNFα ở cả 02 nhóm lympho bào người bệnh và người bình thường.
Đây là tín hiệu cho thấy rằng thuốc có tác dụng tốt trong việc kích thích miễn dịch. Điều này
sẽ được chứng minh ở mức độ protein.
3.6. So sánh biểu lộ protein của gen IL-2 ở dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định bởi
ELISA

Hình 3.7. So sánh sự biểu lộ IL-2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045)
Trong 9 mẫu nuôi cấy lympho bào của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Hầu hết
Levamisol có tác dụng tăng tiết IL-2, tuy nhiên vẫn chưa cao hơn nhiều so với nhóm chứng
âm (Hình 3.7). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả RT-PCR ở trên. Điều này cho thấy sự

9
biểu lộ ở hai mức độ mARN và protein là đồng biến. Sự khác biệt này có ý nghĩa thông kê

p<0,05.

Hình 3.8. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in vitro
(p= 0,14)

Hình 3.9. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy in vitro tế
bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39)

Hình 3.10. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro
(p=0,23)
Khi so sánh sự biểu lộ IL-2 ở lympho bào bệnh nhân với các nồng độ Crilin T với
levamisol, cho thấy 6/9 mẫu liều thấp và 7/9 (77.7%) mẫu liều cao có sự biểu lộ cao hơn so với
Levamisol (Hình 3.8 và hình 3.9). Với tỷ lệ này, chứng tỏ Crilin T có tác dụng kích thích miễn
dịch cao hơn Levamisol. Khi xem xét các liều thuốc Crilin T khác nhau, liều thấp cho đáp ứng
khá hơn so với liều cao (Hình 3.10). Tuy nhiên, những sự khác biệt này đều không có ý nghĩa
thống kê, do cỡ mẫu còn thấp. Các kết quả này cũng phù hợp với sự biểu lộ mARN phát hiện
bằng RT-PCR.

10
Vì đối tượng nghiên cứu là máu của những bệnh nhân ung thư vòm họng giai đoạn
muộn hay người bình thường đã khác nhau về di truyền học, do đó khả năng đáp ứng của các
tế bào lympho nuôi cấy với các tác nhân sinh học có thể khác nhau, sẽ cho kết quả khác nhau.
Đối với đối tượng người thường, chúng tôi thu được kết quả như sau: Nhóm chứng có biểu lộ
tốt, Levamisol cao hơn chứng âm (Hình 3.11), liều thấp và cao kích thích cao hơn Levamisol
(4/5) (Hình 3.12 và hình 3.13) và liều cao lại cho biểu lộ cao hơn liều thấp (Hình 3.14). Tuy
nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Hình 3.11. So sánh sự biểu lộ Il-2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với
chứng âm ở người thường (p=0,18)

Hình 3.12. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người
thường in vitro (p=0,42)

Hình 3.13. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người
thường in vitro (p=0,30)


11

Hình 3.14. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình
thường in vitro (p = 0,34)

Để xem xét tổng hợp sự biểu lộ của IL2 giữa nhóm người thường và nhóm người
bệnh, chúng tôi thấy sự biểu lộ ở nhóm người bệnh tốt hơn nhóm người thường (Hình 3.15).
Điều này cũng có thể phù hợp với sinh học khi đáp ứng miễn dịch bình thường đã tốt nay kích
thích miễn dịch, khả năng tăng đáp ứng sẽ thấp hơn trong tình trạng hệ miễn dịch đã suy yếu
khi được kích thích sẽ có đáp ứng tốt hơn như ở bệnh nhân ung thư. Nhận xét này cũng đã
được chứng minh bởi nhiều tác giả khác trước đây khi dùng các chất kích thích miễn dịch
khác [4], [5].

Hình 3.15. So sánh nồng độ IL-2 ở tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và người bình
thường in vitro
3.7. So sánh biểu lộ protein của gen TNFα ở dịch nuôi cấy có sử dụng các thuốc thử
Khác với IL-2, TNFα biểu lộ rất cao trong các tế bào nuôi cấy in vitro, dù mới chỉ có
4h sau khi nuôi cấy. Và thuốc Crilin T có tác dụng cao hơn các nhóm chứng rất nhiều. Trong
hai liều sử dụng thì liều cao thấy tốt hơn (Hình 3.16 và hình 3.17). Khi so sánh giữa bệnh
nhân và người thường cũng cho thấy bệnh nhân đáp ứng tốt hơn. Sự biểu lộ cao của TNFα do
có thể có nhiều tế bào tiết ra, không giống như IL-2 là chỉ có tế bào lympho T hoạt hóa bởi
kháng nguyên.

12

Hình 3.16. So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro
(p=0,17)

Hình 3.17. So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình
thường in vitro (p=0,42)
Hình 3.18. So sánh sự
biểu lộ TNFα ở hai mức
độ mARN và Protein ở
tế bào lympho của cùng
một người bình thường
Sự biểu lộ TNFα
ở mức độ mARN không
có sự khác biệt giữa các
nhóm chứng âm và
dương. Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai nồng độ 0,25mg và
0,5mg. Ở mức độ protein cũng cho kết quả tương tự (Hình 3.18A và hình 3.18B). Như vậy,
các kỹ thuật ELISA và RT-PCR đều cho kết quả tốt đối với sự biểu lộ TNFα.
3.8. Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dƣơng
Levamisol.

13
Qua kết quả thu được ở cả hai sự biểu lộ IL-2 và TNFα trong các thực nghiệm trên, ta
thấy Crilin T có tác dụng mạnh hơn Levamisol, đặc biệt là TNFα có sự chế tiết cao và sớm
hơn nhiều so với Levamisol

KẾT LUẬN

Từ kết quả mô hình thực nghiệm nuôi cấy tế bào suy giảm miễn dịch ở bệnh nhân
UTVMH giai đoạn muộn và người bình thường về lâm sàng chúng tôi rút ra những kết luận
sau:
- Sự biểu lộ IL-2 ở mẫu nuôi cấy tế bào lympho khi có mặt Crilin T ở nhóm người ung thư vòm
họng cao hơn nhóm người bình thường, và liều thấp Crilin T cho kết quả tốt hơn.
- TNFα ở mẫu nuôi cấy tế bào lympho nhóm người ung thư vòm họng cao hơn nhóm người bình
thường, và liều cao của Crilin T cho kết quả tốt hơn. Đáp ứng TNFα xảy ra rất sớm, sau 4h nuôi
cấy tế bào lympho in vitro với Crilin T.
- Crilin T có xu hướng đáp ứng tốt hơn so với Levamisol ở cả hai cytokin IL-2 và TNFα
KIẾN NGHỊ
- Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để có thể đánh giá chính xác
- Thử tác dụng thuốc ở liều lượng khác nhau hơn
- Xây dựng mô hình thực nghiệm ung thư do hóa chất để thử tác dụng miễn dịch in vivo

References
Tiếng việt
1. Vũ Triệu An, Jean Claude Homberg, (1997), Miễn dịch học. NXB Y học, 1997.
2. Trần Ngọc Anh, Phan Thu Giang, và Trần Văn Quy (2006), Nghiên cứu định tính,
định lượng crinamidin trong dược liệu và viên nang trinh nữ hoàng cung bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Kiểm nghiệm thuốc, 4(14), tr. 10-14.
3. Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trường và cs (2000), “Tình hình
bệnh ung thư ở Hà nội giai đoạn 1996-1999”. Tạp chí Y học thực hành chuyên đề ung
thư học, Số 431, tr. 4-7.

14
4. Đỗ Hòa Bình (2003), Một số thay đổi về số lượng và chức năng của tế bào lympho và
tần suất biểu lộ Protein LMP1, P53, MDM2 ở bệnh nhân ung thư vòm họng. Luận án
Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
5. Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Phan Thu Anh và cs (1993), “Nghiên cứu tình trạng
suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào ở bệnh nhân ung thư vòm họng trước điều trị”, Tạp
chí Y học Việt Nam, số 9, tr. 1-5.
6. Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Bạch Khánh Hòa và cs (2001), “Sự thay đổi nồng độ
IL2 và IL-10 trong nước nổi nuôi cấy lympho bào máu ngoại vi bệnh nhân UTVH”.
Tuyển tập công trình NCKH của NCS,Tập 5, tr. 2-5.
7. Trần Ngọc Dung (2000), Nghiên cứu các thông số miễn dịch - sinh học giúp tiên
lượng, phát hiện sớm tái phát UTVH và kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát,
Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
8. Nguyễn Nam Hải, Nguyễn Tiến Vững (2006), “Phân lập và xác định cấu trúc của hai
flavonoid từ Crium latifolium L”, Tạp chí Dược học, Số 1, tr. 7-8.
9. Võ Thị Bách Huệ, N.K.Q.C., Ngô Văn Thu, Delome Frederic, Daniel F. Michel
Becchi (1999), “Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L. Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật sắc ký ghép với khối phổ (GC - MS)”,
Tạp chí Dược học.
10. Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa và cs (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất bản y học.
11. Nguyễn Ngọc Lanh, Vũ Triệu An, Phan Thị Phi Phi, Văn Đình Hoa, Phan Thị Thu
Anh, Trần Thị Chính, Dương Ngọc Quý (2003), Miễn dịch học. Xuất bản lần II. Nhà
xuất bản Y học.
12. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà Nội, tr.
511-512.
13. Phan Thị Phi Phi (1997), “Đại cương về Cytokin”, Giáo trình giảng dạy sau đại học.
14. Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phương Thảo, Hoàng Minh Châu,
Trần Văn Sung (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây trinh nữ hoàng cung
(Crinum latifolium) trồng ở Đồng Nai, Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, Số 49 (6A),
tr.355-361.

15
15. Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2009), Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn dịch chống
ung thư của các alkaloid va Flavonoid được chiết xuất từ cây trinh nữ hoàng cung
(crinum latifonium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bổ trợ điều trị ung
thư. Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa
học và công nghệ theo nghị định thư giữa Việt nam và Bungari, Bộ khoa học và công
nghệ.
16. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Trần Công Khánh (2012), “Trinh nữ CRILA-Crinum
latifolium L var. crilae Tram & Khanh, var n.: Một thứ mới của loài Trinh nữ Hoàng
cung-Crinum latofolium L. (Họ náng -Amaryllidaceae) ở Việt nam”, Tạp chí Sinh
học, 34(2), tr. 190-193.
17. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Z.K., V. Bankova, S. Popov, E. Zvetkova, E. Katzarovo, Lê
Văn Hương (2001), “Hoạt tính gây độc tế bào của phân đoạn alkaloid từ cây trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.,Amaryllidaceae)”. Tạp chí Dược học, số 11, tr. 21-
23.
18. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Bảo Lộc (2001), “Khảo sát về thực vật, nuôi trồng và thu hái
cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L)”. Tạp chí Dược học, Số 2, tr. 21-22.
19. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi., Phan Thị Thu Anh và cs (2008), “Tác
dụng phục hồi tổn thương tế bào lympho T và dòng tủy của viên nang Crila Trinh nữ
hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Dược học, Số 5, tr. 12-14.
20. Cao Hữu Vinh (2009), Nghiên cứu nồng độ TNFα ở bệnh nhân nhồi máu não giai
đoạn cấp, Luận văn Y học, tr. 40-60.
Tiếng Anh
21. Chuchawankul, S., N. Khorana, and Y. Poovorawan (2012), “Piperine inhibits
cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells”. Genet Mol Res,
11(1), pp. 617-27.
22. Dong, H., et al. (2010), “Selective effects of Lactobacillus casei Shirota on T cell
activation, natural killer cell activity and cytokine production”, Clin Exp Immunol,
161(2), pp. 378-88.

23. Gan, L., et al. (2003), “A polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum
upregulates cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells” Eur J
Pharmacol, 471(3), pp. 217-22.

16
24. Geng, X., et al.(2012), “Interleukin-2 and autoimmune disease occurrence and
therapy”, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 16(11), pp. 1462-7.
25. Ghosal Sh., S.K.S.a.F.A.W. (1983), “Alkaloids of Crinum latifolium” Phytochemistry,
22, pp. 2305-2309.
26. Ghosal Sh., S.K.S.a.R.S. (1985), “Crinum alkaloids: their chemistry and biology.”
Phytochemistry, 24, pp. 2141-2156.
27. Ghosal Sh., S.K.S.a.A.V.K. (1984), “1,2-beta-Epoxyambelline, an immuno-stimulant
alkaloid from Crinum latifolium”, J. Chem. Research (S), pp. 232-233.
28. Henegariu, O., et al. (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step
protocol”, Biotechniques,23(3), pp. 504-11.
29. Hu, L.F., et al. (1991), Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1
gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma. J Gen Virol, 72 ( Pt 10), pp.
399-409.
30. Jenny, M., et al. (2011), “Crinum latifolium leave extracts suppress immune activation
cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation of prostate tumor
cells”, Sci Pharm, 79(2), pp. 323-35.
31. Kobayashi Sh., T.T., Kihara M., Imakura Y.,Shingu T. and Taira. Z (1984),
“Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum
(Amaryllidaceae)”, Chem. Pharm. Bul, 32, pp. 3015-3022.
32. Kobayashi Sh., T.T.a.T.Z.(1984), “Lati-fine, a biogenetic isomer of cherylline, from
Crinum latifolium L.”, J. Chem. Soc.Chem Commun, pp. 1043-1044.
33. Lai K.N., H.S., et al. (1991), “Soluble interleukin-2 receptors in patiens with
nasopharyngeal carcunima”. Cancer, 67, pp. 2180-2185.
34. Liu, Y., et al. (2009), “Immunostimulatory properties and enhanced TNF- alpha
mediated cellular immunity for tumor therapy by C60(OH)20 nanoparticles”.

Nanotechnology, 20(41), pp. 415-419.
35. Li, W., H. Li, and F. Gu (2012), “CRP and TNF-alpha induce PAPP-A expression in
human peripheral blood mononuclear cells”, Mediators Inflamm, 32, pp. 697-702.
36. Marchetti, G., et al. (2004), “Interleukin-2 immunotherapy exerts a differential effect on
CD4 and CD8 T cell dynamics”, AIDS, 18(2), pp. 211-217.

17
37. Markoulatos, P., N. Siafakas, and M. Moncany (2002), “Multiplex polymerase chain
reaction: a practical approach”, J Clin Lab Anal, 16(1), pp. 47-51.
38. Moran-Utrera, Y., et al.(2012), “Trypanosoma cruzi SSP4 Amastigote Protein Induces
Expression of Immunoregulatory and Immunosuppressive Molecules in Peripheral
Blood Mononuclear Cells”, J Trop Med, 6(2), pp. 829-939.
39. Nguyen Thi Ngoc Tram, et al. (2002), GC-MS of Crinum latifolium L. Alkaloids, Z
Naturforsch C, 57(3-4), pp. 239-242.
40. Nguyen Thi Ngoc Tram, E.Z., E. Nikolova, E. Katzarova, G. Kostov, I. Yanchev, O.
Baicheva (1999), “A novel in vitro and invio T-lymphocyte activating factor in
Crinum latifolium L. aqueous extracts”, Experimental Pathology and Parasitology, 3,
pp. 21-26.
41. Nguyen Thi Ngoc Tram, Z.G.K., Nedyalka V. Handjieva, Vassya S. Bankova and
Simeon S. Popov (2003), “Volatiles from Crinum latifolium”, J. Essent. Oil Res, 15,
pp. 195-197.
42. Nguyen-Van, D., et al. (2011), “Epstein-Barr virus-positive diffuse large B-cell
lymphoma of the elderly expresses EBNA3A with conserved CD8 T-cell epitopes”,
Am J Blood Res, 1(2), pp. 146-59.
43. Mutch – RS, Hutson – PR (1991), “Levamisol in the adjiuvant treatmen of colon
cancer”, Clin - Pharm, 10, pp. 95-109.
44. Roux, K.H. (2009), “Optimization and troubleshooting in PC”, Cold Spring Harb
Protoc, 2009(4), pp. 66.
45. S. Davila-Velazque-JR; Santos - Preciado - JI; Martinez - Cairo – S (1998), “Effect of
levamisol on microbicidal activity and chemotaaxis in polymorphonuclear cells”, Rev

- Alerg - Mex, 45(2), pp. 43-80.
46. Theze, J., P.M. Alzari, and J. Bertoglio (1996), “Interleukin 2 and its receptors: recent
advances and new immunological functions”, Immunol Today, 17(10), pp. 481-487.
47. Vivitskii – VM, Kyia - ES; Dziubak – ST (1991), “Immunomodullating of levamisol
in antibiotic therapy”, Antibiot - Khimioter, 21, pp. 25-28.

18
48. Wang, S., et al.(2011), “Subcellular resolution mapping of endogenous cytokine
secretion by nano-plasmonic-resonator sensor array”. Nano Lett, 11(8), pp. 3431-
3435.
49. Zajac, P., A. Schutz, D. Oertli Ch. Noppen, C. Scheafer, M. Hebere, G. Spagnoli,
W.R. Marti (1991), “Enhancerd generation of cytotoxic T - lymphocytes using
recombinant vaccinia virus expressing human tumor - assocciated antigents ang B7
costimulatory moleccules”. Cancers, 58(20), pp. 4567-4571.
50. Zhang, X., et al.(2009), "Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Crinum by high-
performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass
spectrometry", Rapid Commun Mass Spectrom, 23(18), p. 2903-2919.
51. Zvetkova, E., et al.(2001), “Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia
sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear
cells”, Int Immunopharmacol, 1(12), pp. 2143-50.