Nghiên cứu nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ (polyscias fruticosa l harms)

1
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG

MÃ SỐ : T2016-30

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (Polyscias fruticosa L. Harms)

Chủ trì đề tài: ThS. Đào Duy Hƣng

THÁI NGUYÊN, 2016


2
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG

MÃ SỐ : T2016-30

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ (Polyscias fruticosa L. Harms)

Chủ trì đề tài

: ThS. Đào Duy Hƣng

Những ngƣời tham gia

: ThS. Lê Thị Hảo
ThS. Đỗ Bích Duệ
KS. Nguyễn Hƣơng Xiêm

Thời gian thực hiện

: Từ tháng 01/2016 đến tháng 12/2016

Địa điểm nghiên cứu

: Khu Công nghệ Tế bào
Viện Khoa học Sự sống
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN, 2016


3

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ
Tên đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ
(Polyscias fruticosa L. Harms)”
– Mã số: T2016-30
– Chủ nhiệm đề tài: ThS. Đào Duy Hƣng
– Tel.: 0978131645

E-mail:

– Cơ quan chủ trì đề tài: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
– Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện:
– Thời gian thực hiện: Tháng 01/ 2016 đến tháng 12/2016
1. Mục tiêu:
- Nghiên cứu thành công quy trình nhân giống in vitro cây đinh lăng lá
nhỏ.
- Sản xuất thử nghiệm 500 cây đi lăng lá nhỏ giống bằng công nghệ
nuôi cấy mô tế bào tại Viện Khoa học Sự sống.
2. Nội dung chính:
- Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô trùng tạo vật liệu ban đầu
cho nhân giống.
- Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống
Đinh lăng.
- Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để tạo
cây Đinh lăng hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm.
- Nội dung 4: Nghiên cứu giá thể phù hợp cho cây Đinh lăng in
vitro phát triển tốt trong điều kiện vƣờn ƣơm.
3. Kết quả chính đạt đƣợc (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội,
v.v…)
3.1. Kết quả nghiên cứu
- Vô trùng tạo vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro cây đinh
lăng lá nhỏ nên khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 với nồng


4

độ 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 70% và
tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 65%.
-Nhân nhanh cụm chồi cây đinh lăng lá nhỏ bằng môi trƣờng MS
có bổ sung BAP ở nồng độ 2 mg/l là thích hợp cho hệ số nhân
chồi đạt 5,37 lần, chiều cao chồi trung bình đạt 2,1 cm, chồi mập
lá xanh, chồi rõ ràng.
- Môi trƣờng thích hợp để tạo cây hoàn chỉnh cho cây đinh lăng
lá nhỏ là môi trƣờng 1/2MS bổ sung NAA với nồng độ 0,3 mg/l
cho kết quả tạo cây hoàn chỉnh tốt tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%,
trung bình số rễ trên chồi đạt 4,40 rễ/chồi và chất lƣợng rễ tốt.
- Giá thể phù hợp để đƣa cây đinh lăng lá nhỏ in vitro ra trồng
trong vƣờn ƣơm là giá thể đất màu trộn với trấu hun tỷ lệ (4:1)
cho tỷ lệ cây sống đạt 100%, trung bình chiều cao cây phù hợp
đạt 4,35 cm và chất lƣợng cây tốt (thân mập, lá xanh).
3.2. Kết quả khoa học
- 01 bài báo khoa học
3.3. Kết quả ứng dụng
- 01 quy trình nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ bằng công nghệ
nuôi cấy mô tế bào
- 500 cây đinh lăng lá nhỏ giống đƣợc nhân bằng công nghệ
nuôi cây mô tế bào.


5

SUMMARY
- Research Project Title: In vitro propagation of Polyscias
fruticosa L. Harms
- Code number: T2016-30
- Coordinator: Hung Dao Duy (MSC)

- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture
and Forestry
- Cooperating Institution(s):
- Duration: from 01/2016 to 12/2016
1. Objectives:
- A micropropagation system of Polyscias fruticosa L. Harms
was set up
- Trial production of 500 trees (Polyscias fruticosa L. Harms)
by in vitro propagation technology at Institue of life science.
2. Main contents:
- Content 1: Research aseptic technique to create original
material for breeding.
- Content 2: Study bud regeneration technique of Polyscias
fruticosa L. Harms
- Content 3: Technical studies rooting for shoots cultures of
complete plants in the laboratory.
- Content 4: Research suitable growing substrate for in vitro
cultured Polyscias fruticosa L. Harms at nursery stage.
3. Results obtained:
3.1. Results research
- In vitro propagation of Polyscias fruticosa L. Harms, the shoottip was sterilized by HgCl2 0,1% in 15 minutes, rate of clean samples
was as 70%, and 65% of samples produced buds
- Suitable culture medium for bud regeneration was basic MS
medium added with BAP (2 mg/l), this has resulted in 5,37 times of
bub regeneration, 2,1 cm of average height, bud was large with green
leaf.


6

- Most suitable culture medium for root formation was as ½ MS
added with NAA 0,3 mg/l, that of 100% cultured samples produced
roots with average of 4,4 roots/bud.
- Suitable growing substrate for in vitro cultured plant at nursery
stage was as cultivated soil with rice husk ask (at the rate mixing of
4:1), all of 100% nursery plants have been good growing, 4,35 cm of
average height, plant shoot was large with strong green leaf.
3.2. Results science
- 01 article science
3.3. Results to apply
- 01 process Polyscias fruticosa L. Harms propagation
techniques by tissue culture.
- 500 of Polyscias fruticosa L. Harms was breeding by in vitro
propagation technology.


7

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Giới thiệu chung về cây đinh lăng ................................................ 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng ................................... 3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố ............................................................... 3
1.1.3. Phân loại ....................................................................................... 3
1.1.4. Thành phần hóa học ..................................................................... 4
1.1.5. Giá trị của cây Đinh lăng .............................................................. 4
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Đinh lăng...................... 5
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực

vật ... 7
1.4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy ................................................ 8
1.5. Một số công trình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nƣớc ............................................. 9
CHƢƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 12
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................... 12
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 12
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 12
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu .......................................... 12
2.2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................... 12
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................ 12
2.2.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô trùng tạo vật liệu
ban đầu cho nhân giống............................................................................ 12
2.2.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi
giống Đinh lăng. ........................................................................................ 14
2.2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy
để tạo cây Đinh lăng hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm .......................... 15


8

2.2.2.4. Nội dung 4: Nghiên cứu giá thể phù hợp cho cây Đinh
lăng in vitro phát triển tốt trong điều kiện vườn ươm. ................................ 17
2.2.3. Xử lý số liệu ................................................................................. 18
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ..................................................................... 18
2.2.4.1. Thí nghiệm in vitro.............................................................. 18
2.2.4.2. Thí nghiệm thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự
nhiên 18
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 19
3.1. Kết quả nghiên cứu vô trùng mẫu cây đinh lăng làm vật liệu

nuôi cấy mô .............................................................................................

19

3.2. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống
Đinh lăng ................................................................................................. 20
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả
nhân chồi ................................................................................................. 20
3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân
chồi .......................................................................................................... 21
3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến
hiệu quả nhân chồi ................................................................................ 22
3.2.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BAP và IBA đến
hiệu quả nhân chồi ................................................................................ 23
3.3. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để tạo
cây Đinh lăng hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm .............................. 24
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ .... 24
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ .... 25
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống
của cây đinh lăng lá nhỏ sau nuôi cấy mô ............................................ 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 29


9

NH NG CH

VIẾT TẮT

BAP

6-benzylaminopurine

CT

Công thức

ĐC

Đối chứng

Kinetin

furfurylaminopurine

MS

Murashinge and Skoog,
1962

NAA

Naphlene acetic acid

TN

Thí nghiệm

IBA

Indole – 3 – butyric acid

IAA

Indole-3-acetic acid

LV
1/2MS

B5

Môi trƣờng MS có thành
phần dinh dƣỡng giảm đi
một nửa


10

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG BÁO CÁO
Bảng

Tên các bảng trong luận văn

Trang

Bảng 3.1.

Kết quả nghiên cứu vô trùng mẫu cây đinh lăng làm vật
liệu nuôi cấy mô

19

Bảng 3.2.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Kinetin đến
hiệu quả nhân chồi

20

Bảng 3.3.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP đến hiệu
quả nhân chồi

21

Bảng 3.4.

Bảng 3.5.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp của BAP
và IAA đến hiệu quả nhân chồi
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp của BAP
và IBA đến hiệu quả nhân chồi

22

23

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA đến hiệu
Bảng 3.6.

quả ra rễ

24

Bảng 3.7.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của IBA đến hiệu
quả ra rễ

25

Bảng 3.8.

Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ
lệ sống của cây đinh lăng lá nhỏ sau nuôi cấy mô

26


11

MỞ ĐẦU
Cây đinh lăng có t n kho học là Polyscias fruticosa (L.), thuộc họ ngũ
gia bì Araliaceae [13], là một loài thực vật đ c sử dụng nhiều trong y học
dân gi n Việt N m và Trung Quốc 3]. Cây đinh lăng có nguồn gốc từ
Polynesie (Thái Bình D ơng), thuộc họ Ariliaceae, chi Polyscias Forst và
Forst.f, chi này gần 100 loài tr n thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình D ơng [1].
Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polysci s, nh đinh lăng lá trổ, đinh
lăng lá ráng, đinh lăng lá tròn và đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng
lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài đ c dân gi n sử dụng rộng rãi
làm thuốc tăng c ờng sức khỏe và hoạt huyết d ỡng não từ rất lâu đời 6].
Cây đinh lăng lá nhỏ có chứ h i h p chất ch nh qu n trọng là
poly cetylen và s ponin, các h p chất này có nhiều ở r và lá 14 . S ponin
trirtepen có tác dụng t ch cực chống oxy hó ,chống stress. Ngoài r , trong
đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không thay thế đ c
nh lysine, methionin, tryptoph n, cysteine 12 . Nhiều nghiên cứu cho thấy
ở r củ củ cây đinh lăng có chứa nhiều chất có tác dụng bồi bổ sức khoẻ và
chữa bệnh. Đặc biệt, trong cây đinh lăng chứa các h p chất s ponin t ơng tự
nh trong nhân sâm 17].
Hiện nay, công tác sản xuất giống phần lớn cây đinh lăng đ c trồng
bằng ph ơng pháp giâm hom, vì vậy cây giống có độ đồng đều không cao, hệ
số nhân giống thấp, chất l ng thấp không đáp ứng đ c yêu cầu của thị
tr ờng. Trong khi đó, cây giống đ c sản xuất bằng công nghệ nuôi cấy mô
tế bào cho hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, đồng đều và giữ đ c tính trạng
u việt của giống gốc. Việc ứng dụng ph ơng nuôi cấy invitro để nhân giống
cây Đinh lăng là một ph ơng pháp m ng lại hiệu quả kinh tế cao. Một số tác
giả đã nghi n cứu nhân giống loại cây này bằng ph ơng pháp nuôi cấy mô tế
bào nh Lê Thị Nh Thảo và cộng sự (2014) 21 , Hà B ch Hồng và cộng sự
(2013) [7] nh ng các khâu còn ch tối u và ch đ cây r ngoài trồng
v ờn ơm để đánh giá hiệu quả củ ph ơng pháp này. Để giải quyết các vấn
đề thực ti n trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu nhân giống cây Đinh lăng
lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào”.


12

* Mục tiêu nghiên cứu
- Nghi n cứu thành công quy trình nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ.
- Sản xuất thử nghiệm 500 cây đi lăng lá nhỏ giống bằng công nghệ nuôi cấy
mô tế bào tại Viện Kho học Sự sống.
* Ý nghĩa của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học
+ Kết quả nghi n cứu đ

r một số kỹ thuật vi nhân nhân giống cây đinh

lăng lá nhỏ bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Từ đó, đánh giá đ

c tác

động củ một số chất điều tiết sinh tr ởng trong nhân giống cây đinh lăng lá
nhỏ.
+ Bổ sung nguồn tài liệu th m khảo phục vụ nghi n cứu, giảng dạy và sản
xuất giống cây đinh lăng lá nhỏ th ơng phẩm có năng suất c o.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Quy trình nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ đ

c nghi n cứu

thành công có thể áp dụng cho nhiều phòng nuôi cấy mô tế bào tr n cả n ớc.
+ Kết quả nghi n cứu góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân
giống cây đinh lăng lá nhỏ nhằm cung cấp giống với số l
đảm bảo, đồng thời giữ đ

ng lớn, chất l

c đặc t nh di truyền củ cây chọn lọc.

ng


13

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây đinh lăng
1.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng
Đinh lăng là cây dạng bụi, c o 1,5-2m. Thân ngắn, không có g i, t
phân nhánh, các nhánh có nhiều lỗ bì lồi, R phù nh củ. Lá kép 3 lần, mọc so
le, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim, dài 20-40cm, không có lá kèm rõ. Lá chép có
cuống dài 3-10mm, phiến lá chép có răng c không đều, chóp nhọn, các
đoạn đều có cuống, lá có mùi thơm. Cụm ho hình chùy ngắn 7-18mm ở
ngọn, gồm nhiều tán, m ng nhiều ho nhỏ, màu trắng xám, tràng 5, nhị 5 với
chỉ nhị gầy, bầu hạ ngăn có 2 đĩ trắng nhạt. Quả hình trứng dẹt, dài 3-4mm,
dày 1mm, màu trắng bạc 6].
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Polynesie (Thái Bình D ơng), thuộc họ
Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f, chi này gần 100 loài tr n thế giới
phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo
Thái Bình D ơng 1 . Ở Việt N m, hiện có 10 loài Đinh lăng 6 , đ số Đinh
lăng hiện n y đ c trồng làm cảnh, chỉ có một vài loài đ c sử dụng làm
thuốc, loài Đinh lăng đ c sử dụng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias
fruticosa L. Harms. Đây là loài có tác dụng d c lý giống Nhân sâm 3].
R Đinh lăng có vị ngọt, t nh bình; lá có vị nhạt, hơi đắng, t nh bình.
Có thể thu hoạch r ở những cây trồng 3 năm trở l n (trồng càng nhiều năm

thì hệ r càng phát triển và l ng h p chất thu càng đ c nhiều). Có thể thu
r vào mù đông s u đó rử sạch phơi khô và bảo quản ở chỗ mát. Có thể thu
lá qu nh năm, th ờng dùng t ơi 1 , 11 .
1.1.3. Phân loại
Nghành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Lớp phụ: Rosidae
Bộ: Apiales
Họ:

Araliaceae

Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms


14

T n thông th ờng: Đinh lăng lá nhỏ, cây gỏi cá, N m d ơng lâm, Đinh
lăng lá xẻ, Đinh lăng h ơng [6].
1.1.4. Thành phần hóa học
Trong r Đinh lăng có glycoside, lk loild, vit min (B1, B2, B6, C),
các phytostrol và 20 cid min, trong đó các cid min không thể th y thế
(lysin, methionin, trytoph n, cystein) 12 . Qu phân t ch sơ bộ thành phần
hóa học trong lá, thấy có s ponin, coum rin, tinh dầu, phytosterol, t nin, cid
hữu cơ, đ ờng khử và h p chất uronic. Từ r và lá Đinh lăng, 11 s ponin
triterpen có thành phần glycon và cid ole nolic đã đ c xác định, trong đó
có 8 h p chất mới đ c đặt t n là polysioside A-H 31 . Có 5 h p chất
poly cetilen trong r Đinh lăng cũng đ c phân lập, trong đó p n xynol,
panaxydol và heptadecaien-dyin-dyol là những chất có trong nhân Sâm và 2
poly cetilen chủ yếu đ c phân lập từ lá cũng là p n xynol, hept dec iendyin-duol.

1.1.5. Giá trị của cây Đinh lăng
* Giá trị dinh dưỡng
Đinh lăng có chứ các h p chất nh lk loid, glycoside, saponin, và
các acid amin t n trong n ớc nh B1, B2, B6, C và các phytosterin.
Ở tất cả các bộ phận nh r , và thân lá đều chứ s ponin nh ng nhiều
nhất là ở vỏ r và lá 1 . Ngoài r trong Đinh lăng còn chứ 20 cid min và
có các loại cid min không th y thế nh lysin, methionin, trytoph n, cystein
[12].
Trong lá: Trong lá, Đinh lăng có chứ s ponin triterpen (chiếm 1,65%),
tinh dầu, phytosterol, t min, cid hữu cơ, đ ờng khử và h p chất uronic.
S ponin triterpen có thành phần glycon và cid one nolic, đây là một chất có
tác dung d c liệu 32 . Có 5 h p chất poly cetylen đ c phân hó từ lá cây
Đinh lăng là: P n xydol, p noxydol, heptadeca – 1,8 (E) dien – 4,6 diyn – 3,4
diol, Heptadeca – 1,8 (E) – dien – 4,6 diyn – 3ol – 10on và Heptadeca – 1,8
(Z) – 4,6diyn – 3ol – 10on [1].
Trong r : Trong r , Đinh lăng có chứ 5 h p chất poly cetylen, b o
gồm: P n xydol, p noxydon, hept dec – 1,8 (E) – dien – 3,10 diol và 3 h p
chất giống trong lá, các h p chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống
một số dạng ung th 1 .


15

* Giá trị dược liệu.
Đinh lăng có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng thể trọng, thúc đẩy sự hình
thành và củng cố tr nhớ đặc hiệu tr n động vật có tr nhớ kém, tăng lực, tăng
sức dẻo d i củ cơ thể, có tác dụng li n hệ nội tiết.
Lá đinh lăng chống bệnh co giật cho trẻ em, lấy lá non và lá già phơi
khô đem lót vào gối hoặc trải gi ờng cho trẻ nằm. Thân cành đinh lăng sắc
uống chữ đ c bệnh đ u l ng, mỏi gối, t thấp, dùng phối h p với r cây

xấu hổ, cúc tần, c m thảo dây.
Đinh lăng có tác dụng chống stress, kháng vi m, giảm đ u, chống sơ
vữ động mạch, dự tr n tác dụng hạ cholesterol toàn và lipid toàn phần trong
huyết th nh. Đồng thời có tác dụng chống khuẩn tốt tr n vi khuẩn Gr m (+)
nh St phylococus. K ch th ch sự hoạt động củ K+, N +, ATP se 14], [10].
S ponin là thành phần qu n trọng có ý nghĩ d c liệu c o trong cây
đinh lăng; còn gọi là s ponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong
thực vật. S ponin cũng có trong một số động vật nh hải sâm, cá s o 9 .
S ponin có nhiều tác dụng d c lý nh có t nh phá huyết, tạo phức h p
với cholesterol, kháng khuẩn, kháng nấm, chống vi m, chống tạo khối u,
nhiều s ponin có tác dụng diệt các loài nhuy n thể,… Nhiều s ponin có t nh
chất tạo bọt khi gi nhiệt, t nh chất này có thể áp dụng để định t nh s ponin
[22].
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Đinh lăng
Theo Nguy n Ngọc Dung, 1998 3 tiến hành đề tài: “Nhân giống cây
Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms thông qu con đ ờng tạo phôi som
trong nuôi cấy in – vitro” và cho kết quả nh s u: cây con đ c tạo thành từ
mô phân sinh củ cây Đinh lăng trong môi tr ờng có thành phần là MS có bổ
sung BAP 2,0 mg/l, sau 60 ngày từ mô phân sinh tạo thành chồi và chồi nách.
Theo Trần Thị Li n và cs, 2005 15 tiến hành nghi n cứu nhân nh nh
cây Đinh lăng Polysci s fruticos L. H rms bằng ph ơng pháp in – vitro và
cho kết quả nh s u: Vật liệu sử dụng là chồi đỉnh và chồi b n còn non củ
cấy Đinh lăng. Môi tr ờng sử dụng là môi tr ờng MS có bổ sung vit min
Morel, n ớc dừ 10%, sucrose 30g/l và các chất điều hò sinh tr ởng thực
vật. Cây con đ c nhân nh nh qu con đ ờng tạo phôi som .


16

Theo L Thi n Th và cs, 2005 23 tiến hành: “Nghi n cứu sự phát

sinh hình thái trong nuôi cấy in – vitro cây Đinh lăng Polysci s fruticos L.
H rms” và đ r kết quả nh s u: Mô sẹo đ c hình thành từ các chồi in –
vitro tr n môi tr ờng MS có bổ sung 2,4 – D2,0 mg/l các mô sẹo phát triển tốt
nhất trển môi tr ờng này và từ đó tạo phôi tr n môi tr ờng không có chất điều
hò sinh tr ởng ngoại sinh, những vật liệu này có thể phát hiện s ponin bằng
ph ơng ph t sắc ký lớp mỏng h y khả năng tạo bọt.
Theo S lw S. S kr và cộng sự (2014) 30 tiến hành nhân giống in
vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms) đã kết luận khử
trùng mẫu Đinh lăng lá nhỏ bằng Clorox nồng độ 25% trong thời gi n 15 phút
cho giá trị cây sống sót đạt c o nhất. Đối với gi i đoạn b n đầu, BA nồng độ
3,0mg/l và Kin nồng độ 2,0 mg/l cho thấy những chồi c o nhất. Đối với gi i
đoạn nhân chồi, chiều dài chồi, số chồi, số lá và mô sẹo hình thành thu đ c
c o nhất từ môi tr ờng B5 có bổ sung BAP nồng độ 5,0 mg/l và kin nồng độ
2,0 mg/l. Sử dụng NAA tạo r , số l ng r nhiều nhất và chiều dài r dài nhất
thu đ c tr n môi tr ờng có bổ sung NAA nồng độ 1 mg/l. Tỷ lệ cây sống
c o nhất đã đạt đ c khi trồng cây con vào chậu có chứ cát và th n bùn theo
tỷ lệ 1:1.
Theo Lê Thị Nh Thảo và cộng sự (2014) 21 đã tiến hành nhân giống
cây đinh lăng lá nhỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy chồi đỉnh thu đ c kết quả Chồi
đ c khử trùng bằng n ớc j ven nồng độ 75 % trong thời gi n 15 phút, cho
hiệu quả c o với mẫu vô trùng đạt 70,17 % và tỷ lệ tạo chồi đạt 55,26 % s u
14 ngày nuôi cấy. Môi tr ờng LV th ch h p hơn cho sự sinh tr ởng và phát
triển củ chồi đinh lăng, thể hiện qu các chỉ ti u số chồi phát sinh (3,10),
chiều c o chồi (3,83 cm/chồi), số lá (8,54), chiều dài lá (2,24 cm/lá) và chiều
rộng lá (0,35 cm/lá) tốt hơn so với tr n môi tr ờng MS. Môi tr ờng th ch h p
cho nhân nh nh chồi in vitro là LV bổ sung BAP (0,3 mg/l) và sucrose (30
g/l) cho hình thành 4,36 chồi/mẫu, chồi phát triển đều có thân v ơn c o (2,45
cm/chồi), thân lá to khỏe s u 40 ngày nuôi cấy. Môi tr ờng LV có bổ sung
IBA (0,3 mg/l) và sucrose (30 g/l) th ch h p cho nuôi cấy tạo r đạt tỷ lệ
50,18 %, r dài tuyệt đối (2,50 cm), có số l ng r 1,39 r /chồi s u 40 ngày

nuôi cấy. Đã xây dựng hệ thống nhân giống in vitro cây đinh lăng tr ởng và
phát triển củ chồi đinh lăng.


17

Nguy n Trung Hậu và công sự (2015) 5 đã tiến hành nuôi cấy mô lá
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) t ọ r tơ và nhận biết hoạt chất
S ponin t ch lũy thu đ c kết quả nh s u: Lá cây đinh lăng 1 năm tuổi đ c
khử trùng bằng n ớc j vel ph loãng 50% trong 10 phút. Mẫu lá vô trùng đạt
hiệu suất 96,3%. Môi tr ờng MS có bổ sung NAA 1 mg/l th ch h p cho nuôi
cấy phát sinh r tơ đạt 0,322 g/cum. R tơ tăng sinh mạnh tr n môi tr ờng MS
có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Hàm l ng ole nolic cid và s ponin t ch tụ đ c
xác định bằng HPLC.Kết quả cho thấy qu nuôi cấy t ch tụ trong r tơ 40,1
μg/g và s ponin 396,2 μg/g. Bổ sung NAA 0,1mg/l và IBA 1,0 mg/l cho tỉ lệ
tạo r c o và số l ng r tạo r nhiều. Kết quả này mở r triển vọng trong
nghi n cứu nuôi cấy r cây đinh lăng nhằm mục đ ch thu nhận s ponin ở quy
mô lớn hơn.
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
* Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học ng ời Đức H berl ndt, đã tiến
hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
H berl ndt cho rằng mỗi tế bào củ bất kỳ sinh vật nào cũng đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy,
mỗi tế bào củ cơ thể đ bào đều phát sinh từ h p bào thông qua quá trình
phân bào nguy n nhi m. Điều đó có nghĩ là mỗi tế bào củ một sinh vật sẽ
chứ toàn bộ thông tin di truyền cần thiết củ một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp
điều kiện thuận l i nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh.
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingh m. Unio) đã thành công khi thực

nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh đ c t nh toàn năng củ tế
bào. Thành công tr n đã tạo r công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô
t nh, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu 26].
T nh toàn năng củ tế bào mà H berl ndt n u r ch nh là cơ sở lý luận
củ ph ơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến n y, con ng ời đã
hoàn toàn chứng minh đ c khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào ri ng rẽ.


18

* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
củ mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nh u trong cơ thể. V dụ:
Mô dậu làm nhiệm vụ qu ng h p, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm
nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển n ớc và chất dinh d ỡng.
Quá trình phân hoá tế bào đ
Tế bào phôi sinh

c biểu di n ở sơ đồ s u:

Tế bào giãn

Tế bào chuyên hoá

Sơ đồ 1: Quá trình phân hóa tế bào
Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nh ng chúng
vẫn không mất đi khả năng phân chi củ mình. Trong điều kiện th ch h p,
các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chi mạnh mẽ. Quá
trình đó đ c gọi là phản phân hoá tế bào (ng c lại với quá trình phân hoá tế

bào). Sơ đồ hoá nh s u:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào

Sơ đồ 2: Quá trình phản phân hóa tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen đ c hoạt hoá (mà tr ớc đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạng thái
mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy r theo một
ch ơng trình đã đ c mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN củ mỗi tế bào.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô củ cơ thể th ờng bị ức chế bởi các
tế bào xung qu nh. Khi tách ri ng tế bào tạo điều kiện thuận l i cho các gen đ c
hoạt hoá. Quá trình phân hoá đ c xảy r theo một ch ơng trình định sẵn 27].
1.4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy có ảnh h ởng rất lớn đến sự phát triển và sinh
tr ởng củ mô nuôi cấy.


19

- Nhiệt độ
Mô nuôi cấy phát triển tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ th ch h p với nó
nh ng phải đ c duy trì một cách ổn định.Trong các phòng nuôi cấy mô, tế
bào thực vật ng ời t th ờng duy trì nhiệt độ củ phòng nuôi cấy từ 25-280C

nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [26]. Đây là nhiệt độ phù h p với đ số các
loài thực vật.
- Ánh sáng
Ánh sáng có ảnh h ởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái củ mô
nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái củ mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố
nh chu kỳ, c ờng độ, thành phần qu ng phổ ánh sáng [26 . C ờng độ ánh
sáng từ 2000 - 2500 lux đ c dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô khác
nhau.
- Độ pH
pH củ đ số các môi tr ờng nuôi cấy đ c điều chỉnh trong phạm vi
5,5 - 6,0. pH d ới 5,5 làm cho g r khó chuyển s ng trạng thái gel, còn pH
lớn hơn 6,0 g r có thể rất cứng 26].
Độ pH củ môi tr ờng dinh d ỡng ảnh h ởng trực tiếp đến quá trình
thu nhận các chất dinh d ỡng vào tế bào. pH có ảnh h ởng đến hoạt t nh củ
enzyme, chiều h ớng và tốc độ củ nhiều phản ứng sinh hoá, quyết định sự
hấp thụ các c tion và nion qu màng tế bào, ảnh h ởng đến áp suất thẩm
thấu củ tế bào 24].
1.4. Một số công trình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật ở trong nƣớc
Năm 2010 Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh T đã nghi n cứu nhân
giống in vitro cây b k ch t m và thu đ c kết quả, tái sinh chồi in vitro tr n
môi tr ờng cơ bản MS bổ sung 0,25 mg/L kinetin. Đoạn thân (khoảng 1cm)
củ cây B k ch in vitro đ c nuôi cấy tr n môi tr ờng cơ bản MS bổ sung
các chất k ch sinh tr ởng khác nh u cho cảm ứng nhân nh nh chồi. Số chồi in
vitro đạt lớn nhất tr n môi tr ờng cơ bản MS bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2
mg/L IBA (với 15,00 chồi/mẫu cấy). Chồi đ c tạo r tr n môi tr ờng MS bổ
sung IBA hoặc NAA, hình thành r tốt nhất tr n môi tr ờng MS bổ sung 0,20,25 mg/L IBA. Cây in vitro đ r nhà l ới, 97,9% cây sống và th ch nghi
với điều kiện tự nhi n 25].

20

L n Dendrobium fimbri tum Hook. (Hoàng thảo Long nhãn) là loài l n
đẹp đ c sử dụng làm cảnh và làm thuốc, đ ng đe dọ tuyệt chủng. Nguy n
Thị Sơn và cộng sự (2012), tiến hành nghi n cứu nhân in vitro với mục đ ch
bảo tồn và phát triển nguồn gen loài l n quý. Kết quả nghi n cứu đã chỉrõ:
Nguy n liệu sử dụng là quả l n 3 tháng tuổi; Môi tr ờng th ch h p cho nảy
mầm và phát sinh protocorm củ hạt là môi tr ờng MS + 100ml ND + 10g
s cch roz + 6,0g g r/l t môi tr ờng; Môi tr ờng nhân nh nh protocorm tốt
nhất là môi tr ờng KC + 100ml ND + 10g s c roz + 60g kho i tây + 6,0g
g r/l t môi tr ờng; Môi tr ờng MS + 100ml ND + 20g s c roz + 60g chuối
ch n +6,0g g r/l t môi tr ờng là th ch h p nhất cho nhân nh nh chồi in vitro;
Môi tr ờng tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g s c roz + 1g THT + 6,0g g r/l t
môi tr ờng [18].
Lô hội (Aloe vera L.) là cây d c liệu dùng cho cả đông y và tây y.
Chất gel trong cây Lô hội còn đ c sử dụng để sản xuất các loại mỹ phẩm. Vì
vậy cần phát triển các vùng trồng cây Lô hội làm nguy n liệu. Nguy n Thị
Kim Th nh, D ơng Huyền Tr ng (2008), đã nghi n cứu nhân giống vô t nh in
vitro cây Lô hội nhằm nhân nh nh cây giống cho các vùng nguy n liệu là cần
thiết. Từ kết quả nghi n cứu đã chỉ r rằng: để tạo vật liệu khởi đầu in vitro
cây Lô hội n n sử dụng mẫu ở vụ xuân, khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7
phút cho hiệu quả khử trùng c o (68,5%). Môi tr ờng MS bổ sung 2,5 mg/l
BAP cho hệ số nhân c o (5,3 lần/ 3 tuần), chất l ng chồi tốt. Bổ sung th n
hoạt t nh 1,5 - 2,0 g/l cho khả năng r r đạt c o nhất. Tỷ lệ r r đạt 100%,
chất l ng r tốt. Giá thể r cây Lô hội invitro th ch h p là cát mịn, tỷ lệ sống
cao (81,4%), cây sinh tr ởng phát triển tốt. Thời vụ không ảnh h ởng đáng kể
đến hiệu quả r cây Lô hội in vitro [20].
Trong y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, bổ
g n thận, ch tinh huyết, tăng lực, chữ đ u mỏi chân t y, tóc khô h y rụng,
sớm bạc, làm đen tóc và kéo dài tuổi thọ, mặt khác, giúp cho sự sinh tr ởng

phát dục củ cơ thể di n r thuận l i hơn. Hoàng Thị Kim Hồng (2011) đã
nghi n cứu; môi tr ờng MS có bổ sung BAP 4,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l k ch
th ch đoạn thân củ chồi in vitro cây hà thủ ô đỏ tái sinh cụm chồi tốt nhất,
với trung bình 8,54 chồi tr n một mẫu. Các đoạn thân in vitro này cũng có
khả năng tạo cụm chồi tốt tr n môi tr ờng có BAP 4,0 mg/l và NAA 0,2 mg/l
hoặc BAP 0,5 mg/l và NAA 0,3 mg/l nh ng một số mẫu còn có khả năng


21

phân hóa thành c llus. Chồi đơn tách từ cụm chồi in vitro tạo r , sinh tr ởng
và phát triển tốt tr n môi tr ờng MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l 8].
Phùng Văn Ph , Nguy n Thị Hồng Gấm, Nguy n Trung Thành (2010),
đã nghi n cứu nhân giống in vitro cây l n Kim tuyến. Đỉnh sinh tr ởng và
đoạn thân m ng chồi nách (2,0 - 3,0 cm) củ cây tự nhi n đ c khử trùng
bằng HgCl2 0,1% thời gi n khử trùng là 10 phút là th ch h p nhất,cho tỷ lệ
mẫu sống 86,1% đối với đỉnh sinh tr ởng và 84,77% với đoạn thân m ng chồi
nách. Với mẫu là quả l n Kim tuyến (40 ngày tuổi) khử trùng bằng HgCl2
0,2% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống c o nhất, đạt 75,62%. Môi tr ờng MS
cơ bản bổ sung 1,0 mg/l kinetin th ch h p cho đỉnh sinh tr ởng và đoạn thân
m ng chồi nách tái sinh chồi s u 8 tuần nuôi cấy (khoảng 1,42 chồi/đỉnh sinh
tr ởng;1,5 chồi/đoạn thân) và th ch h p cho hạt l n nảy mầm đạt tỷ lệ 88,3%
s u 12 tuần nuôi cấy.Cụm protocorm (2,0 × 2,0 mm) s u khi hình thành từ hạt
đ c cấy chuyển l n môi tr ờngMS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho 5,62
chồi/ cụm protocorm s u 12 tuần nuôi cấy. Đoạn thân (1,0 - 2,0 cm) từ chồi in
vitro nhân chồi tốt nhất tr n môi tr ờng MS cơ bản cóbổ sung 1,0 mg/l
kinetin và 0,3 mg/l NAA, đạt 4,6 chồi/mẫu s u12 tuần nuôi cấy. Chồi in vitro
tạo r tốt nhất tr n môi tr ờng MS cơ bản có bổ sung 0,3mg/l NAA đạt 3,1
r /chồi s u 8 tuần nuôi cấy. Cây in vitro hoàn chỉnh s u khi huấn luyện đ c
trồng tr n giá thể với tỷ lệ sống sót 70% 16].

Hoàng Xuân Chiến và cộng sự (2011), đã tiến hành nghi n cứu một số
yếu tố tạo củ sâm ngọc linh (Panax Vietnamensis Ha Et Grushv.) in vitro và
xác định hàm l ng s ponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc
Linh. Kết quả thu đ c; Các phức h p củ GA3/BAP và auxin/cytokinin trong
quá trình hình thành củ cũng đã đ c khảo sát, nồng độ BAP th ch h p nhất
cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l; GA3 ức chế khả năng tạo củ in vitro cây sâm
Ngọc Linh; Các chồi cây sâm Ngọc Linh in vitro đ c cảm ứng để tạo củ
thành công tr n môi tr ờng SH có bổ sung NAA 1,0 mg/l và BAP 2,0 mg/l
trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Nồng độ đ ờng s cch rose tốt nhất
cho quá trình tạo củ sâm là 50 g/l. Hàm l ng s ponin trong củ củ những cây
17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhi n cũng đã đ c xác định là G-Rb1
(0,21%), G-Rg1 (0,17%), MR2 (0,77%) [2].


22

CHƢƠNG II
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu là cây đinh lăng lá nhỏ đ ng đ c nuôi trồng tại Viện Kho
học Sự sống, Đại học Thái Nguy n và chồi ngọn đ c sử dụng làm vật liệu
nuôi cấy để nhân giống.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các nghi n cứu đ c thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào – Viện
Kho học Sự sống – Đại học Nông Lâm Thái Nguy n
Từ tháng 01/2016 đến 12/2016
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghi n cứu kỹ thuật vô trùng tạo vật liệu b n đầu cho

nhân giống.
- Nội dung 2: Nghi n cứu kỹ thuật nhân nh nh cụm chồi giống Đinh
lăng.
- Nội dung 3: Nghi n cứu kỹ thuật r r cho chồi nuôi cấy để tạo cây
Đinh lăng hoàn chỉnh trong phòng th nghiệm.
- Nội dung 4: Nghi n cứu giá thể phù h p cho cây Đinh lăng in vitro
phát triển tốt trong điều kiện v ờn ơm.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô trùng tạo vật liệu ban
đầu cho nhân giống.
Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu
 Vật liệu khử trùng: Đoạn thân chứ chồi đỉnh và chồi b n.
Ph ơng pháp xử lý mẫu: i) Chồi non cây đinh lăng cắt bỏ lá, rử sạch
d ới vòi n ớc; (ii) Cắt thành các đoạn thân chứ 1-2 mắt ngủ, lắc sạch bằng
xà phòng; (iii) Đ đoạn thân vào tủ cấy vô trùng tráng qu 1 lần n ớc vô
trùng; (iv) Tráng đoạn thân qu một lần cồn 700 trong 30 giây; (v) Lắc đoạn
thân trong hó chất khử trùng với thời gi n khử trùng theo nội dung từng công


23

thức cụ thể; (vi) Tráng đoạn thân qu 4 – 5 lần n ớc cất vô trùng; (vii) Cắt bỏ
h i đầu tiếp xúc với hó chất củ đoạn thân rồi cấy vào môi tr ờng nuôi cấy.
 Hoá chất khử trùng: H2O2 và HgCl2
 Môi tr ờng nuôi cấy: MS (Mur shige & Skoog , 1962) 28 , bổ
sung 30 gram Saccharose/lít; 6 gram agar/lít; 100 mg Myo-Inositol/l, pH =
5,8.
 Th nghiệm đ c bố tr theo kiểu ngẫu nhi n hoàn toàn gồm 9 công
thức, mỗi công thức với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 30 mẫu, mỗi bình cấy 1-2
mẫu, 90 mẫu/công thức.

* Các thí nghiệm tiến hành
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng (H202
nồng độ 20%; HgCl2 nồng độ 0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu
Hóa chất

Công thức thí
nghiệm
CT1

Không xử lý

CT 2

5 phút
10 phút

CT 3
CT 4

Thời gian

H2O2 nồng độ 20%

15 phút

CT5

20 phút

CT 6

5 phút

CT 7

10 phút

CT 8

HgCl2 nồng độ 0,1%

CT9

15 phút
20 phút

* Các chỉ tiêu theo dõi ( theo dõi sau 20 ngày)
+ Tỷ lệ mẫu sạch:
Tổng số mẫu sạch
 100

Tỷ lệ mẫu sạch (%) =
Tổng số mẫu nuôi cấy


24

+ Tỷ lệ mẫu tạo chồi
Tổng số mẫu tạo chồi
 100

Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) =
Tổng số mẫu nuôi cấy

2.2.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi
giống Đinh lăng.
Các chồi sinh tr ởng và phát triển bình th ờng có đầy đủ thân lá (Chú
ý là không bị dị dạng) đ c sử dụng làm vật liệu cấy chuyển s ng môi tr ờng
nhân nh nh. Trong gi i đoạn này tiến hành nghi n cứu ảnh h ởng củ các
chất điều tiết sinh tr ởng (BAP hoặc kinetin, IAA, IBA) đến hệ số nhân củ
chồi cây đinh lăng lá nhỏ. Môi tr ờng nền đ c sử dụng là MS bổ sung 30
gram Saccharose/lít; 6 gram agar/lít; 100 mg Myo-Inositol/l, pH = 5,8.
 Mỗi th nghiệm gồm 5 công thức đ c bố tr theo kiểu ngẫu nhi n
hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 20 mẫu , mỗi bình cấy 6-7 mẫu, 60 mẫu/
1 công thức.
* Các thí nghiệm tiến hành:
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả
nhân chồi
Công thức thí nghiệm

Nồng độ Kinetin (mg/l)

CT 1

0,0

CT 2

1,0

CT 3

2,0

CT 4

3,0

CT 5

4,0

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi
Công thức thí nghiệm

Nồng độ BAP (mg/l)

CT 1

0,0

CT 2

1,0

CT 3

2,0

CT 4

3,0

CT 5

4,0


25

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến
hiệu quả nhân chồi
Nồng độ IAA

Công thức thí nghiệm

Nồng độ (mg/l)

CT 1

BAP

0

CT 2

BAP

0,1

CT 3

BAP

0,2

CT 4

BAP

0,3

CT 5

BAP

0,4

(mg/l)

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BAP và
IBA đến hiệu quả nhân chồi
Nồng độ IBA

Công thức thí nghiệm

Nồng độ (mg/l)

CT 1

BAP

0

CT 2

BAP

0,1

CT 3

BAP

0,2

CT 4

BAP

0,3

CT 5

BAP

0,4

(mg/l)

* Các chỉ tiêu theo dõi ( theo dõi sau 60 ngày)
Tổng số chồi tạo thành
+ Hệ số nhân chồi (lần) =
Tổng số chồi nuôi cấy
Tổng chiều c o chồi
+ Trung bình chiều c o chồi(cm) =
Tổng số chồi theo dõi
+ Đặc điểm chồi
2.2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để
tạo cây Đinh lăng hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm