NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (PLYCIAS FRUTICOSA L.HARM)

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ
(PLYCIAS FRUTICOSA L.HARM)

i


DANH MỤC VIẾT TẮT
MS: Murashingge & Skoog
BA: 6-benzyladenine
GA33: Gibberellin acid
NAA: α-napthaleneacetic acid
BAP: N-66-benzylaminoburine
TB: trung bình

ii


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ MS đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng
(Polyscias fruticosa) ni cấy in vitro........................................................................... 21
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến sự sinh trưởng và phát triển cây Đinh
Lăng (Polyscias fruticosa) ni cấy in vitro. ................................................................ 23
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Gibberellic đến sự sinh trưởng và phát triển cây
Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ....................................................... 24
Hình 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến sự sinh trưởng và
phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ................................ 26

iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật . 12
Bảng 1.2. Bốn loại vitamin thường dùng ...................................................................... 13
Bảng 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ MS đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. .......................................... 20
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến sự sinh trưởng và
phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ................................. 22
Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Gibberellic (GA3) đến sự sinh
trưởng và phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ................ 24
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến sự sinh trưởng và
phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ................................ 25

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................. Error! Bookmark not defined.
NHẬN XÉT CỦA ĐƠN VỊ THỰC TẬP ....................... Error! Bookmark not defined.
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN............ Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................................i
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG .....................................................................................................iv
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại cây Đinh lăng ........................................................ 3
1.2. Đặc điểm sinh thái ................................................................................................. 3
1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 3
1.4. Thành phần hóa học .............................................................................................. 5
1.5. Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới ................................... 6
1.5.1. Trên thế giới.................................................................................................... 6

1.5.2. Ở Việt Nam ..................................................................................................... 6
1.6. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................. 6
1.6.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật ................................................... 6
1.6.2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................... 8
1.6.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mơ tế bào thực vậy .......................................... 8
1.6.4. Tính tồn năng của tế bào thực vật ................................................................. 9
1.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................. 10
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy ........................................................................................... 10
1.7.2. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 10
1.7.3. Thành phần môi trường nuôi cấy.................................................................. 11
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 17
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 17
2.1.1. Nguồn mẫu: .................................................................................................. 17
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu: ..................................................................................... 17
2.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng ................................................................................ 17
2.2.1. Hóa chất ........................................................................................................ 17
2.2.2. Thiết bị sử dụng ............................................................................................ 17
v


2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 17
2.3.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 17
2.3.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................... 18
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu. ............................................................................. 18
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................... 20
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường lên sự sinh trưởng và
phát triển của cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ...................... 20
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến sự sinh trưởng và
phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ............................. 21

3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Gibberillic (GA3) đến sự sinh
trưởng và phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ............. 23
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến sự sinh trưởng và phát
triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro. ..................................... 25
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 27
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 27
4.2. Đề nghị ................................................................................................................ 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 28

vi


Mở đầu

MỞ ĐẦU
Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và có nhiều
cây thuốc quý. Trong số đó có cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa).
Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống
stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình, phịng chống
nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao. Đinh lăng cịn có tác dụng kháng viêm,
giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần và lipid
toàn phần trong huyết thanh.
Đinh lăng có nhiều lồi thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá
ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó lồi đinh lăng lá nhỏ
(Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng
cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời.
Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc,
rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ,
thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng
lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ

tăng lực. Trong dân gian, ngồi cơng dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho,
ho ra máu, thông tiểu, thông sữa, kiết lỵ nặng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh
lăng được dùng chữa sốt, làm săn da (Đỡ Tất Lợi, 2004)
Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và saponin (Vo et
al., 1998). Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống
stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất polyacetylen có vai trị chống ung thư, chống
oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm. Ngồi ra trong Đinh lăng cịn chứa 20 acid amin và
các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngơ
Ứng Long, 1985).
Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol và hepadeca 1,8 (e) - dien - 4,6
diyn - 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng có chủ yếu trong nhân sâm, điều này cho
thấy có khả năng sử dụng Đinh lăng để thay thế cho nhân sâm (Nguyễn Trần Châu và
cs, 2007).
Trong khi đó, một trong các nguyên nhân khiến cho các sản phẩm chứa Đinh lăng
cịn khá ít trên thị trường là do nguồn cung cấp cây giống chủ yếu là giâm cành, chất
lượng cây giống lại không cao, nếu trồng theo phương pháp tự nhiên thì mất 3-5 năm mới
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Đạt

1


Mở đầu

thu hoạch rễ và hàm lượng saponin triterpen tự nhiên trong cây không đủ đáp ứng nhu cầu
về dược liệu. Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt đang là
yêu cầu cấp bách.
Việc ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đinh lăng là phương pháp
ưu việt nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu ổn định, cây giống đồng đều, sạch bệnh, làm
tăng hoạt chất sinh học so với nguyên liệu ban đầu.

Phương pháp này đã được áp

dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam đây là một hướng đi tương đối mới,
cho nhiều tiềm năng kinh tế đang được các nhà khoa học cũng như các nhà nhân giống
quan tâm từ mức độ nghiên cứu đến quy mô sản xuất thương mại.
Để đáp ứng những nhu cầu thực tế trên, tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa L. Harm)”.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Đạt

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại cây Đinh lăng
Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie thuộc cộng hịa Pháp nằm ở phía
nam Thái Bình Dương. Tên khoa học của Đinh lăng là Polyscias fruticosa L.Harms,
được L.Harms mơ tả và định tên vào năm 1894. Ngồi ra, Đinh lăng cịn có tên gọi
khác là cây gỏi cá hay cây Nam dương lâm.
- Loài: P. fruticosa
- Chi: Polyscias
- Phân họ: Aralioideae
- Họ: Araliaceae - Họ ngũ gia bì
- Bộ: Apiales
- Lớp: Dicolyledoneae - Lớp hai lá mầm
- Ngành: Magnoliophyta - Ngành Mộc lan
- Giới: Plantae - Giới thực vật
Chi Polyscias có gần 100 lồi, phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt, nhất là một

số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, có 7 lồi, đều là cây trồng (Đỡ Huy Bích và cs,
2004).
1.2. Đặc điểm sinh thái
Đinh lăng là loại cây chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt ở vùng đất, tơi xốp
có độ ẩm trung bình (Nguyễn Bá Hoạt, 2005). Cây cũng có thể chịu bóng râm, trồng
được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có
thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai (Đỡ Huy Bích và cs, 2004). Đinh lăng sinh
trưởng mạnh vào mùa xuân hè, ra hoa và quả vào tháng 4 đến tháng 7. Cây trồng ở các
tỉnh phía bắc có hiện tượng tàn lụi vào mùa đơng do khí hậu lạnh, thường trồng bằng
cành sau 2 đến 3 năm thì cây có quả, hạt. Đinh lăng có khả năng tái sinh dinh dưỡng
mạnh nhưng chưa quan sát được cây con mọc từ hạt. Cây thường được trồng bằng
cách giâm cành, cây được 4 đến 5 tuổi trở lên sẽ cho nhiều hoạt chất nhất. (Đỡ Huy
Bích và cs, 2004).
1.3. Đặc điểm hình thái
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) nên nó
mang một số đặc điểm chung của họ này như: Là cây thân gỗ hay cây bụi, đôi khi là
các cây thân thảo sống lâu năm, chúng thường có lá kép hình lơng chim hay hình chân
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu

vịt và có các hoa nhỏ mọc thành chùy lớn, rễ cây có dáng như người gồm một rễ cái và
nhiều rễ phụ. Tuy nhiên, Đinh lăng cũng có một số đặc điểm riêng dùng để phân biệt
với các loài khác như sau:
 Thân
Đinh lăng là loại cây gỗ nhỏ, dạng bụi, xanh tốt quanh năm, cây thường cao 1 1,5 m (có thể cao đến 2m hoặc hơn). Vỏ thân màu trắng nhạt, hơi xám, thân nhẵn,
khơng có gai, ít phân nhánh, phân cành thấp, thân mang nhiều vết sẹo lá to hình chữ V,
máu xám và những nốt lỡ vỏ, vỏ thân có mùi thơm nhẹ (Đỗ Tất Lợi, 2003).
 Lá

Lá kép ba lần lông chim, mọc so le, dài 20 - 40 cm, khơng có lá kèm rõ. Lá chét
có cuống nhỏ mảnh dài 3 - 15 cm, dạng màng, phiến lá chét có răng cưa khơng đều,
đơi khi chia thùy, gốc và đầu thn nhọn, có chóp nhọn, dài 3 - 10 cm, rộng 0,6 - 4
cm. Cuống lá dài, phát triển thành bẹ to ở phần cuối. Lá có mùi thơm khi vị nát (Đỡ
Tất Lợi, 2003).
 Hoa
Hoa nhỏ thành cờ, tán ngắn dài 7 - 18 cm, cụm hoa mọc ở ngọn thành chùy ngắn
mang nhiều tán, mỗi tán có 15 - 20 hoa nhỏ, lá bắc rộng, sớm rụng. Đài hoa hình chén,
gồm 5 lá đài. Hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, có 5 cánh hình trứng thn dài 2 - 3
mm, có 5 nhị, chỉ nhị ngắn và mảnh, dài khoảng 1,5 mm, bao phấn kéo dài, bầu hạ, 2 ơ, có
rìa trắng nhạt (Đỡ Tất Lợi, 2003).
 Quả
Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài 4 - 5 mm, rộng 3 mm và dày 1,5 - 2
mm, có vịi tồn tại. Hạt hình thận và hình khối 3 cạnh màu trắng, kích thước 1 - 3 mm,
vỏ hạt lồi lõm. Cây ra hoa, quả vào tháng 4 đến tháng 7 (Từ điển bách khoa dược học,
1999).
 Rễ
Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5 cm, đầu trên
to, phía dưới thn nhỏ. Mặt ngồi màu trắng xám, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỡ bì
nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ cịn sót lại. Thường hợp thành một
bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỡ
chiếm 2/3 bán kính, các tia ruột từ giữa tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt (Từ điển
bách khoa dược học, 1999).
4


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Trong tự nhiên, dễ có sự nhầm lẫn giữa các cây cùng tên Đinh lăng nhưng khơng
được dùng làm thuốc như:

+ Đinh lăng lá trịn (Polyscias balfouriana Baill.): Lá thường chỉ có 3 lá chét trên
một cuống dài, lá chét hình trịn, đầu tù.
+ Đinh lăng lá to hay Đinh lăng lá ráng (Polyscias ilicifolia (Merr.) Baill.): Lá
kép, có 11 - 13 lá chét, lá chét hình mác có răng cưa to và sâu.
+ Đinh lăng trổ hay Đinh lăng viền bạc (Polyscias guilfoylei Baill.): Lá kép có 7
lá chét, lá chét thường có viền trắng. Loại này lại có 2 thứ là:
- Polyscias guilfoylei Baill. var. laciniata Baill.
- Polyscias guilfoylei Baill. var. victoriae Baill.
1.4. Thành phần hóa học
Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6, C, 20 axit
amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng: K,
Mn, Mg, Fe, Lo, Zw và đường (21,10%). Trong lá cịn có saponin tripterpen (1,65 %),
một genin đã xác định được là axit oleanolic (Đỡ Huy Bích và cs, 2004).
Từ lá Đinh lăng, trung tâm sâm và dược liệu TP. Hồ Chí Minh thuộc Viện Dược
liệu đã phân lập được năm hợp chất polyacetylen là panaxynol, panaxydol, heptadeca 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on và
heptadeca - 1,8 (Z) - dien - 4,6 diyn - 3 ol - 10 on. Hai hợp chất sau chỉ có trong lá Đinh
lăng mà chưa thấy có trong các cây khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae, điều đó nói
lên sự độc đáo về mặt hóa học của Đinh lăng. Trong rễ Đinh lăng cũng tìm thấy năm
hợp chất polyacetylen nhưng chỉ có panaxydol, panaxynol và heptadeca - 1,8 (E) - dien 4,6 diyn - 3,10 diol là trùng hợp với các chất trong lá. Ba chất này có tác dụng kháng
khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư (Đỡ Huy Bích và cs, 2004).
Hai hợp chất chính và quan trọng trong cây Đinh lăng là polyacetylen và saponin
tripterpen. Trong đó, hợp chất polyactylen tác chiết được có tính kháng khuẩn rất mạnh
và kháng một số dạng ung thư, còn hợp chất saponin tripterpen có tác dụng chống stress,
chống trầm cảm, chống oxy hóa rất tốt. Đồng thời, hai hợp chất panaxynol và heptadeca
- 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol trong cây Đinh lăng cũng là hai hợp chất chủ yếu
trong cây Nhân sâm, điều này cho thấy khả năng sử dụng Đinh lăng thay thế Nhân sâm
làm thuốc chữa bệnh (Trần Cơng Luận và cs, Cơng trình nghiên cứu khoa học 19872000).
5

Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.5. Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ đảo Polynésie ở Thái Bình Dương. Hiện nay, cây
được trồng rộng rãi ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc
(Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Tại Ấn Độ, theo Naikarai K.M., Đinh lăng được dùng làm thuốc săn da và trị sốt.
Tại Trung Quốc, Đinh lăng được sử dụng để tăng cường sức khỏe, chữa chứng mất
ngủ, chữa ho, dị ứng… Ở Campuchia, người ta còn dùng lá phối hợp với các loại
thuốc khác làm bột hạ nhiệt và cũng dùng làm thuốc giảm đau.
1.5.2. Ở Việt Nam
Đinh lăng đã xuất hiện từ rất lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở
vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện… để làm cảnh, làm thuốc và rau gia vị
(Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Trong y học cổ truyền, Đinh lăng được sử dụng nhiều trong điều trị các căn bệnh
như ho ra máu, dị ứng, mẩn ngứa, làm lành vết thương, lợi tiểu, kiết lị nặng, tăng sức
dẻo dai của cơ thể… Lá Đinh lăng phơi khơ đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em
nằm phòng bệnh kinh giật. Phụ nữ sau khi sinh uống nước sắc lá Đinh lăng khơ, thấy
cơ thể nhẹ nhõm khỏe mạnh, có nhiều sữa, lá tươi 50 - 100g băm nhỏ cùng với bong
bóng lợn, trộn với gạo nếp nấu cháo ăn cũng lợi sữa. Cả thân, rễ và lá Đinh lăng đều
có thể sử dụng nhưng rễ tốt hơn thân và lá (Võ Văn Chi, 2004), (Lê Trần Đức, 1997).
Hiện nay, để thuận tiện hơn cho việc sử dụng đinh lăng làm thuốc, Công ty cổ
phần Dược phẩm Traphaco đã sản xuất cao đặc Đinh lăng dưới dạng thuốc bổ, viên nén
hoạt huyết dưỡng não. Ngồi ra, cịn có một số chế phẩm từ Đinh lăng hiện dùng như
tinh sâm PANA (Viện Y học Quân sự), rượu thuốc ngọt, viên ngậm DINLAN (Trung
tâm Sâm Việt Nam), trà Đinh lăng...
1.6. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.6.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã đề xướng

thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các
tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các thơng tin di truyền có trong các
tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây
dựng lại tồn bộ cơ thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000).
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào
của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hồn
chỉnh. Ơng đã cho rằng “Bằng ni cấy mơ tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các
phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một
số cây lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn
Vụ và cs, 2009).
Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực
nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hồ thảo. Trong mơi
trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một
hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời
gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới
(Nguyễn Đức Thành, 2000).
Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi
White thành cơng trong việc duy trì mơ rễ cây cà chua trong mơi trường lỏng có chứa
muối khống, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men. Qua thí nghiệm, ơng thấy rằng
có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H.,
Roberts L. W, 1999).
Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của
mơ sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện
thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà
(Dodd J. H., Roberts L. W, 1999). Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh

trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác
nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở
nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó ni cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005).
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi
trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ơng nhận thấy chế phẩm này có tác dụng kích
thích sinh trưởng mơ ni cấy rõ rệt. Một năm sau, Skoog và cộng sự đã xác nhận chất
gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và đặt tên là kinetin. Sau đó người ta
đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin
và cùng với kinetin gọi chung là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực vật
bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngơ. Các hợp chất này có khả năng kích thích

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

sự phân chia tế bào của các mơ đã biệt hố cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt
đã phơi khô (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999).
Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm (mô
sẹo) từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển
thành cây lan con và hồn tồn sạch bệnh. Cùng năm đó, Cocking ở trường đại học tổng
hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực
vật được xử lý với enzym xenlulaza. Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn
bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội thành
cơng ở nhiều lồi thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất lớn
cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ
thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành
công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozo. Năm 1978,
Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của

khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
1.6.2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mơ tế bào thực vật là q trình ni cấy in vitro các nguyên liệu như
đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mơ, cánh hoa có kích thước phù hợp được nuôi
cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và mơi trường thích hợp để tạo thành mơ
hay cây hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009).
Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có thể tạo ra số
lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không phụ thuộc vào điều
kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây ban đầu (Nguyễn Ngọc
Dung, 1998), (Ngơ Ứng Long, 1985).
1.6.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy
Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở
nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy
phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần... con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh
hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các
cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa
8


Chương 1. Tổng quan tài liệu

một giống mới vào sản xuất với quy mơ lớn (Nguyễn Hồng Lộc, 2006), (Vũ Văn Vụ và
cs, 2008).
Ngồi ra, dựa vào kỹ thuật ni cấy, có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống
cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài sinh vật sinh dưỡng. Sử
dụng kỹ thuật ni cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di
truyền mà phương pháp nhân giống cổ điện không thực hiện được. Bên cạnh đó, các nhà
nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định

và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất thực vật ở ngoài tự nhiên “Mở ra triển vọng sử
dụng kỹ thuật này để nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học
để thu nhận các hợp chấp trên quy mô công nghiệp” (Quách Thị Liên, 2004).
Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro dễ sản xuất các
hợp chất thứ cấp:
Các tế bào thực vật có thể được ni cấy trong điều kiện nhân tạo mà không phụ
thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cẩn thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng
lớn các ngun liệu thơ.
Có thể kiểm sốt chất lượng và hiệu quả sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở
ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng
nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mô dịch huyền phù có
chất lượng cao hơn trong cây hồn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung các kỹ thuật nhân giống vơ tính cổ
điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng... một kỹ thuật tiến bộ với những
ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao và có tiềm năng cơng
nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997).
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở ra
những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng hợp các
chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý sinh dưỡng ở các tế bào thực vật và nhiều
đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và cs, 2008).
1.6.4. Tính tồn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các
tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất
kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
9


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Ơng nhận thấy, mỡi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thơng qua q trình
phân bào ngun nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỡi tế bào của một sinh vật sẽ chứa tồn bộ
thơng tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất
định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ thể đều
chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp
những kiểu protein – enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi trong môi trường thích hợp
đều có thể phát triển thành cây ngun vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái
bình thường. Khả năng đó của tế bào được gọi là tính tồn năng của tế bào thực vật”
(Nguyễn Đức Thành, 2002).
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở lí luận của
ni cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được
khả năng tái tạo của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ (Nguyễn
Đức Thành, 2002).
1.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân giống in
vitro. Do đó, việc lựa chọn vật liệu ni cấy thích hợp là cần thiết.
Đối với Đinh lăng, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vơ tính in vitro có thể là
chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, hoặc đoạn thân non. Các vật liệu này cần được đảm bảo
vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông
dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học. Đối với các thí nghiệm ni cấy Đinh
lăng in vitro, tôi sử dụng đỉnh sinh trưởng đã qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân
giống in vitro.
1.7.2. Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mơ trong
q trình ni cấy in vitro. Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là ba điều kiện có
vai trị quan trọng nhất (Nguyễn Đức Thành, 2002).
Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá
trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn định ở 25 280C, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).

10


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát sinh hình
thái mẫu ni cấy. Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng,
cường độ ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng với đa số các lồi cây thích hợp là
12 - 18h/ngày. Cường độ ánh sáng thích hợp cho ni cấy mơ là 1000 - 2500 lux (Vũ
Văn Vụ và cs, 2009).
Độ ẩm: Trong các bình ni cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là 100%.
1.7.3. Thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trường ni cấy mơ tế bào có thành phần thay đổi tùy theo lồi thực vật, loại
tế bào, mơ và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mơ, cơ quan nhưng mực
đích ni cấy mơ khơng giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản.
Mơi trường ni cấy cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu
nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Mơi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân
chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Thành phần hóa học của mơi trường đóng vai trị quyết định đến sự thành cơng hay
thất bại của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những địi hỏi
khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống
mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thục vật,
cho đến nay đã có rất nhiều loại mơi trường khác được sử dụng cho mục đích này,
trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, WP. Ví dụ
mơi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm,
2 lá mầm. Hay mơi trường Gramborg (1965) cịn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu

tương, được sử dụng trong tách và ni tế bào trần.
Tuy có rất nhiều loại mơi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một
số thành phần cơ bản sau (Lê Trần Bình, 1997):
- Các muối khoáng đa lượng vi lượng
- Nguồn cacbon
- Các vitamin và aminoacid
- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái mơi trường
- Các chất điều hịa sinh trưởng
11


Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.7.3.1. Nguồn cacbon
Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu vì vậy phải bổ sung
thêm nguồn cacbon để mẫu cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia.
Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường saccharose và glucose với liều lượng 20-30
g/l dung dịch (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.3.2. Nhóm nguyên tố vi lượng
Là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn 300mg/l dung
dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự
phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co. Các ngun tố này đóng vai trị quan
trọng trong các hoạt động của enzyme (Đỗ Văn Vịnh, 2007).
Bảng 1.1. Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật
Tên vi lượng

Dạng sử dụng

Nồng độ µM/l

Mangan (Mn)

MnSO4.4H2O

15 – 100

Bo (B)

H3BO3

6 – 100

Kẽm (Zn)

Zn(SO4).H2O

15 – 30

Đồng (Cu)

CuSO4.5H2O

0,04 - 0,08

Molypden (Mo)

(ZH4)6Mo7O24.4H2O
NaMoO4.2H2O

0,0007 – 1,0

Coban (Co)

CoCl2.6H2O

0,1 - 0,4

Iơt (I)

KI

2,5 - 20,0

1.7.3.3. Nhóm ngun tố đa lượng
Ngun tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K, Mg, Ca, Na,
S, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào
quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường và xây dựng nên thành
tế bào, mơi trường nhiều nito thích hợp cho việc hình thành chồi, với mơi trường nhiều
kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.3.4. Vitamin
Do các loại mô và tế bào thực vật ni cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết
các loại vitamin nhưng không đủ về số lượng. Do đó trong q trình ni cấy in vitro,

12


Chương 1. Tổng quan tài liệu

các vitamin cần được bổ sung vào mơi trường với nộng độ thích hợp. Đặc biệt là các

vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6. Trong đó, B1 được xem là vitamin quan
trọng nhất cho sự phát triển của thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2002).
Bảng 1.2. Bốn loại vitamin thường dùng
Tên Vitamin
Myo-inositol

Nồng độ sử dụng (mg/l)
100

Axit Nicotinic (vitamin B3)

0,5 - 1,0

Pyridoxine HCl (vitamin B6)

0,05 - 0,5

Thiamine HCl (vitamin B1)

10 - 50

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến 1000 lần
dung dịch làm việc. Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân
hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0OC hoặc chỉ pha chế
trước khi sử dụng (Đỗ Văn Vịnh, 2007).
1.7.3.5. Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia được đưa vào mơi trường ni cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng
của mô sẹo và các cơ quan khác như: Nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men.
Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo – inositol và
các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của Cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng

hay được sử dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích
tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs,
2009).
1.7.3.6. Các chất làm đông cứng môi trường
Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để tạo thành
giá thể cho mẫu phát triển như agar: Dây là một loại polysaccharid làm từ rong biển và
có khả năng ngậm nước cao, ở 800C Agar ngậm nước và tồn tại ở trạng thái lỏng, cịn
ở dưới 400C nó tồn tại ở trạng thái rắn. Trong mơi trường có tính axit cao, khả năng
đông đặc của agar giảm. Nồng độ thường sử dụng 5-8g/l (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.3.7. Các chất điều tiết sinh trưởng tới q trình ni cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật
đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này được phân
thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên
13


Chương 1. Tổng quan tài liệu

về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỡ trợ nhau. Cịn một số
nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cáy mô tế bào
người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin,
cytokinin và giberelin.
Nhóm Auxin
Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực
vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hormon thực vật có tác dụng kích
thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan
đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào. Chính chức năng này đã được người ta
sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó.
Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α naphtylaxetic (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có
tác dụng kích thích q trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, NAA

có tác dụng tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất cứ chất điều tiết
sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thơng qua số các cơng trình nghiên cứu về
chúng.
Nhóm Cytokinin
Việc phát hiện ra xytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật.
Năm 1955 Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu một hợp chất có
khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi là kinetin
(6 - furfuryl - aminopurin - C10H 9N 5O). Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách
được xytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngơ gọi là zeatin và có hoạt tính tương
tự kinetin. Sau đó người ta đã phát hiện xytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật
khác nhau và là một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây.
Trong các loại xytokinin thì 3 loại sau đây là phổ biến nhất: Kinetin (6 - furfuryl
- aminopurin), 6 - benzin - aminopurin và Hiện nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại
xytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây. Nhiều nghiên cứu khẳng định
rằng xytokinin được hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Ngoài ra một số cơ quan
cịn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp xytokinin như chồi, lá non,
quả non, tầng phát sinh....
Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại xytokinin có nhiều ở trong nước dừa.
Xytokinin được vận chuyển trong cây khơng phân cực như auxin, có thể vận chuyển theo
14


Chương 1. Tổng quan tài liệu

hướng ngọn và hướng gốc. Xytokinin có thể ở dạng tự do và dạng liên kết tương tự như các
phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải dưới tác dụng của enzyme, tạo nên sản
phẩm cuối cùng là urê. Các xytokinin tổng hợp được sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là
kinetin và benzyladenin.
Vai trị đặc trưng của xytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy
người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do

xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn đến kích sự
phân chia tế bào. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của
thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi.
Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và
xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn
xytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ xytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra
chồi.
Ðể tăng hệ số nhân giống, người ta thường tăng nồng độ xytokinin trong môi trường
nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi. Ở trong cây rễ là cơ quan tổng hợp xytokinin chủ yếu nên rễ
phát triển mạnh thì hình thành nhiều xytokinin và kích thích chồi trên mặt đất cũng hình
thành nhiều. Xytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn.
Nếu như lá tách rời được xử lý xytokinin thì duy trì được hàm lượng protein và chlorophin
trong thời gian lâu hơn và lá tồn tại màu xanh lâu hơn. Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo
dài tuổi thọ của các cơ quan có thể chứng minh khi cành dâm ra rễ thì rễ tổng hợp xytokinin
nội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn. Hàm lượng xytokinin nhiều làm cho lá
xanh lâu do nó tăng q trình vận chuyển chất dinh dưỡng về ni lá. Trên cây nguyên vẹn
khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh, nếu bộ rễ bị tổn thương
thì cơ quan trên mặt đất chóng già. Xytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự
nảy mầm của hạt và của củ. Vì vậy nếu xử lý xytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ
của hạt củ mầm.
Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích
phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm này gồm: 6 - benzyl aminopurine (BAP), 6 Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin.
Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến ni
cấy mơ, nó kích thích phân hóa cơ quan của những tế bào không phân chia. Nhiều
15


Chương 1. Tổng quan tài liệu

nghiên cứu của các nhà khoa học đã sử dụng kết hợp BAP và NAA để tạo chồi từ mắt
ngủ hay đỉnh sinh trưởng. Rachael keolanui đã sử dụng BAP để tạo chồi khoai môn từ
các mắt ngầm và đỉnh sinh trưởng.
Nhóm Gibberellin
Giberelin được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật
Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong
cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân
bào của mơ phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào,
tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Trần
Thị Lệ và cs, 2008).

16


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguồn mẫu:
Là các chồi đinh lăng có chiều cao từ 1 - 2 cm có từ 3- 4 lá được ni cấy in vitro
tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Thực vật Trường Đại học Yesrin Đà Lạt
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu:
Tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Thực vật Trường Đại học Yesrin Đà
Lạt
2.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
2.2.1. Hóa chất
- Mơi trường MS cơ bản
- Sacharose
- Agar
- Các chất kích thích sinh trưởng: Kinetin, BA, GA3.

- Nước dừa tươi.
2.2.2. Thiết bị sử dụng
- Máy chuẩn pH Hanna HI2210
- Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu)
- Lị vi sóng Sanyo
- Tủ sấy Memmert
- Nồi hấp vơ trùng
- Tủ cấy vô trùng
- Micropipet
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn, mỡi thí nghiệm được lặp lại
3 lần, mỗi lần 5 bịch, mỗi bịch 5 chồi.
- Các bịch ni cấy in vitro được đặt trong phịng ni cấy có chế độ chiếu sáng
16h sáng/8h tối với cường độ chiếu sáng 2000- 2500 lux.
- Nhiệt độ phịng ni cấy:25± 20 C.
- Độ ẩm khơng khí: 65 – 70 %.

17


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962) bổ sung đường 30g/l +
agar 7g/l, pH được điều chỉnh về 5.8
+ Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin, Cytokinin,
Giberelin bổ sung vào mơi trường ni cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí
nghiệm.
+ Nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng

thí nghiệm.
+ Mơi trường được hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,1 atm trong 30 phút sau đó được
chia vào các bịch ni cấy nylon 120 x 250 mm khơng thống khí đã được hấp vơ trùng,
mỗi bịch 50-60ml.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của một số loại môi trường lên sự sinh
trưởng và phát triển của cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro.
- Vật liệu: Là các chồi đinh lăng có chiều cao từ 1 - 2 cm có từ 3- 4 lá
- Mơi trường: (MS; 1/2 MS; 1/4 MS; 3/4 MS) + 2mg/l BAP + nước dừa (15%) +
7g agar + 30g đường sau đó điều chỉnh về Ph 5.8.
- Chỉ tiêu theo dõi:
 Số chồi: trung bình số chồi được hình thành trên các cụm chồi.
 Chiều cao chồi: trung bình chiều cao các chồi được tạo thành
 Số lá: trung bình của tổng số lá trên các chồi được tạo thành
2.3.3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến sự sinh trưởng và
phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro.
- Vật liệu: Là các chồi đinh lăng có chiều cao từ 1 - 2 cm có từ 3- 4 lá
- Môi trường: Môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP và nước dừa ở các nồng độ:
(0; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%) + 7g agar + 30g đường sau đó điều chỉnh về pH 5.8.
- Chỉ tiêu theo dõi:
 Số chồi: trung bình số chồi được hình thành trên các cụm chồi.
 Chiều cao chồi: trung bình chiều cao các chồi được tạo thành
 Số lá: trung bình của tổng số lá trên các chồi được tạo thành

18


Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.3.3. Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Gibberillic (GA3) đến sự sinh

trưởng và phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro.
- Vật liệu: Là các chồi đinh lăng có chiều cao từ 1 - 2 cm có từ 3- 4 lá
- Mơi trường: Mơi trường MS bổ sung 2mg/l BAP, 15% nước dừa non, GA3 ở
các nồng độ: (0 – 0.5 – 1 – 1.5 – 2 – 2.5 – 3) mg/l + 7g agar + 30g đường/l, sau đó điều
chỉnh pH về 5.8.
- Chỉ tiêu theo dõi:
 Số chồi: trung bình số chồi được hình thành trên các cụm chồi.
 Chiều cao chồi: trung bình chiều cao các chồi được tạo thành
 Số lá: trung bình của tổng số lá trên các chồi được tạo thành
2.3.3.4. Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến sự sinh trưởng và
phát triển cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy in vitro
- Vật liệu: Là các chồi Đinh lăng có chiều cao từ 1 - 2 cm có từ 3- 4 lá - Mơi
trường: Môi trường MS bổ sung 2 mg/lBAP, 15% nước dừa, Kinetin ở các nồng độ: (0
– 0.5 – 1 – 1.5 – 2 – 2.5 – 3)mg/l + 7g/l agar + 30g/l đường sau đó điều chỉnh pH về
5.8.
- Chỉ tiêu theo dõi:
 Số chồi: trung bình số chồi được hình thành trên các cụm chồi.
 Chiều cao chồi: trung bình chiều cao các chồi được tạo thành
 Số lá: trung bình của tổng số lá trên các chồi được tạo thành
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Các số liệu được thu sau 60 ngày nuôi cấy.
- Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.
- Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính theo phần mềm thống kê
IBM SPSS Statistics 22.

19