BÁO cáo CUỐI kỳ môn THỰC HÀNH hóa SINH phương pháp đo quang phương pháp đo quang

ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
KHOA Y
PHÂN MƠN HĨA SINH

Lớp: 20DYK2B
Nhóm TH: 1
Nhóm nhỏ: 4

BÁO CÁO CUỐI KỲ MƠN THỰC HÀNH HÓA SINH
Họ và tên học viên: Lai Wen Chen
MSSV: 2000005149
Số ĐT: 0896680507
Email:

TP HCM 12/2021
1


Nội dung
Chương 1 : Phương pháp đo quang......................................................................................................................................................................... 10
Phương pháp đo quang........................................................................................................................................................................................ 10
I.

Định luật cơ bản về hấp thụ ánh sáng:........................................................................................................................................................10

II.

Phương pháp đo quang:.............................................................................................................................................................................. 12

Nguyên tắc xét nghiệm hoá sinh lâm sàng thường dùng qua phương pháp đo quang......................................................................................15
Nội quy phịng thí nghiệm.................................................................................................................................................................................... 18

I. Với sinh viên:................................................................................................................................................................................................. 18
II. Với người hướng dẫn:................................................................................................................................................................................... 19
Sử dụng pipet........................................................................................................................................................................................................ 20
I. Giới thiệu tổng quát:....................................................................................................................................................................................... 20
II. Cách dùng pipet:........................................................................................................................................................................................... 21
Chương II: Định lượng Lipid................................................................................................................................................................................... 28
I. Định lượng Triglyceride..................................................................................................................................................................................... 29
Tổng quát:.......................................................................................................................................................................................................... 29
1. Nguyên tắc định lượng:.................................................................................................................................................................................. 29

2


2. Thuốc thử:...................................................................................................................................................................................................... 30
3. Tiến hành:...................................................................................................................................................................................................... 31
4. Khoảng tuyến tính:......................................................................................................................................................................................... 32
5. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 32
6. Gía trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 32
7. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 32
II. Định lượng Cholesterol:.................................................................................................................................................................................... 35
Tổng quát:.......................................................................................................................................................................................................... 35
1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 37
2. Thuốc thử:...................................................................................................................................................................................................... 38
3. Tiến hành:...................................................................................................................................................................................................... 38
4. Khoảng tuyến tính:......................................................................................................................................................................................... 40
5. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 40
6. Gía trị tham khảo:.......................................................................................................................................................................................... 41
7. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 41
III. Định lượng LDL-C:......................................................................................................................................................................................... 42
Tổng quát........................................................................................................................................................................................................... 42

1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 42
2. Thuốc thử:...................................................................................................................................................................................................... 43
3. Tiến hành:...................................................................................................................................................................................................... 43
4. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 44
5. Gía trị tham khảo:.......................................................................................................................................................................................... 45

3


6. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 45
V. Định lượng HDL-C:.......................................................................................................................................................................................... 45
1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 45
2. Thuốc thử:...................................................................................................................................................................................................... 46
3. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 47
4. Gía trị tham khảo:.......................................................................................................................................................................................... 47
6. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 48
Chương III: Định lượng protid................................................................................................................................................................................ 49
I. Định lượng ure:.................................................................................................................................................................................................. 49
Tổng quát:.......................................................................................................................................................................................................... 49
1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 49
2. Thuốc thử:...................................................................................................................................................................................................... 49
3. Chuẩn bị:........................................................................................................................................................................................................ 50
4. Gía trị tham khảo và khoảng tuyến tính:........................................................................................................................................................51
5. Qúa trình thực hiện:....................................................................................................................................................................................... 52
6. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 53
7. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 53
II. Định lượng Creatinin:........................................................................................................................................................................................ 56
Tống quát:.......................................................................................................................................................................................................... 56
1. Nguyên tắc định lượng:.................................................................................................................................................................................. 57
2. Nồng độ của các dung dịch được sử dụng:.....................................................................................................................................................57

3. Gíá trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 58

4


4. Thành phần mẫu thử...................................................................................................................................................................................... 58
5. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 59
6. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 59
7. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................... 59
8. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 60
9. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 60
III. Định lượng GOT, GPT:................................................................................................................................................................................... 62
Tổng quan:......................................................................................................................................................................................................... 62
1. Nguyên tắc định lượng:.................................................................................................................................................................................. 63
2. Thuóc thử:...................................................................................................................................................................................................... 64
3. Gía trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 66
4. Thành phần mẫu thử...................................................................................................................................................................................... 66
5. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 66
6. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 67
7. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................... 67
8. Tính tốn:....................................................................................................................................................................................................... 68
9. Biện luận:....................................................................................................................................................................................................... 68
Chương 4: Hemoglobin và Acid nucleic.................................................................................................................................................................69
I. Định lượng billirubin toàn phần:........................................................................................................................................................................ 69
Tổng quát:.......................................................................................................................................................................................................... 69
1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 69
2. Nồng độ chỉ định:........................................................................................................................................................................................... 70

5

3. Lưu trữ và bảo quản....................................................................................................................................................................................... 71
4. Mục đích sử dụng........................................................................................................................................................................................... 71
5. Lưu ý.............................................................................................................................................................................................................. 72
6. Giá trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 72
7. Thành phần mẫu thử:..................................................................................................................................................................................... 72
8. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 72
9. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 72
10. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................. 73
11. Biện luận:..................................................................................................................................................................................................... 74
II. Định lượng Billirubin trực tiếp:......................................................................................................................................................................... 76
Tổng quát:.......................................................................................................................................................................................................... 76
1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 76
2. Nồng độ chỉ định:........................................................................................................................................................................................... 77
3. Lưu trữ và bảo quản....................................................................................................................................................................................... 77
4. Mục đích sử dụng........................................................................................................................................................................................... 77
5. Lưu ý.............................................................................................................................................................................................................. 77
6. Giá trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 77
7. Thành phần mẫu thử:..................................................................................................................................................................................... 78
8. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 78
9. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 78
10. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................. 78
11. Biện luận:..................................................................................................................................................................................................... 79

6


III. Định lượng acid uric:....................................................................................................................................................................................... 80
Tổng quát:.......................................................................................................................................................................................................... 80
1. Nguyên tắc:.................................................................................................................................................................................................... 81

2. Nồng độ chỉ định:........................................................................................................................................................................................... 81
3. Lưu trữ và bảo quản....................................................................................................................................................................................... 82
4. Mục đích sử dụng........................................................................................................................................................................................... 82
5. Lưu ý.............................................................................................................................................................................................................. 82
6. Giá trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 82
7. Thành phần mẫu thử:..................................................................................................................................................................................... 83
8. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 83
9. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 83
10. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................. 83
11. Biện luận:..................................................................................................................................................................................................... 84
Chương 5: Glucid.................................................................................................................................................................................................... 86
I. Định lượng Glucose:........................................................................................................................................................................................... 86
1. Tổng quát:...................................................................................................................................................................................................... 86
2. Nguyên tắc định lượng:.................................................................................................................................................................................. 88
3. Nồng độ của các dung dịch được sử dụng:.....................................................................................................................................................89
4. Mục đích sử dụng........................................................................................................................................................................................... 89
5. Lưu ý.............................................................................................................................................................................................................. 89
6. Gía trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 89
7. Thành phần mẫu thử...................................................................................................................................................................................... 90

7


8. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 90
9. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 90
10. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................. 91
11. Biện luận:..................................................................................................................................................................................................... 92
II. Định lượng Amylase:........................................................................................................................................................................................ 93
1. Tổng quát:...................................................................................................................................................................................................... 93
2. Nguyên tắc định lượng:.................................................................................................................................................................................. 94

3 Nồng độ của các dung dịch được sử dụng:......................................................................................................................................................94
4. Mục đích sử dụng........................................................................................................................................................................................... 95
5. Lưu ý.............................................................................................................................................................................................................. 95
6. Gía trị kỳ vọng:.............................................................................................................................................................................................. 95
7. Thành phần mẫu thử...................................................................................................................................................................................... 96
8. Độ tuyến tính:................................................................................................................................................................................................ 96
9. Chuyển đổi đơn vị:......................................................................................................................................................................................... 96
10. Quy trình thử nghiệm:.................................................................................................................................................................................. 96
11. Biện luận:..................................................................................................................................................................................................... 97
Chương 6: Phân tích nước tiểu 10 thơng số............................................................................................................................................................100


Về vấn đề phân tích nước tiểu:.................................................................................................................................................................100
I. Mục đích sử dụng:........................................................................................................................................................................................ 100
II. Tổng quan:.................................................................................................................................................................................................. 100
III. Thận trọng:................................................................................................................................................................................................. 100
IV. Bảo quản và độ ổn định:............................................................................................................................................................................ 101

8


V. Lấy và bảo quản mẫu:................................................................................................................................................................................. 101
VI. Hướng dẫn sử dụng:................................................................................................................................................................................... 101
VII. Diễn giải kết quả:..................................................................................................................................................................................... 102
X. Hạn chế:...................................................................................................................................................................................................... 103
* Cảm quan:................................................................................................................................................................................................... 103
IX. Chi tiết các thông số:..................................................................................................................................................................................... 104
Thuốc thử và đặc tính hiệu quả:....................................................................................................................................................................... 104
1. Acid ascorbic:.............................................................................................................................................................................................. 106
2. Glucose:....................................................................................................................................................................................................... 109

3. Bilirubin:...................................................................................................................................................................................................... 111
4. Urobilinogen:............................................................................................................................................................................................... 113
5. Specific Gravity:.......................................................................................................................................................................................... 115
6. Máu:............................................................................................................................................................................................................. 117
7. pH:............................................................................................................................................................................................................... 119
8. Protein:......................................................................................................................................................................................................... 122
9. Nitrite:.......................................................................................................................................................................................................... 124
10. Leukocytes:................................................................................................................................................................................................ 128
11. Cetone:....................................................................................................................................................................................................... 131
Tài liệu tham khảo................................................................................................................................................................................................... 133

9


Chương 1 : Phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang
I.

Định luật cơ bản về hấp thụ ánh sáng:
1. Định luật Beer-Lambert:
 Nhìn vào hình bên ta hiểu được khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng (λ) và
cường độ (I0) vào dung dịch đồng chất có nồng độ (C) với chiều dày dung dịch (l).
 Kết quả khi chùm sáng đi qua dung dịch thì một phần chùm sáng bị hấp thụ (Ih), một phần bị
phản xạ (Ip) và phần còn lại qua được dung dịch là I.
Suy ra:
I0 = I + I p + I h
Nhưng thực tế thì lượng phản xạ là khơng đáng kể nên:
I0 = I + I h
Ta có định luật Beer như sau:
I/I0 = 10-kLC hay log I0/I = kLC

10


Trong đó: k là hệ số hấp thụ, hệ số phụ thuộc vào bản chất chất màu và dung môi, bước sóng tia và nhiệt độ. Nói cách khác thì độ
truyền quang (T: transmittance) sẽ phụ thuộc bản chất chất lỏng, bước sóng và nhiệt độ. Và T= I/I0.
Độ truyền quang hay độ thấu quang được tính theo đơn vị phần ngàn (‰)
Mật độ quang (optical density) hay độ hấp thụ (absorbance):
Log I0/I = D0 = A
Khi thực hiện trong cùng điều kiện thì k và L sẽ khơng đổi do đó D tỉ lệ thuận với C.
2. Ứng dụng:
Đo nồng độ các chất do độ hấp thụ phụ thuộc nồng độ dung dịch. Định luật để đo các dung dịch có màu hay có thể cho phản ứng
màu.
Các bước thực hiện:
B1: Thực hiện với dung dịch màu biết trước nồng độ (C0)  D0
B2: Thực hiện với mẫu cần xác định nông độ (C)  D
B3: Lấy được kết quả mật độ quang
B4: Tính nơng độ C
Bởi vì ta biết được: D = kLC nên ta có được:

11


D/D0 = C/C0
 C = C0 x D/D0
II. Phương pháp đo quang:
Sử dụng máy đo quang. Đặc điểm chủ yếu của máy kà dòng sáng đi qua dung dịch được chiếu lên tế bào quang điện để chuyển
thành dong điện mà cường độ của nó được đo nhờ một điện kế nhạy sau đó khuếch đại và chuyển đến bộ phận ghi nhận kết quả.
Thông thường trong phương pháp đo quang ta cần chuyển chất cần đo không màu (X) thành hợp chất màu (RX) nhờ thuốc thử (R):
X

Chất cần xác định Thuốc thử

+

R



RX

Sản phẩm có độ hấp thu
R ở bước sóng xác định
và khả kiến

Xác định nồng độ C bằng công thức C = C0 x D/D0 hoặc dùng hệ số factor (F=C0/D0) hoặc dùng biểu đồ mẫu.
Trong trường hợp dùng mẫu trắng, khi dung dịch đo có chứa các chất khác như thuốc thử tạo màu cũng sẽ hấp thụ ánh sáng, lúc
này pha mẫu trắng chỉ chứa thuốc thử để xác định độ hấp thụ của mẫu và đối chiếu với ống đo.
Các bộ phận của máy đo quang:

12


1. Nguồn sáng
2. Bộ đơn sắc: kính lọc hay cách tử
3. Buồng đo
4. Đầu dò
5. Bộ phận khuếch đại
6. Bộ phận chỉ thị kết quả
Khi lựa chọn màu của nguồn sáng cần lựa màu đối diện với mù dung dịch trên bánh xe
màu sắc

Ví dụ:
Khi dung dịch có màu đỏ ta chọn ánh sáng màu xanh

13


 Giaỉ thích cho nguyên nhân chọn màu này là vì mắt ta nhìn thấy màu một vật màu đỏ nghĩa là vật khơng hấp thu màu đó và hấp
thu mạnh nhất với màu đối diện (lục).

14


Nguyên tắc xét nghiệm hoá sinh lâm sàng thường dùng qua phương pháp đo quang
Sơ đồ tổng quát:

Phương pháp đo
điểm cuối (Endpoint)
Các phương
pháp
Phương pháp đo
động học
(Kenetic)

15

Phương pháp
hoá học
Phương pháp
enzyme
Phương pháp

động học so
chuẩn
Kỹ thuật động
học enzyme


Phương pháp

Nguyên lý

Đặc điểm

Ví dụ
Creatinin: phản ứng Jaffé, acid picric
Urê: kỹ thuật Bousquet, dùng DAM
(diacetyl monoxim)

Phương pháp
hoá học
Phương pháp

Đo

lượng

sản

phẩm ở điểm đầu

Nhanh, rẻ nhưng

không đặc hiệu

sulfat/môi trường kiềm
Cholesterol:

đến khi chất cần

đo điểm cuối

Protein: phản ứng Biuret, dùng đồng

phản

ứng

Liebermann

Burchard

xác định tiệu thụ

Glucose: dùng ortho-toluidine, hoặc phản

hết

ứng khử Somogyi Nels
Đặc hiệu nhưng

Dùng glucose oxidase, urease, cholesterol

Phương pháp

giá thành không

oxidase, uricase... để định lượng các cơ

enzyme

rẻ và thực hiện

chất tương ứng (glucose, urê, cholesterol,

lâu

acid uric...)
Đo nồng độ creatinin trong huyết thanh

Phương pháp

Phương pháp

Đo một cách liên

Kỹ thuật động

đo động học

động học so

tục qua từng thời

học 2 điểm:

chuẩn

điểm nhỏ t0, t1, t2,
t3,…

trong

C = ∆ A + ∆ A0

16


Đo vận tốc ở
từng thời điểm
t0, t1,
Kỹ thuật động
học enzyme

khoảng tuyến tính
của phản ứng

sau

t2, t3,…
đó

trung

nhân

bình

∆

D/phút với F ra
hoạt

tính

enzyme với đơn
vị UI/l

17

GOT, GPT, CP, ALP, Amylase


Nội quy phịng thí nghiệm
I. Với sinh viên:
1. Tác phong:


Đến đúng giờ, khi vắng mặt phải có giấy xin phép và không rời khỏi hay ra về trước giờ qui định



Trang phục gọn gàng và mặc áo chồng có thêu tên hoặc đeo bảng tên trong giờ thực tập



Chỉ mang theo sách vở và các vật dụng cần thiết, không ăn uống hay làm những việc không liên quan trong phịng thí nghiệm



Giữ trật tự và vệ sinh ở phịng thí nghiệm
2. Về vấn đề thực hiện thí nghiệm:



Tuân thủ nội quy phòng thú nghiệm, cẩn thận khi thực hiện các thao tác, không tự ý sử dụng dụng cụ khi chưa có sự đồng ý của
người hướng dẫn



Trong quá trình thực hiện cần kiểm tra tinh trạng các dụng cụ được bàn giao nếu có thiếu hay vỡ cần báo cho người phụ trách trước
15 phút



Đọc và chuẩn bị bài trước mỗi buổi thực tập



Trong trường hợp có các hiện tượng bất thường như chát nổ, bòng hay bị thương cần báo ngay không tuỳ tiện xử lý



Sử dụng đúng dụng cụ của mỗi nhóm



Sau khi thực tập xong cần rửa sạch dụng cụ và trả về đúng vị trí ban đầu và dọn dẹp phịng thí nghiệm trước khi rời khỏi
18


3. Về vấn đề an tồn thí nghiệm:


Sử dụng áo chồng trắng trong q trình thực hành



Sử dụng đầy đủ các vật dụng bảo hộ như: bao tay, kính,… với các thí nghiệm cần thiết



Khơng tự ý mở ga, nước hay các hoá chất khi chưa được cho phép
II. Với người hướng dẫn:
1. Về vấn đề chuẩn bị phịng thí nghiệm:



Đăng kí sử dụng phịng thí nghiệm trước khi sử dụng



Trước và sau giờ thực tập cần kiểm tra lại tình trạng của dụng cụ để đảm bảo đủ và không hư hỏng dụng cụ

2. Về vấn đề sử dụng phịng thí nghiệm:



Cần lên lớp đúng giờ và trách nhiệm trong việc bảo quản tài sản phịng thí nghiệm



Thường xun nhắc nhở sinh viên sử dụng đung cách các dụng cụ



Giaỉ quyết các vấn đề của sinh viên một cách kịp thời và hợp lý

19


Sử dụng pipet
I. Giới thiệu tổng quát:
1. Pipet pasteur thuỷ tinh hoặc nhựa:
Pipet Pasteur thuỷ tinh


Khơng có chia độ, nối pipet vào quả bóp cao su hoặc trợ pipet để
sử dụng



Sau sử dụng có thể khử trùng hoặc huỷ bỏ hoặc rửa sạch, sấy khử
trùng để tái sử dụng

Pepet Pausteur nhựa



Có chia độ



Lấy Pipet khỏi bao giấy và sử dụng, sau sử dụng sấy khử trùng rồi huỷ
không tái sử dụng
2. Pipet thuỷ tinh:
Có 2 loại:



Pipet khơng chính xác: có vạch và dung tích

20




Pipet chính xác: có khắc một ngấn hoặc 2 ngấn để lấy một dung tích nhất định

3. Micropipet:


Micropipet bán tự động: chia đến vài μL chia làm micropipet bán tự động 1 kênh
và nhiều kênh



Micropipet tự động giúp lấy một lượng thuốc thử, mẫu thí nghiệm chính xác, xác
thực và nhanh chóng. Có 25 kích cỡ chia làm 2 loại thể tích cố định và thể tích
thay đổi được
II. Cách dùng pipet:
1. Pipet với bóng bóp cao su:



Cắm sâu đầu dưới pipet vào dung dịch



Dung dịch cịn dư lại khơng cho vào chai gốc



Nên tráng pipet trước khi lấy dung dịch



Cầm pipet thẳng đứng, chạm vào thành bình ở tư thế nghiêng



Cho dung dịch chảy xuống tự do xng bình, đợi 3 giây và đầu pipet vẫn chạm vào thành bình hứng

21



Kho khơng sử dụng quả bóp cao su đẩy hết giọt ci cùng cịn đọng lại để tráng khí dung
2. Sử dụng pipet bán tự động:
a. Chọn đúng loại micropipet trong vùng dung tích cần đo



P20: 2 - 20 μL



P100: 10 -100 μL



P200: 20 – 200 μL



P1000: 100 – 1000 μL
b. Chỉnh micropipet đúng dung tích cần hút: bằng cách xoay nút chỉnh thể tích đúng trị số thể tích cần hút
c. Cầm pipet:



Cầm Pipet nghiêng về một phía hơi cách lỏng lẻo trên sống bàn tay khi không sử dụng, như vậy sẽ làm cơ tay ít bị quá sức.



Cầm chặt bằng cả bàn tay. Tránh cầm pipet quá chặt để giảm mỏi cơ tay và cơ vai sau khi sử dụng pipet lâu.



Để lộ phần ghi số thể tích: có thể nhìn trong suốt thời gian để có thể kiểm sốt thể tích lấy ngay cả khi đang sử dụng.



Đặt ngón cái lên nút pittong sao cho khoảng cách thuận lợi trong khoảng với của ngón tay cái để thao tác chính xác và làm giảm
một ngón tay cái

22


d. Thao tác gắn đầu tip đúng: có thể dùng tay chỉnh lại cho chắc chắn tuy nhiên không nên gắn quá chặt để tránh khó tháo đầu
sau khi hút dung dịch
e. Lấy dung dịch: có 2 cách:


Theo chiều xi (Forward method):

23




Theo chiều ngược (Reverse method):

24

Cầm pipet ở tư
thế thẳng đứng

Ấn tới nấc thứ hai
Nhúng đầu pipet
tip khoảng 3-4mm
vào dung dịch

f. Kiểm tra việc lấy mẫu: với bán tự động một kênh:

25

Thả pittong ra
từ từ

Để cho mẫu ấn với
nấc thứ nhất. Loại bỏ
phần dng dịch còn lại
ở pipett tip