Xác định tên một số loài thuộc chi tre (bambusa schreb ) do biến đổi hình thái ở việt nam bằng kỹ thuật phân tích AND

1
nh tên mt s loài thuc chi tre
(Bambusa Schreb.) do bii hình thái 
Vit Nam bng k thut phân tích AND


Nguyn Th Thúy Hng

i hc Khoa hc T nhiên
Luchuyên ngành: Di truyn hc; Mã s: 60 42 70
ng dn:  Phòng
o v: 2012


Abstract: Nghiên cu dng bii hình thái gia các mu trong loài có phi là
ca cùng mt loài tre Bng pht hoc tre Vàng sc ho
Bng pht và tre Vàng sc có ph          
ventricosa) có phi là s bin danh ca loài Hóp nh (B. tuldoides) hay không ?
Gii trình t nucleotide 01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lc lp (trnL-trnF,
psbA-trnH và matK) cho 19 mu ca ba loài tre Bng pht (Bambusa vulgaris Schr.
cv Wamin McClure), tre Vàng sc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cv
sa McClure ) 

 


 Vit Nam.

Keywords: Sinh hc; Di truyn hc; Phân loi thc vt; ADN

Content
MỞ ĐẦU
T  i nay cây tre là hình nh rt quen thuc trong tâm trí c i Vit
Nam. Tre có mt hu khp các nc và gn bó vi cng dân tc Vit
c bit trong tâm thi Vit, cây tre chim v trí sâu sc và lâu b và
ng ci Vit Nam. Tre là loi cây d trng
nhanh, sm khai thác, d ch bin và có nhic tính phù hp vi các m dng
khác nhau.
Tre trúc phân b  nhiu châu lc, tr     ng loài
nhiu nht vi 65 chi và 900 loài. Vit Nam nm  vùng nhii châu Á, vi 25 chi và
216 loài tBambusa Schreb.) có 67 loài [51], có th nói tre  Vit Nam rt

2
ng. Nhng nghiên cu v c bu t c phân
loi nh loi tên loài cho chi tre vng nht gia các tác gi 
áp dng ch yu da trên  . Tuy nhiên i
mu vt ph m phân loc bin mà i vi tre
thì các mu vt ch ng, hu hm v sinh sn
(hoa và qu) vì chu k ra hoa ti vài ch, nng ch mt ln ri cht
vì vy vic phân loi ba, trong mt s ng
hp   i bng hình thái khó thc hin hoc d b nhm ln do mu
không còn nguyên vn hoc b bii trong nhu kin sinh thái khác nhau.
Hai loài tre Bng pht (Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure) và tre Vàng
sc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland.cv Vittata McClure) có chung tên khoa hc là
Bambusa vulgaris [15], bi s gin  nhi
th trng khác nhau nên gia hai loài có mt s u cao thân
khí sinh (13-i vi tre Vàng sc, 4  i vi tre Bng pht) dài lóng thân
(tre Vàng sc dài 20  30 cm, tre Bng pht dài 4  10 cm), tre Bng pht có dng lóng
phng, lóng thng và lóng phng thi phng, ½ thân phía trên thng),

còn tre Vàng sc thì ch có dng lóng thu. Theo các tác gi Nguyn Khc
Khôi (2007), Nguy [15, 51] ng ý các dng này ch là bin th
ca mt loài da trên mt s n thiu tính xác thc vì không có
 i v71), Nguyn Hoàng
 [16, 51] cho rc là Bambusa ventricosa McClure
n Khc Khôi (2007), V0), Dransfield và Widjaja (1995) [15,
4, 34] cho r bin danh ca loài Bambusa tuldoides (tên Vit Nam là
Hóp nh  Vit Nam mà ngay c trên th gii. Vì vy vinh
loi tên loài  chi tre vn còn rt nan gii, cn có s h tr ca k thut phân tích ADN.
i hc phân t (Molecular taxonomy)  
loi ch yu da trên các k thung kt qu khá chính xác,
giúp cho vic phát hin loài mi, gii quyt các mi nghi ng v v trí phân lo
 v ng di truyn, chng loi phát sinh và s tin hóa ca nhing
vt, thc vt và vi sinh vt. So vi ch th hình thái thì ch th  chính xác cao
mà không l thuc vào các yu t   i vi thc vt, hai nhóm gen chính

3
c s dng là vùng gen nhân và h gen lc lp (cpADN) là nhng gen rt bao
th trong tin hóa. Hi d li
gi 16542 trình t nucleotide cho phân loi H ph tre (Bambuso ideae
trình t nucleotide cho chi Bambusa Schreb. trong s này rt nhi  Vit
n d liu có giá tr  chúng ta có th khai thác và ng dng cho nghiên
cn nay,  Vit Nam có khá nhiu công trình công b v hiu qu ca vic gii
trình t mt s vùng gen giúp cho vinh loi tên loài  nhing sinh vt [12, 22,
i vi các loài tre mi ch có Nguyn Minh Tâm (2006) [21]  dng mt
s ch th  nhn dng cho hai loài tre ca Vit Nam. Mc dù các kt qu thu
nhc nhi  ng d
phn làm sáng t tên khoa hc cho mt s loài thuc chi tre (Bambusa Schreb.) do có s
bii hình thái  Vit Nam.
Xut phát t  trên, chúng tôi tin hành nghiên c tài: “Xác định tên một

số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở Việt Nam bằng kỹ
thuật phân tích ADN”. Vi các mc tiêu và ni dung nghiên cu sau:
- Gii trình t nucleotide 01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lc lp (trnL-
trnF, psbA-trnH và matK) cho 19 mu ca ba loài tre Bng pht (Bambusa vulgaris Schr.
cv Wamin McClure), tre Vàng sc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cv Vittata
 Bambusa ventricosa McClure ) có 

 



  Vit
Nam.
- Các dng bii hình thái gia các mu trong loài có phi là ca cùng mt loài
tre Bng pht hoc tre Vàng sc ho không ?
- Tre Bng pht và tre Vàng sc có phi là cùng loài B. vulgaris ?
-    B. ventricosa) có phi là s bin danh ca loài Hóp nh (B.
tuldoides) hay không ?


4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.)
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb.
c phân b rng rãi trên nhiu vùng  c ta. Tre rt quen thuc i vi
i Vic s dng rt nhiu trong tt c i
sp, công nghi p, th công m nghi c
n, tre thuc:
Gii (regnum) : Plantae

Ngành (division) : Magnoliophyta
Lp (classic) : Liliopsida
B (ordo) : Poales
H (familia) : Poaceae
Chi ( genus) : Bambusa Schreb.
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng một số loài tre
1.1.2.1. Tre Bụng phật
Tên khoa hc: Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin McClure
Tên khác: Bambusa wanin Camus
Thân ngm: mc c 20cm.
Thân khí sinh: cao 4  6m
Mo thân: b mo hình thang, mt ngoài ph lông mm, màu hung.
Lá: Phin lá i mác hay ngn giáo, dài 24  26,5cm, rng 2,2  3cm
Phân b: Nhic và th gii.
Giá trp, lóng có hình dc bit, thân có th un thành các hình
dng con vt và to cnh theo ý mun. Vì v c trng làm cnh trong công
n nhà.  th công m ngh.






A
B
C

5
Hình 1.1. Loài tre Bng pht dng lóng thng (Bambusa vulgaris) s hiu K.3005 (A:
n thân; B: lá và C: mo)

Hình 1.2. Loài tre Bng pht dng lóng phng (Bambusa vulgaris) s hiu K.3005 (A:
n thân; B: lá và C: mo)
1.1.2.2. Tre Vàng sọc
Tên khoa hc: Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cvVittata McClure (1961)
Thân ngm: Mc c 30cm.
Thân khí sinh: Cao 8  ng kính 8  12cm.
Mo thân: B mo hình thang, khi non màu lc c dc màu vàng, mt
c dày lông gai màu nâu thm, d rng.
Lá: Phii mác hay ngn giáo, dài 22  30cm, rng 2,3  3,6cm
Phân b: Hu hu trng. Loài nhp ni.
Giá tr: Cây trng làm cnh vì thân nhc dc màu xanh
 các lóng rc nhing trn nhà,
chu cnh. Thân có th un to dáng rt có giá tr, ngoài ra còn làm mt s công dng
trong xây dng nhà ca. u nht là tháng 5, 6.
Tre Vàng sc là mt th trng (cultivar) ca tre M [15]. Do hình thái d bii
ng sng nên tre M o thành nhiu th trng tr
tre Vàng sc, tre Bng ph khoa hc ca hin
gc chng minh vng chc. C 
vn có c 3 dng khác nhau).

A
B
C
A B C

6
Hình 1.3. Loài tre Vàng sc (Bambusa vulgaris) s hin thân; B: lá và
C: mo)
1.1.2.3. Tre Đùi gà
Tên khoa hc: Bambusa ventricosa McClure
Thân ngm: Mc cc.
Thân khí sinh: Khi mc trong t nhiên cao 9  ng kính 4  6,2cm
Mo thân: B mo hình thang. Tai mo phát trin, mép ph lông dài 2mm.
Lá: Phin lá hình trng hay ngn giáo, dài 22  24cm, rng 2,1  2,7cm
Phân b: Mc t nhiên  Qung Ninh (Móng Cái), L Trng  Phú Th
i (Ba Vì). Trên th gii: phân b  vùng nam Trung Quc.
Giá tr: Cây trng làm cp vì có lng trng trong công
n nhà, chu cây Thân còn dùng làm gy chng.
Loài rt him gp trong t   ng trt. Khi trng làm cnh
ng có 2 loi thân trong mt bi cây: Mt loi thân có lóng phi gà  phía
i (1/4 thân), phía trên có lóng thng (3/4 thân) và mt loi thân có lóng thu
trên toàn b chiu cao. T l loi lóng thng ti 70  80% trong mt bi, lo
20  30%. Trong t nhiên cây to cao và hoàn toàn ch có cây mang lóng thu, có th
cùng loài vi Hóp nh (Bambusa tuldoides) [15].

Hình 1.4. ng lóng thng (Bambusa ventricosa) s hin
thân; B: lá và C: mo)
A
B
C

7

Hình 1.5.    ng lóng phng (Bambusa ventricosa) s hiu K.3006 (A:
n thân; B: lá và C: mo)
1.1.3. Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống của ba loài tre nghiên cứu
Tre Bng pht và tre Vàng sc cùng có tên khoa hc là Bambusa vulgaris [15] có
mt s m ging nhau m mc cng kính 4 
c lá 22  30cm x 2,2  t có mt cành chính và mt
s cành nh 1,7cm). Mt s m gn gi
thân (hình dc ). Mt s c m phân bit nhau gia chúng là chiu cao
thân khí sinh: tre Vàng su (8  15m) so vi tre Bng pht (4  6 dài
lóng thân: tre Vàng su ln (20  30cm) so vi tre Bng pht  lóng phng
(4  10cm). Lóng tre Vàng sc thnu; lóng tre Bng pht phình to và ngn (tr
na phía trên thân và nhng thân cây lóng thng hoàn toàn). Ngoài ra, nhng chi tit khác
có th ging và khác nhau không nhic ca b
mo, phii mo, b m v lông, màu sc ).
Theo các tác gi Nguyn Khc Khôi (2007), Nguy  [15, 51] u
ng ý các dng này ch là bin th ca mt loài da trên mt s m hình thái, 
vn thiu tính xác thn có kt qu phân tích ADN
 làm sáng t.
Hóp nh (Bambusa tuldoidesBambusa ventricosa) dng lóng phng
có mt s m hình thái gim mc cng kính thân (3
  dài lóng (28  33cm, tr lóng  sát gc cu 

cc lá (Hóp nh 10  18cm x 1,8  2cm;  24cm x 2,1 
2,7cm). Phân bin ci Hóp nh là có các lóng phía gc thân phng
lên dng phía trên. Nh lá, phin lá,
tai lá, thìa lìa coàn khác nhau nhiu.  nhng thân 
A
B
C

8
gà có c 2 d bi toàn thân có lóng không phng, chi
 Hóp nhc t u lóng thng và có l gi
nh [15]. Theo Nguyn Kh     ), S.Drasfield và E.A.
Widjaja (1995), But & Chia (1995), Ohrnberger (1999) [15, 4, 35, 32, 52] cho rng B.
ventricosa Mc Clure (1938) (  ) là s bin danh ca loài B. tuldoides Munro
(1868) (Hóp nh) bi s ging nhau  nhi  trng
m khác nhau u kin trng trt. Trái li,
mt s tác gi  McClure (1938), Lê Nguyên (1971), Nguy [46,
16, 51] vc lp nhau. Vì không có hoa qu  nh nên có th còn
nghi vn chúng cùng loài hay không. C nh d
phng và thân thi Hóp nh v mt phân loi.
1.1.4. Tình hình phân bố tre trên thế giới và Việt Nam
1.1.4.1. Trên thế giới

Bảng 1. 1. Phân b ca các loài tre trúc trên th gii [54]


N
ƣ
ớc
Số chi

Số
loài
Diện tích
(ha)
(ha)
Nƣớc-Vùng
lãnh thổ
thổ
Số chi
Số loài
Diện tích
(ha)
(ha)
Trung Quc
26
300
2.900.000
Singapore
6
23

Nht Bn
13
237
825.000

8
20
6.000.000


23
125
9.600.000
Papua New Guinea

26

Vit Nam
16
92*
1.942.000
Srilanka
7
14

Myanma
20
90
2.200.000
Hàn Quc
10
13

Indonexia
10
65
50.000


40
140.000
Phillipnines
8
54

Madagaxca
11
40

Malaysia
7
44

Châu M
20
45

Thai Lan
12
41
1.000.000
Ôxtralia
4
4

Ghi chú *: Nay khong hn 200 loài


1.1.4.2. Việt Nam

c nm  trong vùng nhii gió mùa châu Á, Vit Nam có mt h thc
vt rng  Vit Nam có th gp tre t 
cao ngang m c bin  các làng xóm thuc vùng Tây Nam Bo thuc
Vnh H Long  cao g [33, 44]. Theo Biswas (1995)
[31] thì Vit Nam có khong 92 loài tre trúc ca 16 chi (Bng 1.1). Nhng nghiên cu gn
y s ng loài tre trúc phân b  Vit Nam lt nhiu. Theo Lê Vit

9
Lâm (2005) [42] thì Vit Nam có trên 140 loài ca 29 chi và có th còn tìm thy các loài
mt qu nghiên cu v phân loi tre
trúc  Vit Nam kt hp vi mt s nghiên cu, kho sát  th
ca 216 loài thuc 25 chi tre trúc phân b t nhiên  Vit Nam [51].
Bảng 1.2. Hin trng tre trúc Vit Nam tính ti tháng 12/2004 [2]

Các loại rừng tre trúc
Din tích
(ha)
Phân chia theo chức năng (ha)
Rừng đặc
chủng
Rừng
phòng hộ
Rừng sản
xuất
Rng tre trúc t nhiên thun loài
799.130
82.409
343.035
373.686
Rng tre trúc t nhiên hn loài

682.642
113.850
319.266
249.526
Rng tre trúc trng
81.484
285
10.186
71.013
Tng cng
1.563.256
196.544
672.487
694.225

1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật
1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)
1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh
1.2.3. Phƣơng pháp hoá học
1.2.4. Phƣơng pháp phân loại phân tử
Phân loi hc phân t i s dng s khác bit các cu trúc
phân t  c các thông tin v mi quan h tin hóa gia các loài. Các bii phân
t u so vi bii hình thái, vì vt cht di truyn ADN ch cu thành t
4 loi nucleotide (adenine, guanine, thymine và cytosine). Mt khác các bii phân t ít
b ng bu king. Vì v ln nht ca phân loi hc phân
t là có th phân bing v [30, 53].
1.3. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử
Ngoài nƣớc
Tre trúc là loc trng ph bin  Trung Quc, Nht Bn, Vit Nam  có
nhiu công dng phc v i si nên rc quan tâm nghiên cu. Vì

th n nay trong  d liu  khong 16.542 trình t
nucleotide cho phân loi H ph tre (Bambusoideae    khong 607 trình t
nucleotide cho chi Bambusa, trong s này rt nhi Vii vi thc

10
v  c s dng là gen nhân và h gen lc lp (cpADN).
Chng hn, Sun và cng s (2005) [61]  dng trình t nucleotide ADN vùng ITS nhân
 nghiên cu 21 loài tre thuc các chi Bambusa, Dendrocalamopsis, Dendrocalamus,
Guadua, Leleba và Lingnania i quyc mi quan h di truyn ca mt s loài
thuc chi Bambusa (B. subaequalis, B. multiplex, B. emeiensis, B. chungii, B. contracta, B.
hainanensis, B. flexuosa, B. sinospinosa, B. tuldoides, B. surrecta, B. intermedia và B.
valida), Yang và cng s (2008) [67]   dng trình t ADN vùng ITS
và vùng trnL- nghiên cu ngun gc phát sinh chng loi ca 53 loài thuc phân h
Bambusoideae. Kt qu nh mi quan h di truyn ca mt s chi
khác vi chi Bambusa.    Goh và cng s [37]   nh trình t
nucleotide vùng gen nhân GBSSI và bn vùng gen lc lp: rps16-trnQ; trnC-rpoB; trnH-
psbA; trnD-T  nghiên cu mi quan h di truyn gia các loài tre (climbing bamboos) 
i các loài trong chi Bambusa010, Zhou và cng s [68]
 dng trình t ADN c làm rõ mi quan h di truyn các loài thuc phân h
Bambusoideae. ng s [66]  trình t genome lc l
ca hai loài tre là Dendrocalamus latiflorus và Bambusa oldhamii, vng là
139.350bp và 139.365bp.
n d liu có giá tr  chúng ta có th khai thác ng dng cho nghiên
cu chi này ca Vit Nam.
Trong nƣớc
Các nghiên cu v ng di truyn phc v công tác bo tng sinh hc và
tái to nguc th gii quan tâm và phát tring này, các nhà nghiên
cu trong nc tip cn.
Gc ng dng các k thut sinh hc phân t trong nghiên cng di
truyn, phân loi và nhn dng mu sinh vt  Vic nhiu kt qu có

giá tri vi mt s ng, thc vt là nhóm nghiên cu ci [25
dùng gen ty th  nghiên cu ph h nh ADN mt s loài lan Hài,
cây Bình vôi, gà Lôi, cá Bc má, cá Chim trng, cá H, cá Nc sò, cá S
hin ra m tin hóa ca chúng. Hay nhóm tác gi cng Tt Th (2003 -
s d phân tích s tin hóa phân t và phát sinh chng loi ca
mt s loài thú, bò sát quý him ca Vit Nam [26]. Nhóm tác gi  Thu Hin (2009)
[12]   dng vùng gen tRNA-  phân loi cho hai loài g quý thuc chi
Dalbergia.i vi các loài tre, Vit Nam mi ch có tác gi Nguyn Minh

11
Tâm (2006) [21] s dng mt s ch th  nhn dng cho hai loài tre ca Vit
Nam, mc dù các kt qu thu nh cho công tác bo t
dng di truyn
1.4. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật
1.4.1. Cấu trúc hệ gen lục lạp
.











Hình 1.6. H gen lc lp ca hoa Nhài Jasminum nudiflorum [45]
Genome lc lp (cpADN) thc cht là mt phân t ADN vòng, si gen
ng không lp li. Không gic lp ch mã hóa cho các

protein cn thit cho chp và b máy biu hin nhng protein này. Vùng
ADN không mã hóa trên h gen lc lp là rt ít.
- Vùng đệm psbA – trnH
- Gen matK
- Gen trnL
1.4.2. Vùng gen nhân
- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là n ADN có
kh  di chuyc lp ngay trong ni b mt th nhim sc hoc t th nhim sc này
sang th nhim sc khác, còn gi là gen nhy (transposon).
Vi kh ng di chuyn v trí, các gen nhy to nên s t hp li h gen
làm cho h gen ng. Các gen nhy có th c xp xen k n exon, các
n intron ho u chnh ca gen và tt bin gen r

12
dng [5, 18]. Trình t amino acid vùng gen PIF khá bo th trong c ng vt và
thc vt  thit lp mi quan h tin hóa gia các loài [68]. Trong
công b mnht ca Zhou và cng s (2010) [68] v vic so sánh 139 trình t gen
PIF tách t 44 loài tre cho thy PIF - like transposase gen rt ph bing và phong
phú  phân h i bo th  m loài.

13
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 tài ca luc tin hành ti Phòng Phân loi hc thc nghi a
dng ngun gen - Bo tàng Thiên nhiên Vit Nam thuc Vin Khoa hc và Công ngh Vit
Nam t n tháng 8/2012.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu
Bảng 2.1. Ngun gc và ký hiu mu ca 3 loài s dng trong nghiên cu
Tên loài

Tên khoa
học
Ký hiệu
mẫu
Địa điểm thu
mẫu
Một số đặc điểm
hình thái
Tre Bng
pht
Bambusa
vulgaris
Schr.cv
Wamin Mc
Clure

K3005/5

Ch n, Bc
Kn
C u
có lóng ph
Bng pht). B mo 10-
13 cm x 10-13 cm x 8-
9 cm.

K3005/15

Bình
K3005/16

Chí Linh, Hi

K3005/9
Châu Mng,
Phú Th
C thân khí sinh các
u thng. B mo
dài hn 15-20 cm.
K3005/10
Ch n, Bc
Kn
K3005/12
Hà Ni
K3005/13
Ba Vì
C thân khí sinh có
lóng phng và thng.
K3005/14
Ba Vì
Tre Vàng
sc
Bambusa
vulgaris
Schr. ex
Wendland.
cvVittata
McClure
K3011/3
Ba Vì, Hà Ni
Lóng thng và tròn

u, v thân có màu
vàng ti xen ln sc
xanh. B mo 22 cm x
15-17 cm x 8,3 cm.

K3011/4
Ch n, Bc
Kn
K3011/8
Tuyên Quang,
Chiêm Hóa
gà
B.
ventricosa
McClure

K3006/1
Thanh Ba,
Phú Th
Dng thân khí sinh có
lóng ph
. B mo 17-19
cm x 7,8cm x 7,8 cm.
K3006/2
Thanh Ba,
Phú Th
K3006/5
Thanh Ba,
Phú Th
Dng thân có lóng

phng và thng trên
 .
K3006/6
Chân Mng,
Phú Th
K3006/7
Ba Vì, Hà Ni
K3006/11
Qun B, Hà
Giang
Dng thân có lóng
thng toàn bi cây. B
mo dài hn 10-15 cm
K3006/12


14
Cai
K3006/14
ng H,
Thái Nguyên

2.2.2. Hóa chất
Các hóa cht dùng trong nghiên cu bao gm: Các hóa cht tách chit và tinh sch
ADN (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform,KIT tinh
sch genomic (fermentas); b hóa cht PCR (Fermentas), KIT tinh sch sn phm PCR
(QIAGEN Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, M); hóa ch n di agarose (agarose,

2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Các thit b chính s dng trong thí nghim: Máy PCR System 9700

(Applied Biosystem, M), máy ly tâm ca hãng Hitachi (Nht Bn), b n di Nytechnich
(Anh), máy chp c), máy n nhic). Gii mã trình t
trên máy ABI PRISM
®
3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Dụng cụ: Ci, chày s, thìa vô trùng, giy thm vô trùng, ng eppendorf 2ml và
1,5ml, pipetman, u côn các loi
2.2.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.2. Thông tin ca bn cp mi dùng trong nghiên cu
Gen
Ký hiệu
mồi
Trình tự nucleotide (5’– 3’)
Kích
thƣớc
lý
thuyết
(bp)
Nhiệt
độ bắt
cặp
(Tm)
0
C
Ghi chú
trnL-
trnF
trnLF/
trnFR
CGAAATCGGTAGACGCTACG

ATT TGAACTGGTGACACGAG
1000
55
Theo thit
k ca
Taberlet et
al. (1990)
[62]
psbA-
trnH
psbA3'f/
trnH
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
680
55
Mi
psb
theo thit
k ca
Sang et al.
(1997) [57]
Mi trnH
theo thit
k ca Tate
et al.
(2003) [64]

15
matK

matK19F/
matKR
CGTTCTGACCATATTGCACTATG
TACGAGCTAAAGTTCTAGC
1560
50
Thit k
da trên
trình t ca
loài tre có
mã
HM448934
trên ngân
hàng
Genbank
PIF
PIF5/PIF3
GGGGCTTTGGATGGAACACA
ATGGCGAGGTTGAACAACTC
450
52
Theo thit
k ca
Zhou at al.
(2010) [68]
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
ADN tng s c tách chit theo protocol CTAB ca Doyle và Doyle (1987) [34]
có ci tin phù hp vu kin phòng thí nghim.
Bảng 2.3. m ra (Washing buffer)

Bảng 2.4. m tách chit (Extration buffer)
2.3.2. Thiết kế cặp mồi
Cp mi matK c thit k da trên trình t n gen matK ca loài
Bambusa chungii có mã HM448934 trên ngân hàng Genbank. Quá trình thit k c thc
hin trên phn mm ADNstar.
2.3.3. Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR
Mi phn ng PCR có th tích 25µl vi các thành phn: 13 µl H
2
O deion; 2,5 µl
buffer 10X; 1 µl MgCl
2
25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25 µl mi xuôi (10 pmol); 1,25 µl
m c (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl ADN (10-20ng). Phn ng
c thc hin trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, M).
Chu trình nhit ca phn ng PCR gm: 94C trong 3 phút; tip sau là 35 chu k
ni tip nhau vc: 94C trong 50 giây, n 55C trong 55 giây, 72C trong 45
giây; kt thúc phn ng nhân gen  72C trong 10 phút, gi sn phm  4C. Sau khi kt
thúc phn ng, 5µ sn phm PCR mi ng s n di kim tra trên gel agarose 0,9%
cùng vi thang ADN chuc nhum ethidium bromide 15 phút và
i tia UV.
2.3.5. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

16
2.3.6. Giải mã trình tự nucleotide các đoạn ADN
2.3.7. Phân tích số liệu

17
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ các mẫu tre
 tách chit và làm sch ADN tng s t 19 mu lá ca 3 loài tre Bng pht, tre

c vi chng ADN cao (hình 3.1) 














 . Kt qu y ch s OD260/OD280 ca các mu luôn nm trong
khong n 2.








Hình 3.1. Kt qu kim tra ADN tng s i din ca mt s mu tre trên gel agarose
0,9% (Ging 1  6: tre Bng pht; ging 7 - 9: tre Vàng sc; ging 10-)
3.2. Kết quả nhân bản trình tự ADN đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp
3.2.1. Kết quả nhân bản gen PIF
Hình 3.2 là kt qu i din cho mt s mu nghiên cu ca ba loài Bambusa, sn

phc khoc lý thuyt d t
ng ca sn phc th hin khi n di trên gel agarose 0,9% ch có m
duy nh tiêu chu gii mã trình t.









Hình 3.2. Sn phi din ca mt s mu tre phân tích vi cp mi PIF5/PIF3
n di trên gel agarose 0,9%. (ging 1: K3005/5; ging 2: K3005/9; ging 3: K3005/13;
ging 4: K3011/3; ging 5: K3011/4; ging 6: K3011/8; ging 7: K3006/1; ging 8:
K3006/2; ging 9: K3006/6; ging 10: K3006/11; M: marker phân t 1 kb).


500 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
250bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

18
3.2.2. Kết quả nhân bản gen psbA-trnH
Kt qu cho thy sn phm PCR trên gel agarose 0,9 % c
khong 680 bp, kt qu này phù hp vc lý thuyt, sn phm ch cho m
c hiu và không xut hi  tiêu chu tip tc tinh sch và
gii mã trình t nucleotide.

Hình 3.3. Sn phi din ca mt s mu tre phân tích vi cp mi psbtrnH
n di trên gel agarose 0,9%. (ging 1: K3005/5; ging 2: K3005/9; ging 3: K3005/13;
ging 4: K3011/3; ging 5: K3011/4; ging 6: K3011/8; ging 7: K3006/1; ging 8:
K3006/2; ging 9: K3006/6; ging 10: K3006/11; M: marker phân t 1 kb).
3.2.3. Kết quả nhân bản gen matK
Sn phm PCR nhân bn gen matc lý thuyt d
t qu nhân bn gen matc thc hin tt nht  nhi gn mi là 50
0
C.




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
0.75 kb
0.5 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
1.5 kb
1 kb

19

Hình 3.4. Sn phi din ca mt s mu tre phân tích vi cp mi
matK19F/matKR n di trên gel agarose 0,9%. (ging 1: K3005/5; ging 2: K3005/9;
ging 3: K3005/13; ging 4: K3011/3; ging 5: K3011/4; ging 6: K3011/8; ging 7:
K3006/1; ging 8: K3006/2; ging 9: K3006/6; ging 10: K3006/11; M: marker phân t 1
kb).

3.2.4. Kết quả nhân bản gen trnL - trnF
Phn ng nhân bn vùng gen trnL-trnc thc hin  nhi t
0
C.
Kt qu cho th c hic d  tiêu
chun cho nghiên cu gii mã trình t ADN.





Hình 3.5. Sn phi din ca mt s mu tre phân tích vi cp mi trnL/trnn
di trên gel agarose 0,9%. (ging 1: K3005/5; ging 2: K3005/9; ging 3: K3005/13; ging
4: K3011/3; ging 5: K3011/4; ging 6: K3011/8; ging 7: K3006/1; ging 8: K3006/2;
ging 9: K3006/6; ging 10: K3006/11; M: marker phân t 1 kb).
3.3. Kết quả giải trình tự 4 vùng gen nghiên cứu

3.3.1. Kết quả giải trình tự gen PIF
Kt qu nh trình t vùng gen PIF nhân cho  vnh hunh
 mnh và rõ ràng (kt qu không ch ra   thu

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 kb
0.5 kb

20
c ca 19 mu nghiên cc sp xp theo hàng (alignment) bi phn mm Bioedit
(hình 3.6). Sau khi loi b trình t mi và các nucleotide so le  
c trình t nucleotide ca c ba loài nghiên cu có  dài là 444 nucleotide. Kt qu
thng kê  hình 3.6  ra 7 v trí (1, 22, 36, 291, 438, 441 và 444t bin thay th hay
ma ba loài nghiên cu. Ti v trí nucleotide th 1, 36 và 291
khi so sánh gia tre Bng pht vi tre Vàng sc thay bng
ng. So sánh trình t nucleotide gia tre Bng pht và tre Vàng sc vi tre
i v trí nucleotide th c thay b 
ng. Ti v trí 444, 
3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH
Trình t vùng psbA - trnH nh bng cp mi psbtrnc
chiu dài 620 nucleotide i vi hai loài tre Bng ph 615 nucleotide i
vi loài tre Vàng sc. S  khác bit v c gia ba loài nghiên cu là do có
t bin thay th, mt nucleotide xy ra trên vùng gen psbA-trnH. S khác nhau gia
các v c th hin khi so sánh gia tre Vàng sci tre Bng
pht thì ti v trí nucleotide th c thay bi v trí 128,
i 5 nucleotide (Gng

3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng gen matK
Trình t nucleotide ca gen matK sau khi gic là 1539
nucleotide i vi c ba loài tre Bng pht, tre Vàng sc bit, gen matK

là mt gen mã hoá cho protein, nên sau khi gii mã trình t nucleotide vùng gen matK
chúng tôi không tìm thy v t bin hay sai khác nucleotide khi so sánh trình t ca c
ba loài nghiên cu.

3.3.4. Kết quả giải trình tự vùng gen trnL-trnF

Trình t gen trnL-trnc gii mã bng cp mi trnLF/trnc n nucleotide
 dài 935 nucleotide i v 933 nucleotide i vi loài tre Bng
pht và tre Vàng sc. Trình t vùng gen trnL-trn ra 3 v t bin chèn vào hay

21
thay th nucleotide  các v trí 790, 821 và 822 (hình 3.9). So sánh gii
tre Bng pht và tre Vàng sc thì ti v trí nucleotide 790 (Gc thay bng (A). Trong
kh  i v trí nucleotide th         t hin chèn thêm 2
ng.
T kt qu gii mã trình t ca 04 vùng gen cho ba loài nghiên cu thuc chi Bambusa
chúng tôi có nh
 gi  c 444 nucleotide thuc vùng gen nhân (PIF) và 3094 nucleotide
thuc vùng gen lc lp (gen matK, gen psbA-trnH và gen trnL-trnF) cho ba loài thuc chi
Bambusa là tre Bng pht, tre Vàng sng nghiên cu phân t
u tiên cho ba loài thuc chi Bambusa  Vit Nam. Phn ln các v trí nucleotide thu
 nh hu      mnh, nên kt qu c trình t mang tính
chính xác cao, m sai sót thp. Tt c các mc trình t trc tip theo 2
chiu, nên các kt qu nh tin cy cao.
3.4. Mức độ tƣơng đồng nucleotide giữa các mẫu trong một loài tre nghiên cứu
Bảng 3.1. M ng nucleotide gia các mu ca loài tre Vàng sc phân tích vi
bn vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK và PIF

Vùng gen
trnL-trnF

psbA-trnH
matK
PIF
TT
Tên loài
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
K3011/3

100
100

100
100

100
100

100

100
2
K3011/4
0.0

100
0.0

100
0.0

100
0.0

100
3
K3011/8
0.0
0.0

0.0
0.0

0.0
0.0

0.0
0.0

22



Bảng 3.2. M ng nucleotide ca loài tre Bng pht  phân tích vi 2 vùng gen trnL-trnF và psbA-trnH


Vùng gen
trnL-trnF
psbA-trnH
Tre Bng pht (Bambusa vulgaris)
TT
Tên loài
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1

K3005/5


100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100
2
K3005/9
0.0

100
100
100
100
100
100
0.0

100
100
100
100
100
100
3
K3005/10
0.0
0.0

100
100
100
100
100
0.0
0.0

100
100
100
100
100
4
K3005/12
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
5
K3005/13
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100

6
K3005/14
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
7
K3005/15
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0
0.0

100
8
K3005/16
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

Tre Bambusa vulgaris)
TT
Tên loài
1
2
3

4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
K3006/1


100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100

100
100
2
K3006/2
0.0

100
100
100
100
100
100
0.0

100
100
100
100
100
100
3
K3006/5
0.0
0.0

100
100
100
100
100

0.0
0.0

100
100
100
100
100
4
K3006/6
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
5
K3006/7
0.0
0.0

0.0
0.0

100
100
100
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
6
K3006/11
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
7
K3005/12
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
8
K3005/14
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0





23


Bảng 3.3. M ng nucleotide ca loài tre Bng pht và i 2 vùng gen matK và PIF


Vùng gen
matK
PIF
Tre Bng pht (Bambusa vulgaris)
TT
Tên loài
1
2
3
4
5
6

7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
K3005/5


100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100
2

K3005/9
0.0

100
100
100
100
100
100
0.0

100
100
100
100
100
100
3
K3005/10
0.0
0.0

100
100
100
100
100
0.0
0.0

100
100
100
100
100
4
K3005/12
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
5
K3005/13
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
6
K3005/14
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
7

K3005/15
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
8
K3005/16
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0
0.0

Bambusa vulgaris)
TT
Tên loài
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
K3006/1


100
100

100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100
2
K3006/2
0.0

100
100
100
100
100
100
0.0

100
100
100
100
100

100
3
K3006/5
0.0
0.0

100
100
100
100
100
0.0
0.0

100
100
100
100
100
4
K3006/6
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
0.0

0.0
0.0

100
100
100
100
5
K3006/7
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
6
K3006/11
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0

100
100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
7
K3005/12
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
8
K3005/14
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

24

3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Bụng phật, tre Vàng sọc và loài B.
vulgaris đã công bố trình tự trên Genbank
Bảng 3.4. M ng nucleotide phân tích vi cp mi trnLF/trnFR gia loài tre Bng
pht, tre Vàng sc và loài B. vulgaris (mã s EF137524)
TT
Tên loài
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
K3005/5


100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
98.1
2
K3005/9
0.0

100
100

100
100
100
100
100
100
100
98.1
3
K3005/10
0.0
0.0

100
100
100
100
100
100
100
100
98.1
4
K3005/12
0.0
0.0
0.0

100
100

100
100
100
100
100
98.1
5
K3005/13
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
100
100
98.1
6
K3005/14
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100

100
100
100
98.1
7
K3005/15
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
98.1
8
K3005/16
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100

100
98.1
9
K3011/3
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
98.1
10
K3011/4
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
98.1

11
K3011/5
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

98.1
12
B. vulgaris
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0


Bảng 3.5. M ng nucleotide phân tích vi cp mi psbtrnH gia loài tre Bng

pht, tre Vàng sc và loài B. vulgaris (mã s GU063097)
TT
Tên loài
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
K3005/5


100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

2
K3005/9
0.0

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
3
K3005/10
0.0
0.0

100
100
100
100
100
100
100
100
100
4
K3005/12

0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
100
100
100
100
5
K3005/13
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
100
100
100
6
K3005/14
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
100
100
7
K3005/15
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
100
8
K3005/16
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
9
K3011/3
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
10
K3011/4
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0

100
100
11
K3011/5
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
12
B. vulgaris
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

0.0
0.0
0.0





K3005/5
K3011/3
K3005/14
K3011/4
K3005/10
K3005/12
K3011/8
K3005/9
K3005/13
K3005/15
K3005/16
B. vulgaris
A

K3005/5
B. vulgaris
K3005/13
K3005/16
K3005/15
K3011/3
K3005/9
K3005/10

K3005/14
K3005/12
K3011/4
K3011/8
B

25




Hình 3.10. Mi quan h di truy





 -Joini


loài tre Bng pht và tre Vàng s



 Bambusa vulgaris tr









 trnL-trnF (A) 

 psbA-trnH (B) ((trình t c s d so sánh vùng
gen trnL-trnF có mã hiu trong ngân hàng GenBank: B. vugaris (EF137524)); ((trình t c s
d  so sánh vùng gen psbA-trnH có mã hiu trong ngân hàng GenBank: B. vugaris
(GU063097)).
3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Đùi gà với loài B. ventricosa và loài B.
tuldoides đã công bố trình tự trên Genbank
Bảng 3.6. M ng nucleotide phân tích vi cp mi psbtrnH c
vi loài B. ventricosa (mã s GU063074)
TT
Tên loài
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
K3006/1


100
100

100
100
100
100
100
99.0
2
K3006/2
0.0

100
100
100
100
100
100
99.0
3
K3006/5
0.0
0.0

100
100
100
100
100
99.0
4
K3006/6

0.0
0.0
0.0

100
100
100
100
99.0
5
K3006/7
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100
100
99.0
6
K3006/11
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
100

99.0
7
K3005/12
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

100
99.0
8
K3005/14
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0

99.0
9
B. ventricosa
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2

0.2
0.2
0.2











Hình 3.11. Mi quan h di truy





 -Joini






 Bambusa ventricosa 








 psbA-

K3006/2
K3006/6
K3006/14
K3006/1
K3006/5
K3006/11
K3006/12
K3006/7
B. ventricosa