Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.) trên môi trường WPM

LỜI MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, người tiêu dùng đang có xu hướng chuyển từ nước
ngọt có ga sang sử dụng các loại nước trái cây tự nhiên nên nhu cầu về nguồn nguyên
liệu trái cây ngày càng tăng. Trong số đó, nước ép chanh dây được rất nhiều người
ưa chuộng bởi vị chua ngọt dễ chịu và hương thơm lạ. Hiện nay, chanh dây không
chỉ được biết đến với vai trò là nước giải khát mà còn có nhiều giá trị cho các ngành
công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa mĩ phẩm và hoa của nó cũng rất đẹp với
mục đích trồng làm cảnh. Đây được xem là loại cây trồng cho thu nhập cao, ổn định
lại còn có thể trồng xen nhiều cây trồng có giá trị khác nên diện tích và nhu cầu về
cây giống tăng nhanh.
Cây chanh dây có thể trồng bằng hạt, giâm hom hoặc nuôi cấy mô. Trồng bằng
hạt là phương pháp phổ biến, dễ dàng, có thể được thực hiện được bởi cả những người
nông dân thiếu kinh nghiệm nhưng tốn nhiều thời gian, cây giống không đồng nhất,
không giữ được đặc tính của cây mẹ và lâu ra quả, còn giâm hom có ưu điểm là thời
gian nhân giống được rút ngắn, ra quả sớm nhưng khó tạo được nguồn giống sạch
bệnh, khó thu được nguồn giống tốt vì số hom thu được từ một cây có hạn. Do đó,
phương pháp nuôi cấy mô bằng những kĩ thuật nhất định có thể khắc phục được các
nhược điểm trên và tạo ra được số lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng đều, giữ được
các đặc tính tốt của cây mẹ, giảm giá thành so với giống nhập khẩu phù hợp hơn với
túi tiền của người nông dân. Đó cũng là lý do chúng tôi tiến hành đề tài “ Bước đầu
nghiên cứu nhân giống in vitro cây chanh dây tím (Passiflora edulis Sims.)” với
mục tiêu nhằm nghiên cứu nhân giống in vitro cây chanh dây với hệ số nhân chồi cao,
tạo tiền đề cho các nghiên cứu sau này đặc biệt là tạo giống sạch bệnh.
Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát nồng độ Javel và kích thước mẫu lên hiệu quả khử trùng các mẫu
chồi chanh dây.
Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo từ
lá và đoạn thân non của cây chanh dây.
Khảo sát ảnh hưởng của loại môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng
thực vật lên khả năng phát sinh chồi của mẫu chồi chanh dây.

1


1.1. Đặc điểm sinh học của cây chanh dây
1.1.1. Vị trí phân loại
Chanh dây tím có nguồn gốc từ Brazil, được gọi với nhiều tên khác nhau như
Passion fruit, chanh dây, mác mác, lạc tiên, trái mê ly. Là một trong những loại trái
cây có tiềm năng lớn cho ngành công nghiệp nước giải khát rất được ưa chuộng ở
trong nước và trên thế giới (Phạm Quang Vũ 2008).
Giới

: Plantae

Bộ

: Malpighiales

Họ

: Passifloraceae

Chi

: Passiflora

Loài

: P. edulis

Tên khoa học: Passiflora edulis Sims.

Hình 1.1 Chanh dây

1.1.2. Đặc điểm sinh học
a. Đặc điểm hình thái
Passiflora edulis Sims. hay còn gọi là chanh dây tím là một loại cây dây leo
thân gỗ lâu năm, nó có thể dài 15 – 20 m. Lá có dạng ba thùy, màu xanh, dài khoảng
10 – 18 cm có các răng cưa bao viền ngoài, phía trên mặt lá bóng láng, ở dưới thì có
màu xanh xám và mờ hơn, cuống có màu đỏ hơi vàng. Hoa đơn, có mùi thơm, đường
kính khoảng 4,5 cm có màu trắng ngà và ở giữa thì có màu xanh tím. Hạt có dạng bẹt
(một đầu nhọn và một đầu tròn), màu đen, kích thước khá nhỏ. Bề mặt hạt hơi rỗ
nhưng có độ bóng nhất định. Quả chín có màu đỏ tía, trái dạng hình tròn hay hình bầu
dục như quả trứng, dài 5 – 8 cm, nặng 50 – 80 g (Phạm Quang Vũ 2008).
b. Đặc điểm sinh thái
Hầu hết giống chanh dây tím trồng ở nước ta đều nhập từ Đài Loan. Loại cây
này rất thích ánh nắng mặt trời, thích ứng với các vùng có khí hậu mát mẻ, nhiệt độ
trung bình 18 – 200C, độ cao trung bình 800 – 1000 m, có khả năng ra hoa và đậu quả
quanh năm, cho năng suất rất cao và ổn định. Cây cho thu hoạch từ 3 – 5 năm tùy
khoảng cách trồng và điều kiện chăm sóc.
Cây mọc được trên nhiều loại đất trừ đất sét hoặc đất cát, độ mùn trên 1% và
pH 5,5 – 6 là thích hợp nhất (Phạm Quang Vũ 2008).
1.1.3. Bệnh trên cây chanh dây
Có ba nguồn gây bệnh chính trên cây chanh dây là do virus, vi khuẩn và nấm.
Tuy nhiên gây thiệt hại lớn nhất là hai loại bệnh do virus sau: bệnh cứng trái (do virus
PWV) và bệnh quăn lá (do virus PLCV). Khi bị nhiễm hai bệnh này cây chanh dây

2


bị giảm năng suất nghiêm trọng, khả năng tạo chồi và vươn đọt kém, ra hoa ít, trái

nhỏ và bị biến dạng, nếu nặng có thể dẫn đến chết cây. Đặc biệt bệnh lây truyền rất
nhanh qua côn trùng chích hút, dụng cụ làm vườn lại không thể trị bệnh nên nếu vườn
nào đã nhiễm thì khả năng mất trắng là rất cao, thậm chí còn lây lan toàn bộ khu vực
trồng chanh dây gần đó (Rheinländer 2010).
1.1.4. Ứng dụng của chanh dây
Chanh dây chủ yếu được dùng để sản xuất nước trái cây, dùng làm nước giải
khát hàng ngày hay nước đóng chai. Nước chanh dây có tác dụng bổ, mát, thanh nhiệt,
tiêu khát, an thần, nhuận tràng, lợi tiểu, có hương vị đặc biệt nên rất được ưa chuộng.
Chanh dây còn được dùng khi làm bánh, kẹo, mứt, kem, nước xốt. Ngoài ra, rễ và lá
chanh dây có khả năng trị chứng mất ngủ, lá có thể dùng trong điều trị bệnh đau bao
tử, bệnh cao huyết áp, suy nhược thần kinh (Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ
2010).
1.1.5. Các phương pháp nhân giống chanh dây truyền thống
a. Nhân giống từ hạt
Hạt chanh dây tươi được gieo vào đất và để trong bóng râm, tưới nước duy trì
độ ẩm hàng ngày để hạt mọc mầm. Khi cây con ra lá đem cấy vào bịch hay vỉ ươm,
cây cao 20 – 40 cm có thể đem trồng ngoài vườn (Phạm Quang Vũ 2008).
Ưu điểm: Kĩ thuật đơn giản, dễ làm; hệ số nhân giống cao; tuổi thọ cao; cây
trồng bằng hạt thường có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh; bộ rễ
phát triển tốt.
Nhược điểm: Hạt giống nảy mầm chậm và thất thường, có thể mất từ nhiều
tháng đến 2 năm (Flavia Guzzo và cộng sự, 2004); khó giữ được những đặc tính của
cây mẹ; ra hoa kết quả muộn (Đoàn Thị Phương Thảo 2010).
b. Nhân giống bằng giâm hom
Lựa chọn các cành giâm là cành bánh tẻ khỏe, không bị sâu bệnh hại, có đủ
ánh sáng, cành không mang hoa quả, vừa ổn định sinh trưởng chưa lâu. Địa điểm
giâm cành nên thông thoáng nhưng kín gió. Ta nên cắt cành vào lúc trời không có
nắng (sáng sớm hoặc chiều tối). Các đoạn thân chứa ít nhất 3 đốt, cắt bỏ các lá phía
dưới và cắm vào giá thể ra rễ, cần duy trì độ ẩm thường xuyên. Đến khi cây có đủ rễ
và chồi tương đối cao (15 – 20 cm) thì có thể đem trồng ngoài vườn (Phạm Quang

Vũ 2008).
Ưu điểm: Giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ; ra hoa kết quả sớm; thời
gian nhân giống nhanh.
Nhược điểm: Nhân giống bằng giâm cành liên tục qua nhiều thế hệ dễ dẫn đến
hiện tượng thoái hóa; cây chanh dây không chống chịu tốt với sâu bệnh, nhất là tuyến

3


trùng và bệnh về rễ do nấm (Phytophthora, Fursarium); có thể lây lan mầm bệnh
qua các thế hệ (Đoàn Thị Phương Thảo 2010).
c. Cây chanh dây ghép
Cây chanh dây vàng:
Ưu điểm: Sinh trưởng nhanh, dễ gây giống, ít mọc mầm phụ ở gốc cây con,
khả năng chịu hạn và chống chịu sâu bệnh tốt.
Nhược điểm: Là loài có hoa lưỡng tính nhưng thụ phấn chéo, phải nhờ ong thụ
phấn hoặc thụ phấn nhân tạo bổ sung, ra hoa theo mùa nên năng suất không ổn định.
Trái to nhưng vỏ dày, ít cơm và chua gắt, đồng thời hàm lượng dinh dưỡng thấp,
không thơm bằng cây tím.
Cây chanh dây tím:
Ưu điểm: Là loài có hoa lưỡng tính, tự thụ phấn được, ra hoa quả nhiều, quanh
năm nên năng suất cao và ổn định. Giống chanh tím hiện nay có trái to, vỏ mỏng,
nhiều nước, có mùi thơm nồng (mùi thơm đặc biệt như kết hợp của nhiều loại trái cây
mà ta không thể tổng hợp nhân tạo), vị chua nhẹ, có hàm lượng dinh dưỡng cao. Khi
trồng nhanh ra trái hơn cây chanh vàng.
Nhược điểm: Khó gây giống hơn cây vàng, khả năng chịu hạn và chống chịu
sâu bệnh kém đặc biệt là các bệnh về rễ.
Cây chanh dây ghép:
Từ những đặc điểm trên của từng cây, hiện nay hầu hết các giống chanh trên
thị trường đều là chanh dây ghép. Gốc ghép là cây chanh dây vàng (gieo từ hạt) còn

chồi ghép là cây chanh dây tím. Tác động của gốc ghép chanh dây vàng còn làm cho
màu sắc trái chanh tím đẹp hơn, kích cỡ trái to hơn, làm tăng giá trị thương phẩm.
Tuy nhiên rất khó để chọn được các cây chanh tím sạch bệnh, năng suất ưu việt với
số lượng lớn.
Hiện nay phương pháp nhân giống in vitro cũng đang rất được quan tâm nhằm
tạo ra nguồn giống sạch bệnh, chất lượng cao (Đoàn Thị Phương Thảo 2010; Phạm
Quang Vũ 2008).
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực vật.
Dựa trên tính toàn năng của tế bào và khả năng phân hóa, phản phân hóa của chúng
mà người ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay một mẫu mô nào đó. Quá trình này
bao gồm các bước:

4


Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: các cây này cần phải sạch bệnh, đặc
biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.
Bước 1: Nuôi cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng (thường bằng hóa chất)
đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.
Bước 2: Nhân nhanh: chuyển mẫu vào môi trường có hàm lượng Cytokinin
cao hơn để tái sinh thật nhiều chồi.
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: tách các chồi riêng ra và cấy vào môi
trường tạo rễ có hàm lượng Auxin cao hơn.
Bước 4: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên (Phan Xuân Huyên
2016; Bùi Thị Ngọc Tuyến 2011, trích dẫn trong Nguyễn Quang Thạch và cộng sự
2009).
1.2.2. Kĩ thuật nhân giống in vitro và một số vấn đề liên quan
a. Nuôi cấy tạo chồi bất định

Đỉnh chồi bất định mới có thể phát tiển trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp
từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật (đoạn thân,
mảnh lá, cuống lá, nhánh củ,…)
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm ở
trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô
phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này có
nguồn gốc từ các tế bào đơn, tuy nhiên chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy
thuộc vào nồng độ phytohormon (Lê Văn Hoàng 2008).
b. Nuôi cấy thông qua giai đoạn tạo mô sẹo
Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ,
chồi và phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh. Hai điều kiện căn bản cho sự tạo
mô sẹo là cây non và phần non cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi
cấy in vitro, dưới tác dụng của auxin (2,4 – D; NAA,...) được áp dụng riêng rẽ hay
phối hợp với cytokinin (Nguyễn Thị Quý Cơ và cộng sự 2014).
Tế bào mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền
nên người ta thường sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây (Trịnh Thị Lan Anh 2015).
c. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vô mẫu
Tình trạng của cây mẹ: Nên chọn các cây được chăm sóc tốt, đang trong giai
đoạn sinh trưởng mạnh, không có triệu chứng sâu bệnh.
Thời gian lấy mẫu: Các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ dài ngày, tình trạng
nước trong cây,… ảnh hưởng rất nhiều đến hàm lượng carbohydrate, protein dự trữ
và các chất điều hòa sinh trưởng trong mô cây. Tùy thuộc cây mẹ được trồng tự nhiên

5


ngoài đồng hay được chăm sóc trong nhà kính mà có thể lấy mẫu nuôi cấy theo mùa
hoặc lấy mẫu quanh năm.
Phẩm chất mẫu cấy: Cần lưu ý một số đặc tính sau:
- Các vị trí thực vật ở trên mặt đất sẽ sạch hơn các các vị trí dưới đất.

- Mẫu càng nhỏ càng ít nhiễm nhưng sẽ giảm mức độ sống sót sau khi khử
trùng.
- Mô bên trong ít nhiễm hơn mô bên ngoài.
Tuổi của mẫu cấy: Vị trí cành ở phía dưới thường non hơn vị trí cành ở phía
trên, mẫu cấy còn non thường có khả năng tái sinh cao hơn các mẫu già.
Sự vô trùng: Nuôi cấy mô là một kĩ thuật nuôi cấy cần điều kiện vô trùng, khi
khử trùng mẫu cấy cần lưu ý:
- Hóa chất khử trùng: Không độc với mẫu và người thao tác, có hiệu quả loại
các vi sinh vật trong phạm vi rộng.
- Nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng: Nếu nồng độ quá cao, thời
gian khử trùng dài mẫu có thể bị tổn thương và chết. Còn nếu nồng độ quá thấp, thời
gian khử trùng quá ngắn thì không diệt được vi sinh vật (Nguyễn Bảo Toàn 2004).
1.2.3. Một số nghiên cứu liên quan trên cây chanh dây
Nghiên cứu tạo mô sẹo: Năm 2014, Carvalho và cộng sự đã nghiên cứu sự
cảm ứng tạo mô sẹo từ lá của cây Passiflora gibertii NE Brown. trong môi trường ½
MS bổ sung 2 mg/l BA + 5% nước dừa nuôi cấy trong 30 ngày. Nghiên cứu đã cho
thấy các mẫu để ở trong tối và ngoài ánh sáng đều có khả năng tạo mô sẹo nhưng các
mẫu để trong tối mới có khả năng bật chồi. Năm 2016, Jardim Rosa và cộng sự đã
nuôi cấy rễ của cây Passiflora suberosa L. 15 ngày tuổi. Sau 35 ngày mô sẹo được
hình thành khi nuôi cấy trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA. Ożarowski
(2011) cũng nuôi cấy tạo mô sẹo từ các lát lá mỏng cây Passiflora edulis Sims. trên
môi trường MS + 16 mg/l 2,4 – D + 1 mg/l BA, ủ trong tối, mô sẹo được hình thành
sau 30 ngày. Như vậy, cả 3 nghiên cứu trên đều sử dụng môi trường MS hoặc ½ MS
bổ sung BA, NAA và 2,4 – D (để trong tối, nguồn mẫu là rễ và lá) nhưng thời gian
để tạo mô sẹo khá dài (30 – 35 ngày) do đó cần nghiên cứu thêm các môi trường khác,
đồng thời khảo sát khả năng tạo mô sẹo trên các bộ phận khác của cây nhằm tạo được
mô sẹo tốt, rút ngắn thời gian.
Nghiên cứu bật chồi: Năm 2010, Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ đã tạo
được cụm chồi cây Passiflora edulis Sims. từ đoạn thân mang chồi nách (có nguồn
gốc cây in vitro) trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA nhưng lượng chồi thu được ít

(3,95 chồi/mẫu). Năm 2014, Junghans và cộng sự đã tiến hành tách các chồi ngọn cây
Passiflora edulis Sims. 1 năm tuổi với kích thước khác nhau (1; 0,5 và 0,25 cm) nuôi
cấy trên môi trường MS + 1 mg/l BA. Sau 60 ngày nuôi cấy, các mẫu không tạo thêm

6


chồi mà chỉ cao thêm một chút so với mẫu ban đầu (lần lượt là 1,5; 0,86 và 0,52 cm).
Năm 2011, Garcia và cộng sự đã nghiên cứu tạo cụm chồi cây Passiflora suberosa
L. từ đoạn cắt lá trên môi trường MSM + 5 mg/l BA, sau 60 ngày số lượng chồi thu
được cao (9,33 ± 1,4 chồi/mẫu) trong khi trên môi trường MS + 5 mg/l BA lượng
chồi thu được ít hơn (5,6 ± 2,5 chồi/mẫu). Cây chanh dây là một dạng dây leo thân
gỗ, các nghiên cứu trên cho thấy môi trường MS (thường dùng cho cây thân thảo)
chưa thực sự thích hợp cho nuôi cấy đối tượng này. Do đó cần nghiên cứu trên các
loại môi trường khác nhằm tìm ra môi trường phù hợp với cây chanh dây.
Ngoài ra, Monteiro và cộng sự (2000) đã phát hiện sự thiếu hụt dinh dưỡng ở
cây chanh dây vàng Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg. khi nuôi cấy trên môi
trường MS + 1 mg/l gibberellic acid, chủ yếu là Fe và Ca (ngoài ra còn thiếu Cu,
Mg, S), mẫu có triệu chứng ngộ độc có thể do Cl (ngoài ra còn do B). Khi chuyển
vào môi trường MSM, các triệu chứng thiếu hụt và ngộ độc cũng giảm đáng kể. Trong
phạm vi các tài liệu tham khảo được, môi trường sử dụng nhiều nhất là MS nhưng
hiệu quả đều không cao; một số ít nghiên cứu sử dụng môi trường MSM cho hiệu quả
tốt hơn nhiều; tuy nhiên chưa có nghiên cứu nuôi cấy mô chanh dây trên môi trường
WPM. Sau khi phân tích thành phần môi trường WPM, chúng tôi nhận thấy môi
trường này cũng có lượng Ca, Cu cao hơn và lượng Cl thấp hơn môi trường MS nên
có thể sẽ phù hợp cho nuôi cấy mô cây chanh dây hơn.

7

2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, trường Đại học Đà Lạt, từ tháng 11 năm
2016 đến tháng 5 năm 2017.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Để tiến hành thí nghiệm tôi chọn các đọt chanh dây Passiflora edulis Sims.
(khoảng 1 - 1,5 năm tuổi) thu ở huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng để làm vật liệu
nghiên cứu.
2.1.3. Dụng cụ dùng trong thí nghiệm
- Tủ lạnh

- Bịch nilon (7 x 14 cm)

- Tủ sấy

- Pipet (1 ml, 2 ml)

- Tủ cấy vô trùng

- Bình tam giác (250 ml, 500 ml)

- Nồi hấp tiệt trùng

- Ống đong (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml,
1000 ml, 2000 ml)

- Máy đo pH
- Cân

- Đèn cồn, dao cấy, pank và các dụng cụ khác

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu sử dụng là các đọt chanh dây lấy từ những cây khỏe mạnh, sinh trưởng
tốt, không bị tổn thương và không có dấu hiệu của sâu bệnh.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng là MS và WPM có bổ sung:
- Đường: 20 g/l
- Agar: 6,5 g/l
- Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 – D, BA, NAA
- pH của môi trườnỉ lệ mẫu bật chồi =

Số mẫu bật chồi
x 100%
Tổng số mẫu

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 – D lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và
đoạn thân non của cây chanh dây
Mục đích: Tìm ra môi trường có nồng độ 2,4 – D phù hợp cho sự tạo mô sẹo
từ mẫu chanh dây.

10


Tiến hành: Các mẫu lá và đoạn thân non được khử trùng như thí nghiệm 1,
cấy vào môi trường (đặt úp), để trong tối, theo dõi và thu số liệu. Môi trường sử dụng
là WPM có bổ sung 2,4 – D với nồng độ thay đổi: 0; 2; 4; 6 và 8 mg/l được kí hiệu
như bảng 2.2.
Bảng 2.2 Bố trí nghiệm thức cho thí nghiệm tạo mô sẹo
Nghiệm

Loại
Nồng độ 2,4 – D Nghiệm
Loại
Nồng độ 2,4 – D
thức
mẫu
(mg/l)
thức
mẫu
(mg/l)
DL0
0
DT0
0
DL1
2
DT1
2
Đoạn
DL2
4
DT2
4
Lá non
thân
non
DL3
6
DT3
6

DL4
8
DT4
8
Mỗi nghiệm thức khảo sát với 30 mẫu, lặp lại 3 lần và lấy số liệu trung bình.
Thời gian theo dõi: 2 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ tạo mô sẹo, tỉ lệ mô sẹo xốp, tỉ lệ mô sẹo trong và kích
thước mô sẹo.
Tỉ lệ tạo mô sẹo = Tỉ lệ mô sẹo xốp + Tỉ lệ mô sẹo trong
Tỉ lệ mô sẹo xốp =
Tỉ lệ mô sẹo trong =

Tổng số mô sẹo xốp
x 100%
Tổng số mô sẹo
Tổng số mô sẹo trong
x 100%
Tổng số mô sẹo

Kích thước mô sẹo: Đo theo đường kính, vì đa số khối mô sẹo có hình cầu.
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm
Microsoft Excel 2016 và SPSS Statistics 20.

11


3.1. Khảo sát nồng độ chất khử trùng và kích thước mẫu lên hiệu quả khử trùng
Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch Javel là do hypochlorous acid (HOCl) và
ion OCl-. Đây là chất khử trùng phổ biến, giá rẻ, an toàn và dễ sử dụng (Nguyễn Bảo

Toàn 2004).
Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng thực vật: các mẫu lá và đoạn thân non đều không nhiễm, tỉ lệ sống là 100% ở
cả 3 nồng độ Javel. Các mẫu chồi được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Khảo sát nồng độ Javel và kích thước mẫu lên hiệu quả khử trùng các
mẫu chồi chanh dây
Nồng độ
Javel (%)

Kích thước
(mm)

Nghiệm
Tỉ lệ mẫu
Tỉ lệ mẫu
Tỉ lệ mẫu
thức
nhiễm (%) sống (%)
chết (%)
Chồi ngọn
1
J1
32,22b
67,78b
0,00a
Nhỏ
b
ab
1,5
J2

25,56
73,33
1,11ab
(2 x 4)
2
J3
10a
84,44a
5,56d
1
J4
71,11f
28,89e
0,00a
Lớn
1,5
J5
56,67de
43,33cd
0,00a
(8 x 12)
2
J6
46,67cd
50cd
3,33bcd
Chồi nách
1
N1
45,56c

54,44c
0,00a
Nhỏ
1,5
N2
32,22b
65,56b
2,22abc
(1 x 2)
2
N3
11,11a
83,33a
5,56d
1
N4
74,44f
25,56e
0,00a
Lớn
1,5
N5
60,00e
40,00d
0,00a
(8 x 12)
cd
cd
2
N6

48,89
46,67
4,44cd
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa
thống kê với P = 0,05 bằng phép thử Duncan

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy kích thước mẫu càng nhỏ và nồng độ Javel càng
tăng thì hiệu quả khử trùng càng cao nhưng sức sống của mẫu lại giảm. Điều này phù
hợp với quy luật tác dụng của các chất khử trùng. Do các chồi nách đều lộ ra ngoài
môi trường, không được các lớp lá bảo vệ như chồi ngọn nên có tỉ lệ nhiễm cao hơn.
Vì nguồn mẫu được thu trong giai đoạn mùa khô (tháng 11/2016 – 1/2017)
nên hiệu quả khử trùng tương đối cao. Nghiệm thức cho hiệu quả khử trùng cao nhất
(J3, N3) là khi sử dụng Javel ở nồng độ 2%, kích thước mẫu nhỏ. Sau khi khử trùng
mẫu vẫn còn xanh, khi cấy vào môi trường đa phần mẫu đều sống. Nhưng ở nồng độ
này đã xuất hiện mẫu chết, vì thế không nên tăng nồng độ chất khử trùng lên thêm
nữa, sẽ ảnh hưởng đến sức sống và khả năng phát triển của mẫu.
Các mẫu kích thước nhỏ có tỉ lệ nhiễm thấp đồng thời khả năng sống không
kém các mẫu có kích thước lớn. Do đó chúng tôi chọn các mẫu ở nghiệm thức J3 và

12


N3 (sử dụng dung dịch Javel nồng độ 2% trong 10 phút, cắt mẫu với kích thước nhỏ)
làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại môi trường và nồng độ BA lên khả năng phát
sinh chồi của mẫu chồi chanh dây
Sau 2 tháng nuôi cấy tất cả các mẫu chồi nách đều không bật chồi, các mẫu
chồi ngọn có bật chồi nhưng rất ít (khoảng nồng độ BA là 4 mg/l và 6 mg/l), không
đồng đều nên chưa đủ dữ liệu để thống kê tỉ lệ bật chồi và số lượng chồi/mẫu như chỉ
tiêu đã đặt ra.

So với môi trường MS, môi trường WPM có lượng Ca, Cu cao hơn và lượng
Cl thấp hơn nên khá phù hợp cho nuôi cấy mô cây chanh dây.
Theo một số nghiên cứu thì BA và NAA là loại chất điều hòa sinh trưởng thích
hợp cho nuôi cấy mô cây chanh dây. Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ (2010)
đã tạo chồi từ đoạn thân mang chồi nách (tách từ cây in vitro) trên môi trường MS +
0,5 mg/l BA. Năm 2016, Jardim Rosa và cộng sự đã nuôi cấy rễ của cây Passiflora
suberosa L. 15 ngày tuổi. Sau 35 ngày mô sẹo được hình thành khi nuôi cấy trên môi
trường MS + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA. Các mô sẹo này được chuyển vào môi trường
MS + 2 mg/l BA, các chồi phát sinh sau 35 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.2 Khả năng phát sinh chồi của mẫu chồi ngọn sau 2 tháng nuôi cấy
Nồng độ BA
Tỉ lệ bật chồi (%) (tổng cả 3
(mg/l)
lần) (*)
0
0
2
0
WPM + 0,2
4
30
mg/l NAA
6
13,33
8
0
0
0
2
0

MS + 0,2 mg/l
4
10
NAA
6
3,33
8
0
(*) Mỗi nghiệm thức khảo sát với 10 mẫu, lặp lại 3 lần

Nghiệm thức
BW0
BW1
BW2
BW3
BW4
BM0
BM1
BM2
BM3
BM4

Môi trường

Bảng 3.2 cho thấy môi trường WPM có khả năng bật chồi tốt hơn môi trường
MS, mẫu chồi ngọn sau 2 tháng (hình 3.1b) đã to hơn so với ban đầu (hình 3.1a) và
đã tạo được cụm chồi. Tuy nhiên trong thí nghiệm này, số lượng mẫu tạo được cụm
chồi rất ít, không đồng đều có thể là do một số nguyên nhân sau:
- Mẫu được sử dụng trong nuôi cấy đã quá già (1,5 năm tuổi), mà đối với cây
chanh dây, độ tuổi của mẫu rất quan trọng. Nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô cây chanh

dây sử dụng mẫu rất non. Jardim Rosa và cộng sự (2016) dùng mẫu 15 ngày tuổi,
Silva và cộng sự (2011) dùng mẫu 30 ngày tuổi hoặc mẫu có nguồn gốc từ cây in

13


vitro như nghiên cứu của Lê Văn Tường Huân & Phạm Quang Vũ (2010) nên nồng
độ BA sử dụng thấp hơn (1 – 2 mg/l) và thời gian tạo cụm chồi cũng ngắn hơn (1 – 2
tháng).
- Chưa đủ thời gian để tạo cụm chồi vì như hình A (phụ lục), các mô sẹo cũng
phải mất 4 tháng mới bật chồi. Năm 2014, Junghans và cộng sự đã tiến hành tách các
chồi ngọn cây Passiflora edulis Sims. 1 năm tuổi với chiều cao khác nhau (1; 0,5 và
0,25 cm) và nuôi cấy trong môi trường MS + 1 mg/l BA. Sau 2 tháng nuôi cấy, các
mẫu không tạo thêm chồi mà chỉ cao thêm một chút so với mẫu ban đầu (lần lượt là
1,5; 0,86 và 0,52 cm). Trong thí nghiệm này vẫn xuất hiện mẫu đã bật chồi có thể là
do sử dụng môi trường WPM và nồng độ BA (4 - 6 mg/l) cao hơn so với nghiên cứu
trên.
- Sự khác biệt giữa các giống chanh dây: Trong phạm vi tài liệu tham khảo
được, giống chanh dây tím Passiflora edulis Sims. thường cho hiệu quả bật chồi kém
hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng sử dụng cũng
cao hơn các giống khác.
Kết luận: Môi trường WPM bổ sung BA ở nồng độ từ 4 - 6 mg/l + 0,2 mg/l
NAA có khả năng phát sinh chồi từ mẫu chồi ngọn chanh dây.

a

b

Hình 3.1 Mẫu chồi ngọn chanh dây sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường WPM bổ
sung 4 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 – D lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và đoạn thân
non của cây chanh dây
Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu lá bắt đầu có hiện tượng cong lên, phình to ở hai
đầu gân lá; các mẫu thân thì bắt đầu phình to lên. Sau 2 tuần nuôi cấy, mô sẹo hình
thành và tăng nhanh kích thước ở các vị trí đã phình to trước đó.
Sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô cấy và auxin. Thông thường 2,4 D và NAA thường được sử dụng làm nguồn auxin ngoại sinh cho sự hình thành mô
sẹo ở các loài thực vật. Ngoài ra, việc cảm ứng tạo mô sẹo thường đòi hỏi sự kết hợp
giữa auxin và cytokinin (Nguyễn Thị Quý Cơ, 2014). Nhưng trong thí nghiệm này,

14


đối với cây chanh dây chỉ cần một loại auxin là 2,4 – D cũng có khả năng tạo mô sẹo
trong thời gian khá ngắn (2 tuần). Thời gian này là nhanh hơn nhiều so với nghiên
cứu của Jardim Rosa và cộng sự (2016) khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ rễ của cây
Passiflora suberosa L. trên môi trường MS + 30 g/l succrose + 1 mg/l NAA + 2 mg/l
BA, sau 5 tuần mô sẹo mới được hình thành. Nồng độ 2,4 – D cũng thấp hơn, thời
gian ngắn hơn so với nghiên cứu của Ożarowski (2011) khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ
các lát lá mỏng cây Passiflora edulis Sims. trên môi trường MS + 16 mg/l 2,4 – D +
1 mg/l BA, ủ trong tối, mô sẹo được hình thành sau 30 ngày. Điều này càng chứng tỏ
môi trường WPM là phù hợp với cây chanh dây hơn môi trường MS.
Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của 2,4 – D lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và đoạn thân non
của cây chanh dây
Nghiệm
thức

Mẫu
mô

2,4 - D
(mg/l)

Tỉ lệ tạo Tỉ lệ mô
mô sẹo sẹo xốp
(%)
(%)

Tỉ lệ mô
sẹo trong
(%)

Kích thước mô
sẹo (*)

DL0

0

0,00g

0,00a

0,00f

Không tạo mô sẹo

DL1

2

8,89f

8,89b

0,00f

Nhỏ

4

37,78e

37,78cd

0,00f

Nhỏ

DL3

6

62,22d

32,22c

30,00d

Lớn

DL4

8

88,89b

7,78b

81,11b

Lớn

DT0
DT1

0
2

0,00g
81,11c

0,00a
77,78e

0,00f
3,33f

Không tạo mô sẹo
Nhỏ

4

96,67a

77,78e

18,89e

Nhỏ

6

100,00a

43,33d

56,67c

Lớn

DL2

DT2
DT3

Lá
non

Đoạn

thân
non

DT4
8
100,00a
0,00a
100,00a
Lớn
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa
thống kê với P = 0,05 bằng phép thử Duncan
(*) Mẫu thân: Kích thước nhỏ: ≤ 3 mm

Mẫu lá: Kích thước nhỏ: ≤ 0,5 mm

Kích thước lớn: > 3 mm

Kích thước lớn: > 0,5 mm

Tỉ lệ tạo mô sẹo thay đổi tùy thuộc vào nồng độ 2,4 – D bổ sung vào môi
trường. Khi nồng độ 2,4 – D tăng thì tỉ lệ tạo mô sẹo tăng lên, nếu nồng độ 2,4 – D
quá cao sẽ gây ảnh hưởng ức chế (Lê Thị Hồng 2012). 2,4 – D có tác động mạnh đến
quá trình phản biệt hóa và kích thích hình thành mô sẹo. Trong quá trình phát sinh
mô sẹo thường xuất hiện hai loại tế bào: các tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ
và tế bào chất loãng (mô sẹo trong); các tế bào có không bào nhỏ, nhân to và tế bào

15


chất đậm đặc (mô sẹo xốp). Dạng mô sẹo trong thường có khả năng tái sinh cây cao

(Trịnh Thị Lan Anh 2015).

A

B

1 mm

Hình 3.2 Mô sẹo từ đoạn thân non của cây chanh dây
A: Mô sẹo xốp

B: Mô sẹo trong

B

B
A

A

1 mm

Hình 3.3 Mô sẹo từ lá non của cây chanh dây
A: Mô sẹo xốp

B: Mô sẹo trong

16

Tỉ lệ tạo mô sẹo trong tăng dần theo sự tăng nồng độ 2,4 – D. Theo bảng 3.3,
trên môi trường WPM không bổ sung 2,4 – D (DL0, DT0) thì mẫu vẫn còn xanh,
không có khả năng tạo mô sẹo ở cả hai loại mẫu cấy. Còn ở các nghiệm thức có bổ
sung 2,4 – D đều có khả năng tạo mô sẹo. Trong đó, nghiệm thức DT4 cho tỉ lệ 100%
mô sẹo trong và kích thước mô sẹo lớn nhất. Ở nghiệm thức DL4 cũng cho tỉ lệ tạo
mô sẹo trong khá cao (81,11%), chất lượng tốt nhưng do mô sẹo chỉ hình thành ở gân
chính của lá nên kích thước mô sẹo không lớn bằng mẫu thân, tổng lượng mô sẹo thu
được rất ít. Chúng tôi đã cấy mô sẹo ở nghiệm thức DT4 vào môi trường WPM bổ
sung BA nồng độ từ 0 – 8 mg/l + 0,2 mg/l NAA, các cụm chồi hình thành sau 4 tháng
nuôi cấy (hình A – phụ lục) nhưng số lượng mẫu ít, không đồng đều nên chưa đủ dữ
liệu để thống kê.
Kết quả bảng 3.3 cho thấy các mẫu thân có tỉ lệ tạo mô trong cao hơn, kích
thước lớn hơn mẫu lá nên chúng tôi chọn nghiệm thức DT4 (môi trường WPM bổ
sung 8 mg/l 2,4 – D) là nghiệm thức tạo mô sẹo tốt nhất sau 2 tuần nuôi cấy, sẹo có
khả năng bật chồi.

17


I. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được, chúng tôi đi đến những kết luận sau:
- Sử dụng Javel nồng độ 2% trong 10 phút, cắt mẫu với kích thước nhỏ (chồi
ngọn 2 x 4 mm, chồi nách 1 x 2 mm) là hiệu quả nhất cho việc khử trùng các mẫu
chồi chanh dây.
- Môi trường WPM bổ sung BA ở nồng độ từ 4 - 6 mg/l + 0,2 mg/l NAA; 20
g/l succrose; 6,5 g/l agar và pH = 6,2 có khả năng phát sinh chồi từ mẫu chồi ngọn
chanh dây.
- Môi trường WPM bổ sung 8 mg/l 2,4 – D, 20 g/l succrose, 6,5 g/l agar và pH
= 6,2 là tốt nhất cho sự tạo mô sẹo từ đoạn thân non.

II. KIẾN NGHỊ
Trong quá trình thực hiện đề tài tôi có một số kiến nghị như sau:
- Cần khảo sát nồng độ BA kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm
auxin khác nhằm tìm ra môi trường tốt nhất, độ tuổi cây mẹ để rút ngắn thời gian cho
sự phát sinh chồi từ chồi ngọn, chồi nách và mô sẹo chanh dây.
- Cần khảo sát nồng độ AgNO3 bổ sung vào môi trường trong giai đoạn phát
sinh chồi để tăng khả năng kéo dài khi chuyển sang môi trường kéo dài thân.

18


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Trịnh Thị Lan Anh 2015, Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp
(Phalaenopsis amabilis) và ứng dụng trong nhân giống, Luận án tiến sĩ sinh học,
trường Đại học Khoa học tự nhiên tp. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Thị Quý Cơ, Trần Văn Tiến, Võ Thị Bạch Mai, Trần Trọng Tuấn,
Nguyễn Hải Sơn 2014, Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo và chồi của cây long não
(Cinnamomum camphora (L.) Sieb.) nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học và Phát
triển, tập 12, 7:1034-1041.
Lê Văn Hoàng 2008, Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhà xuất bản
Khoa học kỹ thuật.
Lê Thị Hồng 2012, Khảo sát khả năng nhân giống hoa anh thảo (Cyclamen
persium) từ cuống lá và thân củ phát sinh từ rễ của hoa anh thảo in vitro, Khóa luận
tốt nghiệp Đại học nghành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Đà Lạt.
Lê Văn Tường Huân, Phạm Quang Vũ 2010, Nghiên cứu nhân giống vô tính
in vitro cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.) sử dụng đoạn thân mang chồi nách,
Tạp chí Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Tập 8, 3:379385.
Phan Xuân Huyên 2016, Bài giảng tóm tắt sinh trưởng và phát triển thực vật,
Trường Đại học Đà Lạt.

Đoàn Thị Phương Thảo 2010, Nghiên cứu sản xuất đồ uống hỗn hợp Bí ngô Chanh dây đóng chai, Đồ án nghiên cứu trường Đại học Nha Trang.
Nguyễn Bảo Toàn 2004, Giáo trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Trường
đại học Cần Thơ.
Bùi Thị Ngọc Tuyến 2011, Khảo sát quy trình nhân giống cây hoa chuông
(Sinningia speciosa), Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học, trường
Đại học Đà Lạt.
Phạm Quang Vũ 2008, Nghiên cứu tạo cụm chồi và tạo rễ trong điều kiện in
vitro ở cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.), Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học,
trường Đại học Khoa học Huế.

19


Tài liệu tiếng Anh
Carvalho MAdF, Paiva R, Stein VC, Herrera RC, Porto JMP, Vargas DP &
Alves E 2014, ‘Induction and morpho-ultrastructural analysis of organogenic calli of
a wild passionfruit, Brazilian Archives of Biology and Technology, 57:851-859.
Garcia R, Pacheco G, Falcao E, Borges G, Mansur E 2011, Influence of type of
explant, plant growth regeneration, salt composition of basal medium, and light on
callogenesis and regeneration in Passiflora suberosa (Passifloraceae), Plant Cell Tiss
Org, 106:47-54.
Guzzo F, Ceoldo S, Andreetta F, Levi M 2004, In vitro culture from mature
seeds of Passiflora species Sci Argic (Piracicaba, Braz), v.61, 1:108-113.
Jardim Rosa YB, Monte Bello CC & Dornelas MC 2016, In vitro organogenesis
and efficient plant regeneration froom root explants of Passiflora suberosa L.
(Passifloraceae), In vitro Cell Dev Biol Plant, 52:64-71.
Junghans TG, Andrade SRMd, Simões KdS, Caldas CdS, Souza AdS, Ledo
CAdS 2014, In vitro culture of shoot apices from juvenile and adult yellow passion
fruit plants Rev Bras Ciênc Agrár Recife, v9, 3:353-358.
Monteiro ACBdA, Higashi EN, Goncëalves AN , and Rodriguez APM 2000, A

novel approach for the definition of the inorganic medium components for
micropropagation of yellow passionfruit (Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg.),
In Vitro Cell Dev Biol Plant, 36:527-531.
Ożarowski M 2011, Influence of the physico-chemical factors, plant growth
regulators, elicitors and type of explants on callus cultures of medicinal climbers of
Passiflora L., Herba Pol, 57:58-75.
Prammanee S, Thumjamras S, Chiemsombat P, Pipattanawong N 2011, Eficient
shoot regeneration from direct apical meristem tissue to produce virus – free purple
passion fruit plants, Crop Protection, 30:1425-1429.
Rheinländer, PA 2010, Field guide to common diseases and disorders of passion
fruit in New Zealand, Plant & Food Research Mt Albert, Auckland, New Zealand.
Silva CVd, Oliveira LSd, Loriato VAP, Silva LCd, Campos JMSd, Viccini LF,
Oliveira EJd, Otoni WC 2011, Organogenesis from root explants of commercial
populations of Passiflora edulis Sims. and a wild passionfruit species, P. cincinnata
Masters Plant Cell Tiss Organ Cult, 107:407-416.

20