Vector

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC THÁI NGUYÊN
BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG
BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG
VECTOR
SV THỰC HIỆN: NGUYỄN HOÀNG LINH
NGUYỄN HỮU HOÀN
NGÔ MẠNH LINH
GV HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
VECTOR
1. KHÁI NIỆM
2. CÁC ĐẶC ĐIỂM
3. ỨNG DỤNG
4. CÁC BƯỚC CHÍNH TRONG TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP
5. CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG
6. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CHO VECTOR BIỂU HIỆN GEN
7. THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
I. KHÁI NIỆM
I. KHÁI NIỆM

Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ
cho phép cài ( gắn) các đoạn DNA cần
thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự
phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào
chủ qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ
gen của tế bào chủ.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
II. CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA VECTOR
II. CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA VECTOR

•
Có trình tự ori (origin)
•
Có trình tự nhận biết của RE
•
Có trình tự điều hòa
(promotor)
•
Có các gen đánh dấu(marker
gen )
•
Đảm bảo sự di truyền bền
vững của DNA tái tổ hợp và
không gây biến động cho tế
bào chủ
•
Ngoài ra còn cần một số yếu
tố và trình tự cần thiết khác
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
III. ỨNG DỤNG
III. ỨNG DỤNG


•
Tạo dòng và khuếch đại
•
Nghiên cứu về sự biểu hiện của một trình tự
DNA
•
Chuyển gen

•
Sản xuất RNA
•
Sản xuất protein
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
IV. CÁC BƯỚC TRONG TẠO DNA TÁI TỔ HỢP

Qua 3 bước chính:
B1: Tách DNA plasmid và
DNA tế bào cho.
B2: Cắt DNA plasmid và
DNA tế bào cho cùng một
loại emzim giới hạn.
B3: Nối DNA plasmid và DNA
tế bào cho nhờ enzim nối
ligase tạo thành vector
tái tổ hợp.
TÕ bµo cho Vi khuÈn
ADN
Plasmit
Enzim c¾t
Enzim c¾t
Enzim nèi
Plasmit t¸i tæ hîp
TÕ bµo nhËn E.Coli
ADN
V. CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG
V. CÁC LOẠI VECTOR THƯỜNG DÙNG
•

Plasmid
•
Cosmid
•
Phage λ
•
Nhiễm sắc thể nhân tạo
•
Ti plasmid
•
Vector ở nhiễm sắc thể nhân chuẩn
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1. Vector là plasmid
1. Vector là plasmid

plasmid: - Khái niệm.
- Tên gọi.
- Phân loại.
- Tạo dòng.
- Biến nạp
1.1 Khái niệm
Plasmid là DNA xoắn kép dạng vòng có kích thước
nhỏ, tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men.
1.2. Tên gọi:
+ p : viết thường (plasmid).
+1 hoặc 2, 3 chữ tiếp theo chỉ tên tác giả phát
hiện hoặc tên vi khuẩn chứa plasmid.
+ Số thứ tự chỉ chủng vi khuẩn.
VD: pBR322. (B- Bolivar, R- Rodriguez)
KỸ THUẬT DI TRUYỀN

KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1.3. Phân loại: Plasmid đã được cải tiến qua 3 thế hệ.


Plasmid thế hệ thứ nhất: Là các plasmid tự
nhiên và nay hầu như không còn sử dụng.

Plasmid thế hệ thứ hai, thứ ba: là những
plasmid được cải tiến, mang các gen
đa cắt nối (Polylinker) hoặc gen chỉ thị.



Plasmid thế hệ thứ 2:
Plasmid thế hệ thứ 2:
pBR322
pBR322
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Mang gen kháng thuốc Amp và Tet, có trình tự khởi đầu sao
chép (ori) và một số trình tự RE.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Hiện nay được sử dụng với 3 nhóm chính:
Nhóm pUC
Nhóm pGEM
Nhóm pBluescrip

Plasmid thế hệ thứ 3:
Plasmid thế hệ thứ 3:
Là các plasmid đa năng
Là các plasmid đa năng

(poly linker) và chuyên dụng
(poly linker) và chuyên dụng



NHÓM pUC
NHÓM pUC
•
Có kích thước 2,6kb.
•
Mang gen kháng Amp .
•
Chứa một phần gen Lac Z’.
•
Có chứa poly linker.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN



Nhóm pGEM
Nhóm pGEM
•
Có kích thước 3 kb.
•
Mang đầy đủ các trình
tự của pUC.
•
Mang promotor
đặc trưng cho RNA
polymerase (SP6. T7)

pGEM – T Easy
KỸ THUẬT DI TRUYỀN



Nhóm plasmid pBluescript
Nhóm plasmid pBluescript
•
Có kích thước khoảng 3kb
•
Có ưu thế nhất, kế hợp
được tất cả các ưu điểm
của 2 loại trên
pBluescript II
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
1.4. TẠO DÒNG TRONG PLASMID

Nguyên tắc: DNA của plasmid được cắt bằng RE và
nối in vitro với đoạn DNA ngoại lai tạo ra các plasmid tái
tổ hợp, sau đó chúng được dùng để biến nạp vào vi
khuẩn.

Phương thức tạo dòng. Một số phương thức được
dùng để phân biệt giữa các thể̉ tái tổ̉ hợp và tái tạo lại
vòng như sau:
–
Khử hoạt tính bằng chèn đoạn .
–
Tạo dòng định hướng.

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

Tạo dòng theo phương thức khử hoạt tính
bằng chèn đoạn
KỸ THUẬT DI TRUYỀN



Tạo dòng định hướng
Tạo dòng định hướng
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Hệ thống chuyển gen bằng
xung điện
1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn (tế bào vật
chủ)
Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E. coli
. Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp
vào E. coli là:

Điện biến nạp. Dùng xung điện làm thủng lỗ tạm
thời màng tế bào.

Hóa biến nạp. Dùng CaCl2.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
2. Vector là cosmid
2. Vector là cosmid

Cosmid là vector được thiết kế từ plasmid và đầu cos
của phage λ
1. Các đặc điểm chính vector cosmid

 Một gen kháng kháng sinh và một origin khởi đầu của
plasmid
 Các plasmid mạnh có thể được gắn thêm đoạn đa cắt
nối (Polylinker)
 Kích thước nhỏ cho phép các đoạn DNA eukaryote dài
khoảng 45 kb có thể thích ứng.
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Cosmid: vector pWEB-TNC
3. Các vector phage
3. Các vector phage λ



Cấu trúc: - Phage λ là DNA mạch thẳng dài 50kb .
- Hai đầu là mạch đơn bổ sung với 12
nucleotid mang trình tự cos.
- Có đoạn giữa 20 kb không mang chức
năng

VD: EMBL 3, EMBL 4.

Ưu điểm: - Có thể mang đoạn DNA có kích thước
lớn (15_23kb).
- Có hệ thống gen xâm nhập.
- Có thể tạo nên số lượng lớn .
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Tạo dòng trong phage
Tạo dòng trong phage λ:
•

Nguyên tắc: Vùng DNA không mang chức năng
(stuffer) của phage λ được cắt bỏ và nối in vitro 2
nhánh của chúng với các đoạn gen ngoại lai có kích
thước khoảng 20 kb.
•
Các bước tạo dòng:
- Tinh sạch DNA phage λ sau khi đã được cắt bởi RE
- Các nhánh phải và trái được liên kết với DNA ngoại
lai với trình tự bổ sung
- Xác định DNA ngoại lai nằng phương pháp lai axit
nucleic
- Tinh sạch và chọn tế bào chủ phù hợp
KỸ THUẬT DI TRUYỀN
4. Vector là nhiễm sắc thể nhân tạo
4. Vector là nhiễm sắc thể nhân tạo

Nhiễm sắc thể nhân tạo là vector được thiết kế
cho phép cài đoạn DNA insert với khich thước lớn

Phân loại: thường được sử dụng với hai loại:
Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn BAC
Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men YAC
KỸ THUẬT DI TRUYỀN


4.1. BAC ( Bacteria Artificial Chromosom)
4.1. BAC ( Bacteria Artificial Chromosom)

CẤU trúc: - Được thiết kế dựa trên cơ sở plasmid F-factor
- Mang đoạn ori, các gen chỉ thị đặc hiệu, đoạn

đa cắt nối (Polylinker) và promotor đặc hiệu, gen kháng
kháng sinh

Ưu điểm: Ổn định.
Dễ biến nạp
Dễ tinh sạch
Tốc độ sinh trưởng trong vật chủ E. coli cao
Cho phép gắn đoạn DNA insert có kích thước
từ 100_ 300 kb
KỸ THUẬT DI TRUYỀN