Tuyển chọn các chủng vi khuẩn azotobacter cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter
cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật

Trần Thị Linh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Lê Như Kiểu
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. Lựa chọn tổ
hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón. Phân loại và mức độ an toàn
của các chủng vi sinh vật nghiên cứu. Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng
Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm
trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp).

Keywords: Vi sinh vật học; Vi khuẩn Azotobacter; Sản xuất phân bón; Phân bón hữu
cơ

Content
MỞ ĐẦU
Một thực trạng chúng ta đang thấy hiện nay là sự lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo
vệ thực vật đã làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh
hưởng không tốt đến chất lượng nông sản và cũng là nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hóa
đất canh tác. Các sản phẩm hóa học này đã để lại những tồn dư của chúng và đang được tích
lũy trong hệ sinh thái, trở thành mối hiểm họa nghiêm trọng đe dọa sức khỏe của con người
và môi trường sống. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật (HCVSV) là giải pháp mà các nhà
khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang hướng đến.
Đất nước ta có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu thì việc quan tâm đến năng suất và
chất lượng nông sản là mục tiêu hàng đầu vì không những giúp nâng cao đời sống của nông
dân mà còn thúc đẩy sự phát triển nền kinh tế quốc gia. Phân bón HCVSV (hay còn gọi là

phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau,
nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh
vật sống được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định. Phân bón HCVSV góp phần
nâng cao năng suất cây trồng và chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ,
đóng góp quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông, lâm nghiệp bền

2
vững. Vì vậy, nghiên cứu và sử dụng nguồn dinh dưỡng tạo ra từ các hoạt động sống của vi
sinh vật đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm và phát triển.
Bên cạnh các sản phẩm phân HCVSV đơn chủng đã được nghiên cứu và sử dụng hiệu
quả như: Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin, Azotobacterin một số
nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón tổng hợp bao gồm các nhóm cố định nitơ,
phân giải photphat, kích thích sinh trưởng thực vật, đối kháng vi sinh vật gây bệnh (chế phẩm
EM, vi sinh vật tổng hợp) có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật
riêng rẽ.
Nhiều kết quả nghiên cứu về phân bón HCVSV đã khẳng định, hiệu quả của phân
HCVSV phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với vi sinh vật có sẵn trong đất và
khả năng thích ứng với điều kiện môi trường đất của các vi sinh vật sử dụng trong phân bón
[13], [14], [15]. Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng có
nhiều hoạt tính sinh học.
Azotobacter là nhóm có phổ phân bố khá rộng. Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện
ra nhiều đặc tính quý của Azotobacter như khả năng cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng,
đối kháng, sinh polyshacarit v.v. [5], [12].
Để sản xuất phân bón HCVSV tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao,
đa hoạt tính, khả năng tồn tại lớn. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các
chủng vi sinh vật là việc làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi
sinh vật [11]. Đây là đề tài nghiên cứu mà chúng tôi đang hướng tới.
Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn các chủng Azotobacter có hoạt tính sinh học cao (cố định nitơ, kích thích
sinh trưởng và đối kháng bệnh héo xanh) để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh cho cây lạc.

Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác.
- Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón.
- Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu
- Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát
triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp).


3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Azotobacter
1.1.1. Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter.
Họ Azotobacteraceae gồm 2 chi Azotobacter (Beijerinck, 1901) và Azomonas
(Winogradsky, 1938).
Azotobacter được phân lập lần đầu tiên vào năm 1901. Đó là loài Azotobacter
chroococcum, về sau người ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi Azotobacter (beijerinskii,
vinelandii, agllis).
Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không sinh bào tử,
Gram âm. Khi còn non tế bào thường có dạng hình que, kích thước khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5
μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả
năng di động nhờ tiên mao mọc khắp cơ thể (chu mao). Khi già tế bào Azotobacter mất khả
năng di động, kích thước thu nhỏ lại trông giống như hình cầu. Nguyên sinh chất xuất hiện
nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan sát dưới kính hiển vi
ta còn thấy khi già tế bào Azotobacter được bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày. Vỏ nhầy của vi
khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit của axit uronic và chứa khoảng 0,023 %
nitơ. Lượng ADN trong tế bào Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác
(0,70- 0,81%) [4].
Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn cacbon.
Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lượng bor (B) và

molipden (Mo)(Mo cần cho quá trình cố định nitơ).
Khi sống trong điều kiện không có nitơ, Azotobacter sẽ dùng nitơ của không khí để
biến thành nitơ của cơ thể sống. Khi sống trong môi trường đủ thức ăn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ
thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không có. Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu
khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm.
Khi nuôi trong môi trường thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan,
lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không làm
nhuộm màu môi trường. Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có
màu vàng lục, màu hồng.

4
1.1.2. Nguồn dinh dƣỡng
Nguồn cacbon
Cacbon chiếm tỷ lệ trên 50% vật chất khô của vi sinh vật. Cacbon là yếu tố đặc biệt
quan trọng trong cấu trúc tất cả các hợp chất có mặt trong tế bào. Hợp chất cacbon là nguồn
năng lượng quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật. Trong tự nhiên có hai dạng hợp
chất cacbon cơ bản là: Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ. Các loại vi sinh vật khác nhau sử
dụng các nguồn cacbon không giống nhau. Tuỳ theo nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được
cung cấp có thể là chất vô cơ (CO
2
, NaHCO
3
, CaCO
3
…) hoặc hữu cơ
Nguồn nitơ
Nguồn dinh dưỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật.
Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH
3
và NH

4
+
. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ
thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều loại nấm
men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO
3
-
các ion kim loại còn lại: K
+
, Na
+
,
Mg
2+
,… làm kiềm hoá môi trường. Để tránh hiện tượng này người ta sử dụng muối NH
4
NO
3

làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH
4
+
thường bị hấp thụ nhanh rồi
mới hấp thụ đến gốc NO
3
-

Nguồn khoáng
Ngoài các chất hữu cơ, vô cơ, nước v.v… trong tế bào vi sinh vật còn chứa nhiều chất
khoáng. Lượng chất khoáng trong tế bào thường thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn và điều

kiện sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật. Mỗi nguyên tố đều có tác dụng nhất định đối với
sinh trưởng, phát triển của tế bào mà các nguyên tố khác không thể thay thế được
Chất sinh trưởng
Muốn phát triển bình thường vi sinh vật không những đòi hỏi phải được cung cấp đầy
đủ protein, lipit, gluxit, muối khoáng… mà còn cần tới các chất sinh trưởng.
1.1.3. Ảnh hƣởng các nhân tố sinh thái đến sinh trƣởng và phát triển của Azotobacter.
1.2. Sự phân bố của Azotobacter trong đất.
Đất là môi trường thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật. Trong
thành phần sinh vật đất, vi sinh vật chiếm tới 90%. Trong thành phần cacbon hữu cơ của đất,
vi sinh vật chiếm khoảng 2%. Số lượng vi sinh vật trong mỗi gam đất có tới hàng triệu, hàng
tỉ và tới vài chục tỉ tế bào. Vi khuẩn là nhóm chiếm số lượng lớn nhất trong đất (10
6
– 10
10
tế
bào/gam đất) nhưng vì kích thước nhỏ (khoảng 1µm) nên chúng chỉ chiếm không quá 20%
trọng lượng của vi sinh vật trong đất [23], [29].

5
1.3. Khả năng cố định nitơ của Azotobacter
1.3.1. Quá trình cố định nitơ sinh học
Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử là một bí ẩn đầy hấp
dẫn của tự nhiên. Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N
2
thành NH
3
có xúc tác của
enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP
N
2

+ AH
2
+ ATP
nitrogenaza
NH
3
+ A + ADP +P

Năm 1992 các nhà khoa học đã hoàn thiện được cơ chế của quátrình cố định nitơ phân
tử như sau [4]
N = N NH = NH H
2
N-NH
2
NH
3

N
2
+ 8H
+
+ 8e
-
+ 16 Mg.ATP + 16º
nitrogenaza
2NH
3
+ H
2
+16 Mg.ADP + 16P

1.3.2. Vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter
Azotobacter có tác dụng tăng cường thức ăn nitơ cung cấp cho cây trồng. Trung bình
khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lượng, Azotobacter có khả năng đồng hoá được khoảng
10 – 15 mg nitơ phân tử [4].
1.4. Khả năng kích thích sinh trƣởng của Azotobacter.
1.4.1. Chất kích thích sinh trƣởng ở thực vật.
Các chất kích thích sinh trưởng của thực vật là những chất ở nồng độ sinh lí có tác
dụng kích thích quá trình sinh trưởng của cây. Các chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm
có các nhóm chất: auxin, gibberellin, cytokinin.
1.4.2. Vi khuẩn sinh AIA: Azotobacter
AIA là một hợp chất hóa học có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật. Để điều chế
ra AIA có nhiều con đường, trong đó chúng ta có thể sử dụng các vi sinh vật tổng hợp AIA.
Đặc điểm nổi bật của con đường này, rẻ tiền nhưng vẫn cho hiệu quả khá cao.
1.5. Tính kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum.
1.5.1. Vi khuẩn R.solanacearum
Là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên 200 loài cây cỏ. Halted đã nghiên cứu bệnh
này vào năm 1982, đến năm 1986 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, định tên R.solanacearum. Ở
Việt Nam bệnh do vi khuẩn R.solanacearum còn được gọi là bệnh héo xanh, héo rũ. Những

6
năm sau đó, bệnh héo xanh được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu và nghiên cứu một
cách toàn diện [26], [25], [8].
1.5.2. Tính kháng R.solanacearum của Azotobacter
Thực tế cho thấy chỉ cần sử dụng thuốc hoá học, con người có thể kiểm soát được hầu
hết sâu, bệnh hại cây trồng. Biện pháp này giữ vị trí khá quan trọng trong phòng trừ dịch hại
cây trồng. Vì vậy, việc phòng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hoá học ở nhiều nước đã bị lạm
dụng, có khi còn khá tuỳ tiện. Dẫn tới sâu bệnh hại có chiều hướng gia tăng bởi vì chúng đã
quen dần với thuốc hoá học, bên cạnh đó năng suất cây trồng đã không thể tăng lên được nữa
mà bị chững lại [31].

1.6. Chế phẩm phân bón chứa Azotobacter và hiệu quả trong trồng trọt trong những
nghiên cứu ban đầu.
Hoạt động của vi sinh vật có ích giúp đẩy nhanh quá trình khoáng hóa các hợp chất hữu
cơ trong đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, phù hợp với mọi loại đất. Đặc biệt là làm tăng độ
mùn, cung cấp các chất dinh dưỡng và giúp cải tạo đất xám, đất xám bạc màu, đất phèn. Khắc
phục hiện tượng chai đất do sử dụng phân bón hóa học lâu ngày, giúp cho đất tơi xốp màu mỡ
trở lại. Bảo vệ đất chống rửa trôi xói mòn. Cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết giúp cho
cây tăng trưởng, phát triển khỏe mạnh, có khả năng chống chịu tốt với sâu bệnh, nâng cao
năng suất cây trồng. Cung cấp các hệ vi sinh vật có ích, khả năng thích ứng cao, cải tạo đất
đồng thời có thể kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật gây hại từ đó làm giảm mầm mống
sâu bệnh (nấm, mốc ). Bên cạnh đó một số chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hoạt chất có
tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển nhanh, tốt, hạn chế sâu bệnh. Giúp bộ rễ
phát triển nhanh, sâu rộng, chắc khỏe, nâng cao năng suất, sản lượng cho cây trồng.
1.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nƣớc và ngoài
nƣớc.
Ở trong nước
Chiến lược an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng là sử dụng cân đối phân bón hoá
học và phân bón sinh học cho cây trồng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện đất đai,
khí hậu, trong đó phân bón sinh học có vai trò vô cùng quan trọng
Trên thế giới
Ðến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất chế phẩm vi sinh vật theo nhiều hướng,
nhiều dạng khác nhau. Phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội, khoa học công nghệ

7
và trình độ dân trí của mỗi nước. Nhưng tất cả đều sản xuất theo hướng tiện cho người sử
dụng và cho hiệu quả kinh tế cao nhất.
Ưu điểm
Tăng năng suất cây trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của hàm lượng
NO
3

.
Cải tạo đất, trả lại độ phì nhiêu cho đất bằng cách làm tăng hàm lượng photpho và kali
dễ tan trong đất canh tác.
Giá thành hạ.
Nhược điểm
Phân bón có hiệu quả chậm.
Điều kiện bảo quản nghiêm ngặt.
Phân bón HCVSV thường chỉ phát huy tác dụng trong những điều kiện đất đai và khí
hậu thích hợp.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu đất và vi sinh vật.
Các chủng Azotobacter phân lập từ những khu vực đất phù sa sông Hồng chuyên canh rau
màu tại một số địa điểm quanh Hà Nội và đất trồng lúa tại Xuân Mai – Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ
Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã sử dụng các dụng cụ và hóa chất của Bộ
môn Vi sinh vật – Viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Lấy mẫu đất
Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995:
2.2.2. Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật
2.2.3. Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật
2.2.4. Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

8
Phương pháp xác định hoạt tinh đối kháng của vi sinh vật với vi khuẩn gây bệnh héo
xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum [10TCN 867:2006]
2.2.5. Xác định tên vi sinh vật
2.2.6. Thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc.
Phương pháp bố trí thí nghiệm ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng diện hẹp theo 10TCN

216-2003. Thời gian theo dõi thí nghiệm là một chu kỳ sinh trưởng phát triển của cây trồng
(từ khi gieo trồng cho đến khi thu hoạch xong). Số liệu nghiên cứu được xử lý Microsoft Exel
2003 và phần mềm IRRISTAT.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu
Thu được 25 mẫu đất từ những khu vực trồng lúa tại Xuân Mai và khu vực trồng rau
màu tại đất phù sa sông Hồng ở Hà Nội. Trước khi phân lập, mẫu lấy về đem hong khô ở
nhiệt độ phòng để tăng tính chọn lọc. Việc hong khô đất là rất cần thiết vì các chủng phân lập
từ đất khô có khả năng tồn tại tốt hơn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập
từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài bảo quản và dễ bị nhầm với Azomonas, một loại vi
khuẩn cũng cố định nitơ, có hình dạng giống Azotobacter nhưng không hình thành bào nang
[5].
Từ 25 mẫu đất này, đã phân lập được 09 chủng Azotobacter với đặc điểm hình thái
khuẩn lạc được tổng hợp tại bảng sau:
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ
Các chủng vi khuẩn Azotobacter được cấy truyền trên môi trường Ashby để xác định
thuần chủng và ổn định hoạt tính sinh học. Sau đó đánh giá lại khả năng cố định nitơ tự do
dựa vào phản ứng màu Nessler. Kết quả ở hình 3.2.
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy cả 09 chủng đều có phản ứng màu với thuốc thử Nessler.
Trong đó, chủng AT10 có phản ứng mạnh nhất với thuốc thử Nessler, sau đó lần lượt là các
chủng AT4, AT7, AT2, AT6, AT9 và cuối cùng là 3 chủng AT1, AT3, AT8.
Để xác định hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter mới phân lập được, 06
chủng AT10, AT4, AT7, AT2, AT6 và AT9 được cấy vào môi trường bán lỏng AT ở 30
0
C
trong 24 giờ, sau đó xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. Kết quả đo hoạt tính
khử axetylen của từng chủng được thể hiện ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1.

9
Như vậy, kết quả thử phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler

hoàn toàn phù hợp với kết quả xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các chủng Azotobacter đều có khả năng cố định nitơ. Khả
năng hình thành etylen đạt từ 1071,6 đến 4345,6 mol/ml/ngày. Trong đó chủng AT10 có khả
năng cố định nitơ cao nhất, đạt 4345,6 mol/ml/ngày. Các chủng này được chọn làm đối
tượng cho các nghiên cứu sau.
3.1.2. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp AIA .
Từ 09 chủng vi khuẩn phân lập được, đã tiếp tục tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả
năng sinh tổng hợp AIA, dựa vào phản ứng với thuốc thử Salkowski. Kết quả ở hình 3.3.

Kết quả hình 3.3 cho thấy cả 09 chủng đều phản ứng màu với thuốc thử Salkowski. Dễ
dàng nhận thấy, các chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 có phản ứng mạnh với thuốc thử.
Để xác định hoạt tính sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter mới phân lập,
06 chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 được nuôi cấy trong điều kiện kị ánh sáng, trên
máy lắc tốc độ 150 vòng / phút ở 30
o
C trên môi trường nuôi cấy AT có bổ sung trytophan
0,1%. Nuôi cấy và theo dõi lượng AIA sinh ra theo thời gian là: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày. Sau đó
xác định hàm lượng AIA thô sinh ra bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530nm với đồ thị
chuẩn AIA. Kết quả thể hiện tại bảng 3.3 và biểu đồ 3.2.
3.1.3. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Từ các chủng vi khuẩn phân lập được, đã tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng ức
chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh. Kết quả thu được 03 chủng có khả năng ức chế vi khuẩn gây
bệnh héo xanh, đó là : AT2, AT7, AT10.



Bảng 3.5: Hoạt tính sinh học của các chủng Azotobacter lựa chọn
Ký hiệu
chủng
Cố định nitơ (nmol

etylen/ml/ngày)
Sinh AIA
(

gAIA/ml)
Ức chế vi khuẩn gây bệnh héo
xanh lạc (vòng vô khuẩn D-d, mm)
AT2
2148,7
430
28

10
AT4
3281,6
39
-
AT7
2706,2
280
26
AT9
1071,6
410
-
AT10
4345,6
317
+
Ghi chú: (+): Vòng phân giải nhỏ (< 0,1 cm)

(-): Không có hoạt tính
3.2. Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter để sản xuất chế phẩm
Qua các thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học của 09 chủng Azotobacter phân lập
được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn các chủng Azotobacter tối ưu nhất để sản xuất phân bón
HCVSV là: AT2, AT4, AT7, AT9 và AT10.
3.2.1 . Mối quan hệ của các chủng lựa chọn
Đã tiến hành xác định mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn lựa chọn theo phương
pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu.
Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường dịch thể
Ba chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy riêng rẽ và hỗn hợp trên môi trường dịch đặc
hiệu. Sau 48 giờ đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng theo phương pháp đã
nêu ở trên.
Khả năng sinh trưởng và phát triển của tổ hợp chủng lựa chọn trong chất mang
Ba chủng vi khuẩn lựa chọn được cấy theo tỷ lệ 1% vào các túi than bùn đã khử trùng.
Nuôi ở 30
0
C, tiến hành kiểm tra mật độ tế bào các chủng sau 15, 30 và 45 ngày. Kết quả ở
bảng 3.8
ỗn hợp và riêng rẽ trong điều kiện cơ chất vô trùng đều tăng trong 15 ngày đầu. Sau 30
ngày mật độ tế bào của các chủng lựa chọn giảm dần. Tốc độ giảm mật độ tế bào khi nuôi
riêng rẽ nhanh hơn so với khi nuôi hỗn hợp.
3.2.1. Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi cấy ở dạng riêng rẽ và
hỗn hợp trong dịch thể và trong chất mang
Hoạt tính của các chủng được kiểm tra sau 2 ngày nuôi cấy, còn trong cơ chất khử trùng
thì được kiểm tra sau 15 ngày.

11

3.3. Xác định tên các chủng lựa chọn
3.4. Đánh giá tác động của chế phẩm Azotobacter đến khả năng sinh trƣởng, phát triển

và năng suất của cây lạc
3.4.1. Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc ở điều Hình 3.5:
Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng
phát triển và ức chế bệnh héo xanh cây lạc
3.4.2. Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc L14 trên đồng
ruộng diện hẹp.
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng
và phát triển của cây lạc ngoài đồng ruộng


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận
1. Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 thuộc loài Azotobacter beijerinckii. Có
hoạt tính cố đinh nitơ thông qua khả năng hình thành etylen đạt từ 1071,6 – 4345,6
µmol/ml/ngày. Có hoạt tính sinh tổng AIA đạt tới 335µg/ml trong 7 ngày.
2. Hai chủng AT2 và AT7 có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh
R.solanacearum, vòng phân giải ức chế đạt 26 – 28mm. Đây là một đặc tính quý, có
tính ứng dụng thực tiễn trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh rất cao.
3. Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 đảm bảo an toàn sinh học, thích hợp với
điều kiện sản xuất chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh vật và điều kiện áp dụng ra đồng
ruộng Việt Nam.
4. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiễm dịch AT2, AT7 và AT10 cho hiệu quả năng
suất cao hơn, có ảnh hưởng tốt đến cây trồng như: chiều cao cây, trọng lượng thân lá
tươi và khô đạt giá trị cao nhất và tăng lần lượt 31,4%; 35,1%; 42,1% so với công
thức đối chứng và các công thức khác.

12
5. Hiệu quả của hỗn hợp dịch nuôi cấy trên đồng ruộng cho kết quả phù hợp với kết quả
thí nghiệm trong nhà lưới. Tất cả các chỉ tiêu đánh giá khi nhiễm hỗn hợp dịch nuôi

cấy đều cho giá trị cao hơn so với đối chứng: Tỉ lệ quả, trọng lượng quả và tỉ lệ nhân
đều tăng: 13%; 1,9%; 3,4% . Tương tự, năng suất lí thuyết, năng suất thực thu được
tăng 24,4%; 24,1%.
Đề xuất
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chưa thể đi sâu nghiên cứu kĩ về tất cả các
vấn đề liên quan đến chế phẩm phân bón vi sinh vật. Đề xuất:
- Mở rộng thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp cho nhiều loại cây trồng khác
nhau ở các thời vụ khác nhau và điều kiện sinh thái khác nhau.
- Tiếp tục thử nghiệm khả năng sử dụng phân vi sinh vật hỗn hợp trong điều kiện có
bổ sung các nền phân khoáng N, P khác nhau để tìm ra được lượng phân khoáng cho phép
thay thế trong khi năng suất và chất lượng cây trồng vẫn đạt mức cao nhất, từ đó hoạch toán
được lợi nhuận kinh tế của việc sử dụng chế phẩm vi sinh vật cố định nitơ, kích thích sinh
trưởng và đối kháng bệnh cho cây trồng.

References
Tài liệu Tiếng Việt
1.
Ngô Thế Dân (1987), Ổn định quy trình sản xuất và sử dụng phân vi khuẩn nốt
sần, Viện Khoa học KTNN Việt Nam.
2.
Bùi Thị Ngọc Dung (1999), Đặc điểm phân bố của vi sinh vật trong các hệ
thống sử dụng đật chính ở 1 số vùng sinh thái nông nghiệp Việt Nam, Luận án
Tiến sĩ Sinh hoc, Trường Đại học Khoa học tự nhiên.
3.
Nguyễn Lân Dũng (1978),Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập
1, 2, 3, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật nông nghiệp.
4.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, Nhà
xuất bản giáo dục.
5.

Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Thị Minh Đức (2001), “Phân lập,
tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật”, Hội thảo
Quốc tế sinh học. 2. 144 – 148.

13
6.
Nguyễn Minh Hưng Và cộng sự (2007), Phân bón vi sinh vật, Nxb nông
nghiệp.
7.
Phạm Xuân Lân (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng của 1 số loại phân hữu cơ vi
sinh tới năng suất, hàm lượng NO3 của rau cải bắp và hóa tính đất trồng rau
tại thị xã Hà Giang, Đại học Nông Lâm.
8.
Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề (1998), Giáo trình bệnh cây công nghiệp, Nxb
nông nghiệp, Hà Nội.
9.
Nguyễn Thị Thanh Phụng (1982), “Nghiên cứu về đặc điểm vi sinh vật đất
trong các hệ sinh thái nông nghiệp Việt Nam”, Tạp chí Khoa học nông nghiệp,
7, tr. 294-300.
10.
Lê Xuân Phương (2009), Vi sinh vật học môi trường, Nhà xuất bản Đà Nẵng.
11.
Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003), “Giáo trình công
nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường”, Nhà
xuất bản nông nghiệp.
12.
Ngô Tự Thành, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Thu Hà
(2003), “Đặc tính sinh học của một số chủng Azotobacter”, Tạp chí Di truyền
học ứng dụng. 4. 31-37.
13.

Phạm Văn Toản (2002), “Đề tài KHCN 02.06: Nghiên cứu áp dụng công
nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất, ứng dụng phân vi sinh vật cố định đạm
và phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững”, Hội nghị tổng kết
các chương trình khoa học và công nghệ cấp Nhà nước giai đoạn 1996-2000,
Hà Nội 12/2002.
14.
Phạm Văn Toản (2003), “Khả năng sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón
chức năng cho một số cây trồng nông nghiệp, công nghiệp và lâm nghiệp”, Hội
nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 127-131.
15.
Phạm Văn Toản, Trương Hợp Tác (2004), Phân bón vi sinh vật trong nông
nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp.

14

16.
Phạm Văn Toản (2005), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón, Nhà
xuất bản nông nghiệp.
17.
Lê Văn Tri (1998), Chất điều hòa sinh trưởng và năng suất cây trồng, Nhà
xuất bản Nông nghiệp.
18.
Hoàng Lương Việt (1978), Đặc tính vi sinh vật học của một số loại đất, tr 5,
tr63-93.
19.
Vũ Văn Vụ (1994), Sinh trưởng và phát triển thực vật, Nhà xuất bản Nông
nghiệp.