Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ thể và chất gắn đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở việt nam

Development of a nonradioactive receptor-
ligand binding assay towards drug development
strategy in Vietnam

Nguyen Anh Luong

Hanoi university of Science, VNU; Faculty of Biology
Major: Genetics; Code: 60 42 70
Supervisors: Assoc.Prof.PhD. Dinh Doan Long
Date of Presenting Thesis: 2011


Abstract. Tổng quan về phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử
dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam: Khái quát về dược lý
phân tử; Các đích tác dụng của thuốc; Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR); Thụ thể
angiotensin II; Các phương pháp nghiên cứu xác định tương tác thụ thể và phối tử; Y
học cổ truyền và tài nguyên dược liệu. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Quy
trình chiết xuất dịch chiết methanol; Thu thụ thể màng; Xác định nồng độ protein sử
dụng phương pháp Bradford; Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn
fluorescein; Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay); Phản ứng tương tác giữa các
phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích; Phương pháp xử lý kết quả. Trình bày kết
quả và thảo luận: Xác định nồng độ protein thu được từ gan chuột; Tối ưu phản ứng
ELISA; Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết; Thí nghiệm liên kết thụ
thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa); Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các
phối tử đã biết; Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật.

Keywords. Di truyền học; Thuốc Việt Nam; Đồng vị phóng xạ; Thụ thể

Content
Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú
trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã được xác định, với

nhiều nhóm loài sinh vật có tính tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn.
Xuất phát từ nền văn hóa đa dạng bản sắc với rất nhiều dân tộc sống trải dài trên khắp
lãnh thổ với các điều kiện tự nhiên và lịch sử riêng đã hình thành nên một nền Y học cổ truyền
với lịch sử lâu đời hàng nghìn năm, với rất nhiều kinh nghiệm trong sử dụng thuốc trong đời
sống. Việc dùng thuốc trong nhân dân đã có từ rất lâu đời, tích lũy dưới dạng kinh nghiệm,
thường chỉ được truyền miệng qua nhiều thế hệ. Hơn 3800 bài thuốc đã được sưu tầm lại, cùng
với hàng nghìn bài thuốc lưu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc
thiểu số. Tuy nhiên, rất nhiều các bài thuốc và các nguyên liệu làm thuốc như vậy vẫn chưa
được nghiên cứu cơ chế tác động cũng như cơ sở khoa học vẫn chưa được xác định.
Có nhiều phương pháp nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong
phát triển thuốc trên thế giới, trong đó phổ biến là phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ (như
3
H,
125
I) để nghiên cứu trên các đích phân tử của thuốc. Tuy nhiên, những phương pháp này
chưa được áp dụng trong điều kiện Việt Nam với nguyên nhân chính là hầu hết các phòng thí
nghiệm sinh dược học của ta thiếu trang thiết bị nghiên cứu, bảo quản và loại thải các chất
phóng xạ.
Vì vậy lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp đo tương tác thụ
thể và phối tử đặc hiệu không dùng đồng vị phóng xạ phục vụ định hướng phát triển
thuốc ở Việt Nam” nhằm tiến tới ứng dụng mô hình này nhằm sàng lọc các hợp chất có hoạt
tính sinh học trên đích phân tử có nguồn gốc từ các cây thuốc, bài thuốc được sử dụng hiệu quả
trong y học cổ truyền với các tác dụng chữa bệnh tương ứng.
Trong Luận văn này, chúng tôi tập trung vào đích phân tử là thụ thể angiotensin II, đây
là đích tác dụng đã được biết của nhiều thuốc có tác dụng hạ huyết áp với cơ chế phân tử đã
được nghiên cứu tương đối rõ, đồng thời bước đầu tiến hành thử nghiệm với một số dịch chiết
từ một số cây thuốc Việt Nam đã được biết trong y học cổ truyền với tác dụng trong điều hòa
huyết áp và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim, mạch và hệ tuần hoàn .
1. Xác định nồng độ protein thu được từ gan
Ở chuột và thỏ, có hai nhóm phụ thụ thể angiotensin II khác nhau, là thụ thể Agtr1 (hay

Agtr1a, hoặc AT
1A
) và Agtr1b (hay AT
1B
). Hai loại thụ thể này do các gen khác nhau quy định
có trình tự tương đồng quan trọng trong vùng mã hóa. Các thụ thể này tương đồng về ái lực với
với angiotensin II và các chất đối vận không peptide và không thể phân biệt về mặt dược lý
mặc dù chúng có sự phân bố khác nhau và được điều hòa khác nhau [25]. So sánh trình tự gen
mã hóa thụ thể AT
1
ở người và chuột, có tới hơn 95% trình tự axit amin tương đồng [22], và có
ái lực tương đồng với chất chủ vận tự nhiên là angiotensin II [25].
Gan chuột là mô có sự phân bố của thụ thể angiotensin II cao thứ hai, chỉ sau tuyến
thượng thận [40].
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mô gan để thu protein thụ thể này do mô gan lớn
hơn và thu mẫu cũng dễ dàng hơn.
Sau khi mẫu mô thu được được nghiền đồng thể, tiến hành đo nồng độ protein thu được
theo phương pháp của Bradford. Với BSA là protein chuẩn, đường chuẩn được xây dựng, với
phương trình y = ax + b; trong đó y là giá trị OD ở bước sóng 595nm, còn x là giá trị nồng độ
protein (mg/ml). Với các mẫu pha loãng từ mẫu protein gốc thu được sau khi nghiền đồng thể,
sau khi đo OD
595
ta tìm được giá trị OD của mẫu pha loãng trong giới hạn của đường chuẩn đã
xây dựng, từ đó tính được nồng độ của mẫu pha loãng này rồi từ số lần pha loãng suy ngược ra
nồng độ của mẫu protein gốc ban đầu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định được giá trị
của nồng độ protein thu được từ gan chuột, nồng độ thu được là 50 mg/ml.
2. Tối ưu phản ứng ELISA
Để tối ưu phản ứng ELISA cho các phản ứng giúp xác định được lượng phối tử đặc hiệu
F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp của
phản ứng ELISA có thể xác định được.

Hình 1. Tối ưu nồng độ pha loãng kháng thể với F-BSA.
Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ kháng nguyên (fluorescein-BSA) ở các nồng
độ 0,1; 0,5; và 1 µg/ml. Với mỗi nồng độ kháng nguyên như trên, chúng tối tiến hành với các
nồng độ kháng thể có gắn enzym horseradish peroxidase lần lượt ở các nồng độ pha loãng là từ
250 đến 8000 lần (theo giới hạn được khuyến cáo của nhà cung cấp). Kết quả thí nghiệm được
trình bày trên hình 1. Từ kết quả này, chúng tôi xác định được một số nồng độ cho kết quả thí
nghiệm đảm bảo các tiêu chí đó là cho kết quả OD ổn định, và giá trị OD
405
ở trong khoảng giá
trị đủ lớn (nếu giá trị OD nhỏ, sẽ cho sai số lớn khi kết quả có sự sai số). Tiếp theo, chúng tôi
tiến hành các thí nghiệm để tìm ra khoảng giới hạn về nồng độ của phối tử đặc hiệu trong phản
ứng liên kết với thụ thể, đó là angiotensin II được đánh dấu fluorescein (fluorescein-angiotensin
II, ký hiệu F-AT II). Nhờ phản ứng ELISA cạnh tranh giữa F-AT II với kháng nguyên phủ trên
đĩa trước đó (F-BSA), chúng ta có thể xác định được khả năng của phương pháp trong việc đo
lượng phối tử liên kết thụ thể.
Hình 3.5 biểu diễn kết quả xác định đường chuẩn F-AT II được thiết lập với phản ứng
elisa với nồng độ kháng nguyên phủ đĩa là 1 µg/ml và nồng độ kháng thể kháng fluorescein là
pha loãng 3000 lần.

Hình 2. Đường chuẩn nồng độ F-AT II.
Như vậy, chúng tôi đã tối ưu hóa thành công phản ứng ELISA giúp đo được nồng độ của
phối tử đặc hiệu trong phản ứng liên kết với thụ thể đích-thụ thể angiotensin II. Và dải nồng độ
của phối tử đặc hiệu cũng được xác định trong khoảng từ 10
-11
M - 10
-8
M. Đây là khoảng nồng
độ rất phù hợp cho việc xác định nồng độ của phối tử trong phản ứng liên kết thụ thể - phối tử,
vì các phản ứng này thường đo được trong khoảng nM (10

-9
M).
3. Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết
Để thực hiện được các thí nghiệm liên kết giữa thụ thể và phối tử chúng tôi tiến hành thí
nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện
với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml. Nồng độ của phối tử đặc hiệu F-
AT II trong các phản ứng này là 10
-8
M, đây là nồng độ được tham khảo từ những nghiên cứu
trước đây trên thụ thể này với phối tử đặc hiệu là AT II đánh dấu phóng xạ [47].

Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ protein với phối tử.
Kết quả được trình bày trong hình 3, cho thấy ở nồng độ lượng phối tử liên kết đặc hiệu
với thụ thể đích tăng dần cho đến nồng độ protein là 10 mg/ml, ở đó phản ứng bắt đầu đạt được
giá trị tối đa. Từ kết quả này, giá trị nồng độ protein thích hợp cho các phản ứng liên kết thụ thể
- phối tử được chúng tôi thực hiện trong các thí nghiệm tiếp theo là 10 mg/ml.
Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử cũng được
thực hiện. Giá trị thời gian ủ phù hợp nhất là 40 phút.
4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa)
Với các điều kiện thí nghiệm đã tối ưu, đó là thời gian ủ 40 phút, và nồng độ protein thụ
thể 10 mg/ml đã được xác định thông qua các thí nghiệm trước đó, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm tiếp theo để xác định được các giá trị K
d
và B
max
đặc trưng cho phối tử đặc hiệu F-AT
II. Thí nghiệm được thực hiện với phản ứng liên kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10
-7
M
đến 10

-9
M.

Hình 4. Phản ứng bão hòa thụ thể angiotensin II với F-AT II.
Sử dụng phần mềm Prism 5.04, với mô hình một vị trí liên kết (one site binding model),
giá trị K
d
được tính toán là 11,38 nM, kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã được công
bố trước đó với phối tử đánh dấu phóng xạ [10, 47]. Như vậy, angiotensin II đánh dấu
fluorescein trong nghiên cứu này của chúng tôi đã cho kết quả rất khả quan khi so sánh với các
phương pháp đã công bố, và sự ảnh hưởng của việc gắn thêm gốc fluorescein nếu có thì cũng
không làm ảnh hưởng nhiều đến kết quả của phương pháp này.
5. Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các phối tử đã biết
Để xác định sự chính xác và khả năng thay thế của phương pháp sử dụng angiotensin II
đánh dấu fluorecein so với phương pháp truyền thống (sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ),
chúng tôi thực hiện các thí nghiệm liên kết cạnh tranh giữa F-AT II với các phối tử đã biết của
thụ thể đích. Các phối tử cạnh tranh được chọn là angiotensin II không đánh dấu, và một chất
đối vận của angiotensin II được dùng làm thuốc rất phổ biến hiện nay là losartan (là một trong
những thuốc bán chạy nhất hiện nay). Giá trị K
i
thu được được so sánh với các giá trị K
i
đã
công bố của các phương pháp khác.

a b
Hình 5. Sự cạnh tranh angiotensin II (a) và losartan (b) với F-AT II trong liên kết với thụ
thể angiotensin II.
Sự ức chế của các phối tử với F-AT II trên thụ thể thu được từ gan chuột với AT II (dải
nồng độ từ 10

-12
– 10
-4
M) và losartan (dải nồng độ từ 10
-10
– 10
-2
M). Kết quả thu được được
xử lý, biểu diễn trên hình 5. Giá trị K
i
của AT II và losartan lần lượt là 13x10
-9
M và 3,6x10
-7

M. Giá trị K
i

của AT II trong nghiên cứu này là khá tương đồng với các nghiên cứu đã công bố
trước đây [7, 48], và so sánh với giá trị K
d
của F-AT II trong nghiên cứu này ta thấy có sự
tương đồng cao, cho thấy phối tử đánh dấu F-AT II và phối tử không đánh dấu AT II không có
nhiều khác biệt về ái lực. Điều này cũng củng cố thêm những đánh giá về sự ổn định và ái lực
của phối tử được đánh dấu fluorescein sử dụng trong các nghiên cứu trong các lĩnh vực khác
trên thụ thể angiotensin II như trong các nghiên cứu đã được đề cập trong phần tổng quan tài
liệu.
Giá trị K
i
của losartan được xác định cao hơn trong các nghiên cứu khác được xác định

trong nghiên cứu này của chúng tôi, có thể lý giải điều này là do đây là thuốc được mua từ các
nhà thuốc, vì vậy có thêm các chất khác bổ sung và độ tinh khiết không cao, như được dùng
trong các nghiên cứu khác. Mặc dù vậy, việc sử dụng các phối tử cạnh tranh với phối tử đánh
dấu đã cho thấy phương pháp này cho kết quả chính xác khá cao, và có thể áp dụng được ở Việt
Nam để thay cho việc sử dụng các phương pháp đánh dấu phóng xạ mà khó áp dụng ở các nước
đang phát triển. Hơn nữa, phù hợp với các nghiên cứu đánh giá bước đầu để sàng lọc các dịch
chiết có tác dụng hoạt động trên thụ thể đích.
6. Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra khả năng cạnh tranh của 12 dịch chiết
methanol của 4 loài cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng hạ huyết áp, và
các tác dụng liên quan như giãn mạch. Các loài này bao gồm cỏ mần trầu (Eleusine indica
Gaertn.), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica Linn.), tầm gửi (Taxillus
philippensis Cham. & Schl. Ban.). Đây là các cây thuốc được sử dụng lâu đời trong các bài
thuốc y học cổ truyền, hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi, được chúng tôi tham khảo trong tài
liệu “cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” do viện Dược liệu biên soạn. Cây tầm gửi
(Taxillus philippensis Cham. & Schl. Ban.) là một cây đang được chú ý với một số công bố mới
hiện nay.
Các thí nghiệm liên kết được tiến hành với thể tích mẫu dịch chiết methanol đưa vào các
phép thử dưới 5% theo tổng thể tích phản ứng (trong thí nghiệm của mình, chúng tôi thử với
thể tích dịch chiết chiếm 1% thể tích phản ứng để hạn chế ảnh hưởng của dung môi chiết đến
thí nghiệm. Dịch chiết của các mẫu được kiểm tra với dải nồng độ từ 0,01 µg/ ml cho đến 1000
µg/ml.
Với các mẫu dịch chiết cỏ mần trầu (các mẫu PEI081101, PEI081102 và PEI081101).
Giá trị IC
50
thu được lần lượt là 1,6 ± 0,3; 1,1 ± 0,5 và 0,7 ± 0,6. Kết quả này cho thấy các mẫu
dịch chiết cỏ mần trầu có tiềm lực ức chế phản ứng giữa F-AT II với thụ thể angiotensin II cao.
Dựa vào phương trình Cheng-Prusoff, giá trị K
i
của các mẫu được tính toán là 1,2; 0,8 và 0,5

µg/ml.

Hình 6. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết cỏ mần trầu.
Liên kết đặc hiệu và giá trị IC
50
(trong ngoặc) được xác định với các mẫu  PEI081101 (a); 
PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c).
Với các mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103), giá trị IC
50

thu được đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lượt với các mẫu là 1,1 ± 0,4; 0,8 ± 0,6 và 0,5 ±
0,3). Điều này cho thấy, các dịch chiết này có khả năng ức chế cao phản ứng tương tác giữa thụ
thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó. Giá trị K
i
của các mẫu này trung bình là khoảng
0,8 µg/ml. Kết quả cho thấy, có thể có những chất có tác dụng dược lý tác dụng lên thụ thể
angiotensin II trong các mẫu dịch chiết từ cỏ mần trầu và hạ khô thảo. Đây là những cây cần
được chú ý cùng trong các nghiên cứu sâu hơn của đề tài này.

Hình 7. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hạ khô thảo.
Liên kết đặc hiệu và giá trị IC
50
(trong ngoặc) được xác định với các mẫu  LPV081101 (d); 
LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f).
Log [dịch chiết], µg/ml
0 0,01 0,1 1 10 100 1000
Log [dịch chiết], µg/ml

Hình 8. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hòe. Liên kết
đặc hiệu và giá trị IC

50
(trong ngoặc) được xác định với các mẫu  FSJ081101 (j); 
FSJ081102 (k); ▼ FSJ081103 (l).

Hình 9. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết tầm gửi. Liên
kết đặc hiệu và giá trị IC
50
(trong ngoặc) được xác định với các mẫu  LTP081101 (g); 
LTP081102 (h); ▼ LTP081103 (i).
Hình 8 và 9 biểu diễn đồ thị ức chế của các mẫu hòe và tầm gửi trong với phản ứng thụ
thể angiotensin II và F-AT II. Kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy: các mẫu dịch chiết
từ nụ hòe có tiềm lực ức chế yếu hơn của cỏ mần trầu và hạ khô thảo (hình 7 và 8). 3 mẫu thử
của hòe cho IC
50
có khả năng ức chế mạnh nhất với mẫu FSJ081101 (IC
50
= 13 ± 2 µg/ml) và
yếu nhất là mẫu FSJ081102 (IC
50
= 71 ± 45 µg/ml). K
i
thu được của các mẫu hòe là từ 9,2 đến
Log [dịch chiết], µg/ml

Log [dịch chiết], µg/ml
93,5 µg/ml. Trong khi đó các mẫu dịch chiết của tầm gửi thể hiện khả năng ức chế rất yếu với
giá trị IC
50
trên 100 µg/ml, lên tới gần 1000 µg/ml (với mẫu LTP081103).
Bảng 1. IC

50
và K
i
của các mẫu dịch chiết trong nghiên cứu
Dịch chiết
Mẫu
IC
50
(g/mL)
K
i
(g/mL)
Eleusine indica – Cỏ mần trầu
PEI081101
1.6 ± 0.3
1.2
PEI081102
1.1 ± 0.5
0.8
PEI081103
0.7 ± 0.6
0.5
Prunella vulgaris – Hạ khô thảo
LPV081101
1.1 ± 0.4
0.8
LPV081102
0.8 ± 0.6
0.6
LPV081103

0.5 ± 0.3
0.3
Sophora japonica – Hòe
FSJ081101
13 ± 2
9.2
FSJ081102
71 ± 45
52.7
FSJ081103
26 ± 9
19.2
Taxillus philippensis – Tầm gửi
LTP081101
126 ± 32
93.5
LTP081102
330 ± 80
243.9
LTP081103
800 ± 53
591.7

References
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong và các cộng
sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I và II, NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà
Nội.

3. Tăng huyết áp và điều trị trong y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dược học cổ truyền
Việt Nam.
4. Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006), Bệnh tăng
huyết áp: cơ chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đoán và điều trị, Viện Tim thành phố Hồ Chí
Minh.
Tài liệu tiếng Anh
5. Ayensu E.S., DeFilipps R.A. (1978), Endangered and Threatened Plants of the United
States. Washington, DC:Smithsonian Institution.
6. Beck-Sickinger, A.G. (1996), Structural characterization and binding sites of G-protein-
coupled receptors. Drug Discovery Today, 1:502–513.
7. Bergsma DJ, Ellis C, Kumar C, et al. (1992), Cloning and characterization of a human
angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 183:989-995.
8. Berk BC, Corson MA. (1997), Angiotensin II signal transduction in vascular smooth
muscle: role of tyrosine kinases. Circ Res, 80:607-616.
9. Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM. (1990), Receptor-effector coupling of G
proteins. Biochim Biophys Acta, 1031:163–224.
10. Bouscarel B., Blackmore P.F., Exton J.H. (1988), Characterization of the angiotensin II
receptor in primary cultures of rat hepatocytes. J Biol Chem, 263(29): 14913 – 14919.
11. Bradford M.M. (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72: 248–
254.
12. Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM. (2000), Role of the angiotensin type 2 receptor in the
regulation of blood pressure and renal function. Hypertension, 35:155-163.
13. Curnow KM, Pascoe L, White PC. (1992), Genetic analysis of the human type-1
angiotensin II receptor. Mol Endocrinol, 6:1113-1118.
14. Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons; 2003.
15. Cheng YC, Prusoff WH. (1973), Relationship between the inhibition constant (K
i
) and the
concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC

50
) of an enzymatic
reaction. J Biochem Pharmacol, 22: 3099 –3103.
16. de Jong L.A., Uges D.R., Franke J.P., Bischoff R., (2005), Receptor-ligand binding assays:
technologies and applications. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 829: 1–25.
17. Ernst, E. (1999), Efficacy of Herbal Medicine: Do they Work and Are they Safe?,
Pharmaceutical News, Focus on Contemporary Medicine, Special Issue, p. 17.
18. Fabricant D.S., Farnsworth N.R. (2011), The value of plants used in traditional medicine
for drug discovery. Environ Health Perspect, 109:69–75.
19. Farnsworth N.R., Akerele O., Bingel A.S., Soejarto D.D., Guo Z. (1985), Medicinal plants
in therapy. Bull WHO 63:965–981.
20. Fourth Country Report: Vietnam’s Implementation of the Biodiversity Convention, ASEAN
Biodiversity Magazine.
21. Gonzalez-Villalobos R, Klassen RB, Allen PL, Navar LG, Hammond TG. ((2005)),
Megalin binds and internalizes angiotensin II. Am J Physiol Renal Physiol, 288:F420-
F427.
22. Guo D.F., Sun Y.L., Hamet P., Inagami T. (2001), The angiotensin II type 1 receptor and
receptor-associated proteins. Cell Research, 11, 165–180.
23. Harmer, I.J. and Samuel, D. (1989), The FITC-anti-FITC system is a sensitive alternative to
biotin- streptavidin in ELISA. J. Immunol. Methods, 122. 115-122.
24. Hernandez-Presa M., Bustos C., Ortego M., et al.(1997), Angiotensin-converting enzyme
inhibition prevents arterial nuclear factor-kappa B activation, monocyte chemoattractant
protein-1 expression, and macrophage infiltration in a rabbit model of early accelerated
atherosclerosis. Circulation, 95:1532-1541.
25. Hoe K.L., Saavedra J.M. (2002), Site-directed mutagenesis of the gerbil and human
angiotensin II AT(1) receptors identifies amino acid residues attributable to the binding
affinity for the nonpeptidic antagonist losartan. Mol Pharmacol., Jun;61(6):1404-15.
26. Janssen MJ, Ensing K, de Zeeuw RA. (2001), A fluorescent receptor assay for
benzodiazepines using coumarin-labeled desethylflumazenil as ligand. Anal Chem. Jul
1;73(13):3168-73.

27. Jourdain E., et al. (2011), The Pattern of Influenza Virus Attachment Varies among Wild
Bird Species. PLoS One 6:e24155.
28. Katzung B.G. (2007), Basis and clinical pharmacology, 10
th
ed. McGraw Hill, LANGE.
29. Lefkowitz R.J., Roth J., Pastan I. (1970), Radioreceptor Assay of Adrenocorticotropic
Hormone: New Approach to Assay of Polypeptide Hormones in Plasma. Science 170: 633.
30. Li XC, Carretero OA, Navar LG, Zhuo JL. (2006), AT1 receptor-mediated accumulation of
extracellular angiotensin II in proximal tubule cells: role of cytoskeleton microtubules and
tyrosine phosphatases. Am J Physiol Renal Physiol, 291:F375-F383.
31. Lloyd R.V. ( 2001), Morphology methods: cell and molecular biology techniques. Humana
Press.
32. Lundstrom K.H. and Chiu M.L. (2006), G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery,
CRC Press Taylor & Francis Group,.
33. Mahoney CW. (1999), High-throughput nonradioisotopic determination of binding of
platelet-derived growth factor to platelet-derived growth factor receptor beta-extracellular
domain using biotinylated ligand with enzyme-linked immunosorbent assay. Anal
Biochem., 276(1):106-8.
34. Nakajima M., Hutchinson H.G., Fujinaga M., et al. (1995), The angiotensin II type 2 (AT2)
receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain-of-function study using
gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA, 92:10663-10667.
35. Noda K, Feng YH, Liu XP, et al. (1996), The active state of the AT1 angiotensin receptor is
generated by angiotensin II induction. Biochemistry, 35:16435-16442.
36. Noga E.J., Udomkusonsri P.(2002), Fluorescein: A rapid, sensitive, nonlethal method for
detecting skin ulceration in fish. Vet Pathol 39:726–731.
37. Nguyen Dao Ngọc Van and Nguyen Tap (2008), An overview of the use of plants and
animals in traditional medicine systems in Vietnam:A Traffic Southeast Asia report,
Published by TRAFFIC.
38. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. (2006), How many drug targets are there?
Nature Rev. Drug Discov. 5: 993–996.

39. Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. (2002), Seven-transmembrane receptors. Nature
Rev, 3:639–650.
40. Regard JB, Sato IT and Coughlin SR (2008), Anatomical profiling of G protein-coupled
receptor expression. Cell, Volume 135, Issue 3, 561-571.
41. Rong Y.P., et al. (2009), The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release and
apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3 receptor. Proc Natl
Acad Sci USA, 106:14397-402.
42. Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, et al. (2000), Angiotensin II activates nuclear
transcription factor kappaB through AT(1) and AT(2) in vascular smooth muscle cells:
molecular mechanisms. Circ, 86:1266-1272.
43. Solecki R., Shanidar I.V. (1975), A Neanderthal flower burial in northern Iraq. Science
190:880–881.
44. Takeuchi T, Tanaka S, Rechnitz GA. (1992), Biotinylated 1012-S conjugate as a probe
ligand for benzodiazepine receptors: characterization of receptor binding sites and receptor
assay for benzodiazepine drugs. Anal Biochem., 203(1):158-62.
45. Trevor A.J, Katzung B.G, Maters S.B. (2010), Pharmacology examination and board
review, 9
th
ed. McGraw Hill, LANGE; 2010.
46. Vogle H.G. (2002), Drug discovery and evaluation: pharmacology assays. 2
nd
ed. Springer.
47. Widdowson P.S., Renouard A., Vilaine J.P. (1993), Binding of [
3
H]angiotensin II and
[
3
H]DuP753 (losartan) to rat liver homogenates reveals multiple sites. Relationship of AT1a
and AT1b-type angiotensin receptors and novel nonangiotensin binding sites. Peptides, 14(4):
829 – 837.

48. World Health Organization (2002), Traditional Medicine Strategy 2002–2005, Geneva.
49. Zander E.D. (2011), The Science and Business of Drug Discovery. Springer.