phát hiện tần suất thiếu hụt g6pd ở dân tộc tày và dân tộc nùng bằng phương pháp bán định lượng formazan

Đặt vấn đề
Glucose 6 phosphatdehydrogenase (G6PD) là một enzym ôxy hoá khử, là
một enzym then chốt trong quá trình chuyển hoá Glucose theo con đờng Hexose
monophosphate trong hồng cầu. Con đờng này chỉ tạo ra năng lợng không đáng
kể (10%glucose tham gia vào con đờng này) nhng lại đảm nhiệm hai chức năng
quan trọng là cung cấp ribose cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotid, acid
nucleic và đặc biệt tạo ra một chất khử vô cùng quan trọng là NADPH. Chất
này có khả năng chống lại tác nhân gây oxy hóa, loại bỏ H
2
0
2
, giúp bảo vệ cho
màng hồng cầu đựơc bền vững, bảo vệ cấu trúc của Hemoglobin, cấu trúc của
các enzym có trong hồng cầu để duy trì sự sống cho tế bào hồng cầu.
Bệnh thiếu hụt G6PD là một trong những bệnh lý hay gặp nhất của hồng
cầu. Cơ sở di truyền học của bệnh này là đột biến gen nằm trên đầu mút tận
cùng nhiễm sắc thể X ở đoạn q với các dạng đột biến khác nhau (nh
Gâoh,Viangchan ) Các dạng đột biến khác nhau có thể tạo những mức độ thiếu
hụt G6PD khác nhau và gây ra những biểu hịên lâm sàng khác nhau. Đây là
bệnh di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X không có alen tơng ứng
trên Y nên gặp nhiều ở nam hơn ở nữ,bệnh mang tính di truyền do đó biểu hiện
khác nhau ở những dân tộc khác nhau. Các nghiên cứu gần đây cho thấy những
biểu hiện lâm sàng của bệnh cũng đa số xuất hiện do sử dụng các biện pháp
điều trị nh thuốc hay sử dụng thức ăn có tính oxy hoá, do vậy ở vùng lãnh thổ
khác nhau do tập quán sinh hoạt, thói quen và đặc điểm bệnh tật khác nhau nên
tỷ lệ thiếu hụt của enzym này cũng thay đổi. Việt Nam là một trong những nớc
nằm trong bản đồ thiếu hụt G6PD, với tỷ lệ mắc bệnh tơng đối cao.
Thiếu G6PD thờng có những biểu hiện tan máu gây vàng da, đái huyết sắc
tố, thiếu máu, suy thận cấp và trờng hợp nặng là tử vong. Bệnh xuất hiện khi tiếp
xúc với các tác nhân gây oxy hoá nh vi sinh vật, hoá chất (thuốc, thực phẩm).
Ngời bình thờng với số lợng và chất lợng G6PD đảm bảo thì khi tiếp xúc với

hàm lợng cao chất oxy hoá thì vẫn có khả năng sản xuất ra đủ NADPH để loại
bỏ tác động của chúng và sẽ không có những biểu hiện lâm sàng trên. Tròng
1
hợp thiếu hụt nặng enzym thì hay gây ra những cơn tan máu cấp kể cả khi sử
dụng rất ít chất õy hoá, nhng cũng có tròng hợp do sử dụng một lợng chất oxy
hoá tuy ít nhng kéo dài sẽ dẫn đến hiện tọng không đủ enzym để tham gia quá
trình khử, đây chính là hiện tợng thiếu enzym thứ phát.
Bởi vậy việc phát hiện ra sự thiếu hụt G6PD là rất quan trọng. Qua sự phát
hiện bằng những phong pháp định tính, định lợng chúng ta có thể biết đợc mức
độ suy giảm để có đợc kế hoạch điều trị cũng nh cách thức sinh hoạt hợp lý
nhằm hạn chế thấp nhất sự biểu hiện của bệnh. Sử dụng phơng pháp bán định l-
ợng tạo vòng Formazan với u điểm nhanh chóng, đơn giản sẽ giúp cho chúng ta
phát hiện đợc sự thiếu hụt này một cách đồng loạt và có hiệu quả.
Tôi tiến hành làm khoá luận tốt nghiệp về đề tài:
"Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng
bằng phơng pháp bán định lợng Formazan."
Với hai mục tiêu sau đây:
- Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan.
- Sử dụng kỹ thuật bán định lợng Formazan để phát hiện tần suất
thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và Nùng.
2
Chơng 1: Tổng quan tài liệu
1. Những hiểu biết về G6PD:
1.1.Đại cơng:
G6PD đợc Warburg và Christan phát hiện năm 1931 ở hồng cầu ngạ,
động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu ngời. Năm 1936 G6PD đã đợc nghiên
cứu và tiến hành chiết suất làm sạch nhng phải 25 năm sau mới thành công. Bớc
đầu nghiên cứu enzym đã đựơc tìm hiểu về cấu trúc phân tử, dạng có hoạt tính
sinh học, các dạng biến thể của enzym. Quá trình tách chiết enzym ra khỏi hồng
cầu cũng ngày càng đạt đợc độ tinh sạch cao hơn, trải qua các bớc nh điện di,

phơng pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực độ tinh sạch của enzym đã đạt
đựơc tới 1448,2 lần [2]. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử các dạng
đột biến của G6PD ngày càng đợc phát hiện nhiều, các phơng pháp phát hiện
thiếu hụt từ định lợng, định tính, bán định lợng, test nhanh ngày càng đợc phát
triển chính xác hơn và áp dụng rộng rãi hơn trong cộng đồng.
1.2.Cấu trúc:
Cấu trúc bậc một (monomer): là chuỗi polypeptid gồm 515 acid amin
liên kết với nhau bằng những liên kết peptid (nhóm cacboxyl(-C00H) của acid
amin trớc sẽ liên kết với nhóm amin (-NH
2
) của acidamin sau bằng cách chung
nhau mất đi một phân tử nớc). Trọng lợng phân tử của enzym nặng 59265
Daltons. Trình tự acid amin đã đợc giải mã, tính đồng nhất của trình tự này thay
đổi tuỳ theo từng vùng. Vùng có tính đồng nhất cao đợc cho là vùng có chức
năng quan trọng (hay còn gọi là trung tâm hoạt động) của enzym, ở ngời vùng
này thuộc acidamin 188-291.
Cấu trúc bậc cao hơn:
G6PD có cấu trúc không gian là pôlymer, đó là các dạng dimer, tetramer,
hexamer. Dạng cấu trúc không gian mới đảm bảo cho enzym hoạt động đợc.
Trong hồng cầu ngời thì dạng dimer chiếm u thế hơn. Các cấu trúc bậc 1, bậc
cao hơn có sự chuyển dạng lẫn nhau tuỳ vào điều kiện của môi trờng, nh ở pH
thấp thì chủ yếu là dạng tetramer, pH gần trung tính thì là dạng dimmer, ở pH
3
trung tính thì hai dạng đó gần bằng nhau. G6PD là một enzym không đồng nhất
và đa dạng phân tử, bằng phơng pháp hoá sinh WHO đã mô tả có 442 dạng khác
nhau [1,3].


Hình 1: cấu trúc bậc bốn của G6PD
1.3.Chức năng:

G6PD là một enzym oxy hoá khử xúc tác phản ứng chuyển hoá đầu tiên
của chu trình Pentose( chu trình Hexomonophosphate), có ký hiệu quốc tế là:
1.1.49. Chức năng quan trọng của nó là tạo ra NADPH để chống lại các tác
nhân oxy hoá và vì vậy trong hồng cầu nó ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ màng
hồng cầu đơc bền vững, đảm bảo thời gian tồn tại trong máu ngoại vi của hồng
cầu là khoảng 120 ngày nhằm đáp ứng nhu cầu ôxy của cơ thể.
Chu trình Hexomonophosphate ( pentosephosphat)
Sự oxy hóa glucose theo con đờng Hexomonophosphate xảy ra ở các mô
song song với con đờng đơng phân song chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều (7%-10%).
Tuy nhiên ở một số tế bào nh: hồng cầu, gan, tuyến mỡ, tuyến sữa thời kì hoạt
động Sự thoái hóa glucose theo con đờng này chiếm u thế xảy ra trong phần
dịch bào của tế bào.
+ G6P đợc tạo ra qua sự phosphorin hóa Glutathion dới tác dụng của enzym
Hexokinase
+ G6P bớc vào con đờng Pentose qua 2 giai đoạn:
4
Giai đọan 1: khử cacboxyl oxy hóa G6P thành pentose phosphat, quá trình này
tạo ra NADPH
2
ở một số tổ chức con đờng pentose dừng tại đây và phơng trình
tổng quát là:
G6P + 2NADP
+
+ H
2
O > R5P + CO
2
+ 2NADPH + 2H
NADPH dùng cho các phản ứng sinh tổng hợp, còn R5P là tiền chất tổng hợp
Nucleotid.

Giai đoạn 2: biến hóa tiếp tục của pentose phosphat có sự vận chuyển các đơn vị
2C hoặc 3C dới tác dụng của các enzym tơng ứng là fructose 6 phosphat và 1
phân tử phospho glyconat:
6 G6P + 12NADP
+
+ 6 H
2
O > 5G6P +12 NADPHH
+
+ 6CO
2
+ Pi
Đây là giai đoạn oxy hóa ở những tổ chức cần nhiều NADPH hơn R5P thì
các pentose phosphat đợc đi vào chu trình biến hóa thành G6P để tiếp tục oxy
hóa nhờ sắp xếp lại khung C mà 6 phân tử pentosephosphat trở thành 5 Hexo
phosphat.
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase
Glucose-6-phosphat 6-phosphogluconolacton
Mg
2+

NADP
+
NAPDH +H
+
Lactonase
6-phosphogluconat
NADP
+

Mg
2+
6-phosphogluconate
dehydrogenase
NADPH+ H
+
Ribulose-5-phosphat
Phosphopentose
isomerase
D-Ribose-5-phosphat ( 5C)
Hình 2: giai đoạn 1 của chu trình Hexomonophosphate
5
5C 7C 6C
5C 3C 4C 6C
5C 3C
6C
5C 3C
5C 3C 4C 6C
5C 7C 6C
H×nh 3: giai ®o¹n 2 cña chu tr×nh Hexomonophosphate
Glutathion
reductase
H×nh 4: S¬ ®å ho¹t ®éng cña G6PD
6
Glucose
Glucose 6
phosphate
ATP
ADP
6phosphogluconat

G6PD
NADP+
NADPH
+
+hHHHH
Glutathion d¹ng
OXH(G-S-S-G)
Glutathion d¹ng
khö (2G-SH)
Hexokinase
Glutathion peroxydase
MetHb
Hb
Thông qua quá trình photphoryl hóa tạo thành G6P qua xúc tác của G6PD để tạo
ra sản phẩm 6PG đồng thời tạo thành NADPH từ NADP
+
là chất cung cấp H
+
để
khử Glutathion dạng oxy hóa thành dạng khử thông qua enzym Glutathion
reductase để từ đó trực tiếp bảo vệ hồng cầu chống lại các tác nhân gây oxy hóa
ngoài ra còn khử MetHb thành Hb do đó tránh đợc sự biến tính Hb.Nếu không
đủ G6PD thì lợng NADPH không đủ dẫn đến màng hồng cầu diễn ra quá trình
peroxy hóa lipit dẫn đến hiện tợng vỡ hồng cầu gây ra tan máu và Hemoglobin
sẽ bị kết tủa thành thể Heinz
1.4.Các yếu tố ảnh hởng đến cấu trúc và hoạt động sinh lý của G6PD:
Một số tính chất chung của enzym:
Enzym là những chất xúc tác sinh học bản chất là prôtêin do cơ thể sống
sinh ra nhờ đó mà các phản ứng hóa học trong cơ thể sống xảy ra với tốc độ rất
nhanh trong điều kiện sinh lý bình thờng: nhiệt độ, áp suất không cao, pH môi

trờng gần nh trung tính. Có những enzym chỉ là những prôtêin đơn thuần nhng
cũng có những enzym có thành phần cấu tạo gồm có 1 thành phần là prôtêin đơn
thuần (Apoenzym) và một thành phần là chất hữu cơ đặc biệt (chất cộng tác
cofactor hay coenzym).
Ngoài ra còn cần đến sự có mặt của các ion kim loại trong cấu trúc của
enzyme, là thành phần để liên kết enzym và cơ chất, liên kết apoenzym và
coenzym. Vị trí diễn ra phản ứng của enzym là trung tâm hoạt động có tính chất
đặc hiệu đối với từng cơ chất cấu trức và hoạt tính của enzym chịu tác động của
rất nhiều yếu tố khác nh: nhiệt độ, pH muối kim loại nặng, chất hoạt hóa và ức
chế hay các dung môi hữu cơ nh rợu, axeton Mỗi một cơ chất enzym có một
Km xác định, đây chính là hằng số Michailis-Menten: là nồng độ của cơ chất
(mol/lit) đủ làm cho tốc độ phản ứng enzym đạt tới một nửa tốc độ cực đại
(Vmax). Km thể hiện ái lực của enzym tới cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực càng
lớn và ngợc lại.
Có 6 loại enzym: enzym oxy hoá -khử (oxidoreductase), enzym vận chuyển
nhóm (Transferase), enzym thuỷ phân (Hydrolase), enzym phân cắt (lyase),
7
enzym chuyển đồng phân (Isomerase), enzym tổng hợp (Ligase). G6PD là
enzym oxy hoá khử.
Những điều kiện ảnh h ởng đến hoạt động của G6PD:
+ Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 40C, đến 60C thì hoạt tính của
enzym còn lại không đáng kể.
+ Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer nhiêù và enzym sẽ
hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lợng nhỏ NaHCO
3
sẽ giúp enzym phản
ứng tốt hơn. pH tối u của G6PD là 8,0 [2]
+ Nồng độ của của các chất nội bào nh cơ chất, cofactor, chất tạo thành:
tuân theo quy luật của các phản ứng hoá học khác. Sự trùng hợp của enzym từ
dạng monomer sang dạng dimer và các cấu trúc bậc cao hơn cần có sự có mặt

của NAPD+, chất vừa là cơ chất vừa là cofator. Mỗi dimer có 2 vị trí gắn
NADP+, đó là NADP+ xúc tác, gắn lỏng lẻo và dễ dàng bị khử thành NADPH,
còn lại là NAPD+ chức năng gắn chặt chẽ hơn cần thiết để duy trì cấu trúc hoạt
động của enzym.
+Khi ở ngoài cơ thể thì để đảm bảo cho enzym hoạt động đợc tốt thì vấn đề
bảo quản là hết sức quan trọng G6PD là một enzym mất nhạy cảm, không bền
vững, nhng nếu hồng cầu đợc rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dung dịch NaCl
0,9% ở nhiệt dộ lạnh (4
0
C) ngay sau 24h thì hoạt độ enzym cha bị thay đổi. Trái
lại chỉ bảo quản theo tiêu chuẩn máu thì sau 24h sẽ giảm 17% hoạt tính.
+Ion Mg
2+
là ion đặc hiệu cho hồng cầu ngời, với nồng độ 0,01 mol/l thì
hoạt độ enzym là 100%[2], theo nghiên cứu thì ion kim loại này đóng vai trò tạo
phức hợp giữa enzym và cơ chất.
1.5 Cơ sở di truyền học của G6PD
Gen quy định cấu trúc của G6PD nằm trên nhánh dài, locus q28 của nhiễm
sắc thể X (vùng 2, băng 8) không có alen tơng ứng trên Y. Vùng 2 là vùng mang
thông tin di truyền mã hóa khá nhiều tính trạng khác nh: nhìn màu, hemophilia
A.
8
Gen G6PD gồm có 13 exon và 12 intron. Dài khoảng 18,5 kilobases. Chức
năng của từng exon khác nhau, và kích thớc của các exon mã hóa thay đổi rất
nhiều từ 38 - 236 bp. Trong đó exon 1 không mã hoá [12], exon 6 mã hoá sản
phẩm là nơi gắn cơ chất G6P [6]. mARN G6PD gồm 2269 ribonucleotid, m
RNA của G6PD có một đoạn đầu 3' không mã hóa dài 655 bp và đoạn đầu 5'
không mã hóa dài 69 bp.
Gen G6PD có sự điều hòa và kiểm soát chặt chẽ. Vùng promotor của G6PD
kéo dài khoảng 300 nucleotid giầu GC và nhiều GC không bị methyl hóa.

2. Bệnh lý thiếu hụt G6PD.
2.1.Cơ chế bệnh sinh và cơ sở di truyền học:
2.1.1. Cơ chế bệnh sinh :
Giảm G6PD sẽ giảm lợng Glutathione dạng khử không đủ để khử HbH
2
O
2
tạo thành Met Hemoglobin và Choleglobin do đó Hemoglobin bị biến tính và
kết tủa thành thể Heinz [2][9].
Cơ chất tạo ra là NADPH còn có tác dụng bảo vệ nhóm -SH (nhóm chức
năng hoạt động) của enzym phosphoglyceral-dehydrogenase, đây là 1 enzym
quan trọng trong chuỗi phản ứng xúc tác NAD
+
thành NADH (một chất khử
quan trọng chống lại sự ôxy hóa của hồng cầu [2]).
Ngoài ra giảm NADPH dẫn đến hồng cầu phải sử dụng nhiều NADH
2
làm
giảm lợng ATP cần thiết và lợng Na
+
trong tế bào bị ứ đọng, nớc vào trong hồng
cầu nhiều cộng với sự bền vững của màng hồng cầu bị yếu dẫn đến hồng cầu bị
hủy hoại.
2.1.2 Bệnh lý gen học của thiếu hụt G6PD:
Giảm G6PD là bệnh di truyền gen hoặc nằm trên nhiễm sắc thể X không
alen tơng ứng trên Y do vậy tỷ lệ bị bệnh gặp ở nam giới là nhiều hơn và thờng
nặng hơn.
Nam giới XY: giả sử a là gen quy định tính trạng giảm G6PD sẽ có kiểu
gen là X
a

Y: ở nam giới chỉ cần ngời alen a ở X là có biểu hiện bị bệnh.
9
Nữ giới XX: có 3 dạng
X
A
X
A
: bình thờng.
X
A
X
a
: có thể bình thờng hoặc thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình, hiếm
khi thiếu hụt nặng (trừ phi ở vùng trung tâm hoạt động). Nguyên nhân là do sự
bất hoạt nhiễm sắc thể từ trong bào thai, trong quá trình phát triển của phôi tạo
ra thể khảm giữa dòng tế bào lành và dòng tế bào bệnh, tỷ lệ giữa 2 loại tế bào
này thay đổi rất lớn: tế bào giảm G6PD chiếm từ 1% -> 90%.
X
a
X
a
: biểu hiện kiểu hình thiếu nặng nhng tần suất gặp kiểu gen này rất
nhỏ.
Gen cấu trúc đột biến sẽ bây biến đổi về mặt chất lợng ngợc lại gen điều
hòa bị đột biến gây thiếu G6PD về mặt số lợng, nhng biến đổi ở intron không
gây biến đổi cấu trúc và sản lợng G6PD. Hoạt tính G6PD phụ thuộc vào cả chất
lợng và số lợng.
Ngày nay đã phát hiện đợc hơn 140 dạng đột biến khác nhau đại diện cho
442 biến thể khác nhau có tính chất đặc hiệu và phân biệt bằng các chỉ số sinh
hóa. Do 1 axit amin có thể đợc quy định bởi ngời bộ ba nên có khi 2 biến đổi

khác nhau trên AND chỉ gây nên một loại đột biến. Ví dụ nh:
- Dạng đột biến Aaches: đột biến nucleotid 1089C -> G
- Dạng đột biến Loma Linda: 1089C -> A hai loại này đều làm thay đổi
acid amin 363 Asn -> Lys.
Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những bệnh nhân lâm sàng
của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD ra làm 4 lớp:
+ Lớp 1: thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu, hồng cầu hình
không trò ngời mạn tính.
+ Lớp 2: Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzym < 10% so với bình thờng
+ Lớp 3: Thiếu G6PD vừa đến nhẹ.
(Hoạt độ từ 10 - 60% so với bình thờng).
+ Lớp 4: thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu G6PD (60 - 100%).
Tuy vậy nhng sự phân biệt này là không rõ ràng giữa các phân lớp.
Lớp 1, lớp 2 là gây nguy hiểm nhất vì thờng có tan máu cấp diễn.
10
Hiện nay ở Việt Nam đã tìm thấy đợc các dạng đột biến khác nhau, trong
đó có một dạng không làm ảnh hởng đến sự mã hóa acid amin trong cấu trúc
G6PD đó là dạng Silent tồn tại dạng còn lại đều là những dạng hay gặp ở các
dân tộc châu á. Dạng Silent xuất hiện là do đột biến thay nucleotid C thành
nucleotid T dẫn đến bộ ba mã hoá TAC chuyển thành TAT vẫn mã hoá acid
amin Tyrosin, đây cũng chính là một ví dụ cụ thể biểu thị tính bảo thủ của thông
tin di truyền.
Bảng 1: Một số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu á
STT
Dạng đột
biến
Vị trí biến đổi
Exon Nucleocid
1 Gaoha 2 95A - G 32 His -> Arg
2 Viangchan 9 871G -> A 291 Val -> Met

3 Chatham 9 1003G -> A 335 Sla -> Thr
4 Chinese - 5 9 1024 C -> T 342 leu - > Phe
5 Union 11 1360 -> T 454 Arg -> Cys
6 Canton 12 1376 G -> C 459 Arg -> Leu
7 Kaiping 12 1388 G -> A 463 Arg -> His
8 Silent 11 1311 C -> T TAC -> ATA -> Tyrosil
2.2. Dịch tế học.
Năm 1996 Blood Ernest Beutler đã phát hiện có 400 triệu ngời thiếu máu
G6PG gặp ở tất cả các dân tộc. Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ thiếu hụt
G6PD khác nhau tùy từng vùng và tùy từng dân tộc.
Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân thiếu G6PD hồng cầu, có tỉ
lệ cao tại một số vùng Sốt Rét Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Nh Xuân
(19,7%), tỷ lệ thiếu lại thờng thấp ở nơi không có lu hành bệnh sốt rét. ở dân tộc
Mờng (tỉ lệ cao nhất 31%) tiếp đến là dân tộc Thổ (19,3% dân tộc Thổ, dân tộc
Thái 19,3%) rất thấp ở dân tộc kinh 0,5%.
11
Hình 5: phân bố thiếu hụt G6PD trên thế giới
2.3. Biểu hiện lâm sàng
Thờng biểu hiện khi tiếp xúc với chất oxi hóa đó là những cơn tan máu.
Primaquine là một loại thuốc có tính o xi hoá cao nhng rất hay đợc sử dụng
trong điều trị sốt rét vì đây là thuốc duy nhất đợc sử dụng để diệt thể ẩn trong
gan với bệnh nhân nhiễm P.vivax và thể giao bào với bệnh nhân nhiễm
P.falciparum [6].
Tùy thuộc vào dạng thiếu hụt G6PD tùy vào tính chất hay nồng độ của
tính chất hay nồng độ của các chất oxi hóa sẽ dần dần tan máu nhiều hay ít từ
đó dần đến bệnh thiếu hụt nặng hay nhẹ.
2.3.1. Vàng da sơ sinh.
Vàng da sơ sinh là một triệu chứng của nhiều nguyên nhân khác nhau, là do
trong máu có sự gia tăng chất bilirubin, một sán phẩm dị hoá của hemoglobin.Vàng
da xuất hiện khi định lợng bilirubin trong máu ở ngời lớn là >2mg%, trẻ em là >7mg

%[8].
Dị hoá Hb ở hệ liên võng nội mô (75%) và từ nguồn khác(25%)
12
Hemoxygen Hệ liên võng nội mô
Biliverdin Bilirubin+albumin (máu)

Bilirubin+ligandin (gan)
Glucuronyl transferase
Bilirubin glucuronid (trực tiếp)
Bài tiết xuống ruột
Stercobiline, urobilinogen
Hình 6: Sơ đồ chuyển hoá của bilirubin.
Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và bệnh lý. Vàng da sinh lý thờng diễn ra
trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ, hiện tọng này là
do sự suy giảm nhất thời chức năng chuyển hoá bilirubin của gan do tăng quá trình táI
hấp thu bilirubin tại ruột, tăng thấm vào tổ chức. Trong khi đó chất này đợc sản sinh
hàng ngày ở giai đoạn sơ sinh nếu tính trên cân nặng lớn gấp đôi ngời lớn.Vàng da
bệnh lý thấy xuất hiện khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn 20mg/dl. Hậu
quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng nhân não. Trẻ sơ sinh sẽ có biểu hiện
là những cơn tăng trơng lực cơ, xoắn văn, mất các phản xạ sơ sinh, ngừng thở
tím tái và rất dễ tử vong. Nếu trẻ qua khỏi thì sẽ để lại những di chứng nặng nề
nh rối loạn ngoại tháp (múa vờn, múa giật, rối loạn ngôn ngữ) hoặc bất thờng
thính lực, thị giác và thiểu sản phát triển răng. Vàng da nhân não ảnh hởng đến
khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ. Việc phát hiện ra bệnh lý này
không khó và việc đIệu trị có kết quả rất nhanh chóng và dễ dàng bằng phơng
pháp chiếu đèn, thuốc làm giảm nồng độ bilirubin trong máu và hiệu quả nhất là
phơng pháp chiếu đèn. Nhng nếu để lâu, Bilirubin đã ngấm và các nhân xám của
não thì sẽ để lại hậu quả nặng nề không thể hồi phục lại đợc do tổn thơng các tế
bào thần kinh nh đã nêu trên.
Thiếu G6PD nh một yếu tố nguy cơ dẫn đến vàng da bệnh lý. Do đó việc

phát hiện thiếu hụt G6PD sẽ giúp cho quá trình phát hiện những triệu chứng
nặng giúp cho quá trình theo dõi tốt hơn tránh bỏ sót đáng tiếc.
13
Tỷ lệ vàng da dẫn đến vàng nhân não ở nớc ta còn rất cao. Năm 1996 -
2000: tại Viện Nhi Trung ơng tỷ lệ này khoảng 25%, tại bệnh viện Nhi Đồng I
thành phố Hồ Chí Minh phát triển từ 147 trờng hợp (1995) đến 238 trờng hợp
(1997).
ở những trẻ em bị thiếu hụt G6PD thì Bilirubin huyết thanh cao hơn đáng
kể so với nhóm chứng, cao hơn vào ngày thứ 3 sau sinh. Loại thiếu hụt G6PD
lớp 3 thờng biểu hiện vàng da sau sinh. Ví dụ: G6PD Aures thờng gây vàng da
với đột biến cao. Thiếu G6PD đợc di truyền đồng thời với đột biến gen VGI
1
A
1
(Gilbert) thì nguy cơ cao dẫn đến vàng da nhân.
2.3.2. Tan máu do dùng thuốc và do sử dụng một số thực phẩm.
Ernet Beutler phát hiện ra hiện tợng tan máu sau khi nghiên cứu một số
bệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét là Primaquin. Sau đó qua nghiên cứu ng-
ời ta đã khám phá ra rằng không chỉ pnimaquin mà sau sử dụng một số thuốc
khác cũng gây nên hiện tợng tan máu: Aspirin (thuốc giảm đau), Procainamide
(thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (diệt khuẩn) Triệu chứng tan máu dẫn
đến vàng da thờng xảy ra vào ngày thứ 2,3 sau khi dùng thuốc.
Ngoài ra hiện tợng tan máu còn đợc biết đến sau khi bệnh nhân sử dụng
một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao nh long não, rợu vang đỏ, các sản phẩm
từ đậu tơng, đậu nành và đặc biệt là các loại đậu Fava dẫn đến hội chơng
Favism.
Hội chứng favism: là bệnh lý thiếu máu tan máu đã đợc biết đến từ thời
Pythagoras. Ngời ta nhận thấy rằng sau khi ăn đậu Fava, thì một số ngời 24giờ
sau có thể xuất hiện hiện tợng tan máu có khi rất dữ dội. Sau đó nhiều nghiên
cứu cho thấy rằng tình trạng này liên quan đến thiếu hụt G6PD. Đa số các trờng

hợp xảy ra ở những cá thể thiếu G6PD nặng nhng đôi khi cũng thấy ở thiếu hụt
nhẹ. Ngợc lại cũng có trờng hợp thiếu mà không có bệnh sinh lý sau khi ăn đậu
Fava. Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây ra hiện tợng tan máu là
glucosidevicine và dividine. Aglycone của chúng đợc thay thế bởi prymidune
14
đến tổn thơng oxi hóa cho xu hớng oxi hóa tự phát ở những bệnh nhân này th-
ờng thấy Hemoglobin niệu trong vài ngày.
Về sau phát hiện đợc ngời do có giảm G6PD. Giảm G6PD nhẹ thờng bệnh
sinh lý nhẹ hơn do chỉ ở những hồng cầu già (do khối lợng enzyen G6PD ở hồng
cầu non). ở bệnh nhân nặng thì cả những hồng cầu non cũng không có đủ hàm
lợng G6PD, không có khả năng tự bảo vệ trớc các tác nhân oxi hóa gây nên hiện
thợng tan máu nặng dẫn đến đái ra huyết sắc tố có thể gây viêm thận hay suy
thập cấp mà biểu hiện lâm sàng là thoạt đầu có đái đỏ, về sau đau vùng thắt lng
hố thận dẫn đến vô niệu.
Các triệu chứng cận lâm sàng của bệnh nhân: Hemoglobin giảm dần đến
ngày 7 - 8 sau đó phục hồi dần đến ngày thứ 10 xuất hiện thể Heinz gắn trên bề
mặt hồng cầu đó là phần Protein và Hemoglobin bị biến chất gắn vào màng
hồng cầu gây nên hình thái bất thờng của hồng cầu và dẫn đến tan máu.
Hình7: Đậu fava
2.3.4.Các triệu chứng khác:
Tan máu do nhiễm trùng đái tháo đ ờng
Quá trình nhiễm trùng thờng kích hoạt tan máu. Đái tháo đờng giai đoạn
toàn phát sẽ khởi phát những đợt tan máu ở bệnh nhân.
Tan máu mạn tính hồng cầu hình không tròn di truyền.
Năm 1958 ngời ta tìm thấy rằng thiếu G6PD cũng có thể dẫn đến tan máu
mạn tính. Loại tan máu này thì thờng không xảy ra ở những loại đột biến hay
gặp nh G610A - G6PD med nhng lại hay gặp ở những đột biến có tần suất xuất
hiện nhỏ.
2.4. Biểu hiện cận lâm sàng
15

2.4.1 ở cơn tan máu cấp
Xét nghiệm máu: hồng cầu giảm, Hematocrit giảm, Hemoglobin giảm, soi
hồng cầu không cần nhuộm phát hiện đợc thể Heinz. Chính những tế bào này
chỉ nhìn thấy sau cơn tan máu cấp sau đó nó sẽ rời tuần hoàn nhanh, không nhìn
thấy sau 3 - 4 ngày, có vài tế bào đoạn và đã nhiễm sắc (hồng cầu lớn xanh
nhạt), có tế bào lới (thờng không đáng kể), 5 - 15%. Định lợng bilirubin qua da,
trong máu tăng.
Xét nghiệm nớc tiểu: Hemoglobin niệu (+), trụ hồng cầu (-)
2.4.2 Kỹ thuật tế bào:
Nghiên cứu sâu hơn bằng xét nghiệm hồng cầu có thể phát hiện 2 dòng
hồng cầu ở những ngời nữ dị hợp tử định lợng erzym ở 2 dòng hồng cầu thấy
khác nhau, một dòng thiếu hoàn toàn, một dòng không thiếu hoàn toàn đó là kết
quả của hiện tợng bất hoạt nhiễm sắc thể. Ví dụ: Ditk Roos nghiên cứu một
bệnh nhân thiếu G6PD Vonledam đã phát hiện 94% hồng cầu hoạt độ G6PD
bằng không và 6% hồng cầu còn lại thì hoạt độ chỉ còn 5% so với bình thờng.
2.5. Chẩn đoán.
- Dịch tễ và tiền sử: trẻ bịcác bbệnh nhiễm trùng,đẻ non ,thiếu thánggia
đình đã có trẻ bị vàng da,hay trong vùng sốt rét,vùng có tỷ lệ thiếu hụt
G6PD,hay sau khi sử dụng một số thuốc và thực phẩm có tính oxy hoá.
- Lâm sàng
- Cận lâm sàng
- Chẩn đoán nguyên nhân:
Cụ thể nh do thiếu hụt G6PD, định lợng G6PD bằng phong pháp quang
phổ hấp thụ, bán định lợng nh phơng pháp Formazan hay test nhanh. Việc định
lợng G6PD ngay khi tan máu, lợng hồng cầu non và lới chiếm khá cao những tế
bào này có hoạt động enzym cao hơn tế bào già. Vì vậy xét nghiệm cần phải đợc
trì hoãn sau đợt tan máu đến khi mức enzym thấp xuống rồi mới xét nghiệm đến
chẩn đoán. Tuy vậy có nghiên cứu cho rằng dù vậy thì G6PD cũng không đạt đ-
ợc tới mức bình thờng.
Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật phân tích gen (phơng pháp PCR) để phát

hiện đợc nguyên nhân và dạng đột biến gen từ đó có hớng tiên lợng và dự
16
phòng. Tuy độ chính xác của kỹ thuật này cao nhng lại tốn kém.
2.6. Điều trị và phòng.
2.6.1 Phòng bệnh: giữ một vai trò quan trọng vì giúp tránh xảy ra triệu chứng
và biến chứng.
+ Với những bệnh nhân đã biết trớc là thiếu hụt G6PD thì cần tránh những thực
phẩm và thuốc có tính chất oxi hóa.
+ Với những bệnh nhân khi có chỉ định dùng những thuốc có tính chất oxi hóa
(primaquiu) aspirin ) cần xét nghiệm en zym G6PD trớc khi dùng.
+ Với bệnh nhân đã xét nghiệm triệu chứng cần phòng biểu hiện biến chứng: xét
nghiệm máu, xét nghiệm nớc tiểu, theo dõi triệu chứng tan máu (đái máu, vàng
da, suy thận và vàng da đa nhân).
2.6.2 Điều trị:
+ Ngừng thuốc
+ Truyền dịch, truyền máu, lợi tiểu. Chú ý không đợc truyền cho bệnh nhân loại
máu thiếu G6PD.
3. Kỹ thuật phát hiện thiếu hụt G6PD
3.1.Các mức độ phát hiện thiếu hụt G6PD:
Ph ơng pháp định tính:
Phơng pháp phát quang (Beutler và Mitchelt-1968), phơng pháp đợc tiến
hành bằng cách lấy máu từ đầu ngón tay sau đó dùng thuốc chống đông. Trộn
đều máu đã chống đông bằng dung dịch đã chuẩn bị sẵn gồm NADP và G6P,
sau đó nhỏ vào giấy Whatman số 1 vào thời điểm 0 phút, 5 và 10 phút. Để khô,
đọc kết quả dới ánh sáng đèn cực tím. Nếu hàm lợng G6PD đủ thì các giọt dung
dịch và máu sẽ phát quang và không phát quang khi không đủ lợng G6PD. Đây
là một phơng pháp đã đợc uỷ ban quốc tế về các tiêu chuẩn trong huyết học đề
nghị sử dụng trong phát hiện sàng lọc các đối tợng thiếu men G6PD. Tuy vậy
phơng pháp này có giá thành cao do cần phải có các thiết bị chuyên dụng nh đèn
chiếu tia tử ngoại [12], ngoài ra phơng pháp này khó phát hiện trờng họp thiếu

men G6PD ở nữ dị hợp tử [6].
17
Phơng pháp nhanh của AkiraHirono-1998: là phơng pháp tiến hành dựa
trên nguyên lý G6P đợc chuyển thành 6GP thông qua sự xúc tác của enzym
G6PD, từ đó tạo ra NADPH là một chất khử tham gia phản ứng chuyển MTT
thành Formazan, chuyển từ màu vàng sang màu xanh thẫm( hình minh hoạ cho
nguyên lý xin xem ở kỹ thuật Formazan).
- Trờng hợp không thiếu G6PD lợng NAPDH tạo ra đủ thì sản phẩm tạo
ra có màu xanh thẫm của Formazan. Đọc kết quả (-)
- Trờng hợp thiếu G6PD thì phản ứng xảy ra không hoàn toàn, sản phẩm
tạo ra có màu xanh nhạt, đọc kết quả (+) : bán thiếu.
- Trờng hợp không có G6PD : phản ứng không xảy ra , sản phẩm tạo ra
chỉ có màu hồng ( màu của Hb ) đọc kết quả (++) ( +++) thiếu hoàn toàn.
Đây là một phơng pháp đọc kết quả ngay sau 30 phút, đọc kết quả bằng
mắt thờng dễ nhận biết vvà không đòi hỏi thiết bị tốn kém. Phơng pháp này đã
đợc các tác giả nh Akira Hirono, Kuni Iwai áp dụng ở một số nứơc Đông Nam
A để điều tra hàng loạt [6]. Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Minh Hùng
độ nhạy của phơng pháp này ở trờng hợp thiếu hoàn toàn là 97,9%, ở trờng hợp
bán thiếu là 61,5%, độ đặc hiệu là 100%.Ta có thể thấy độ nhạy và độ đặc hiệu
tơng đối cao, có thể áp dụng cho test sàng lọc.
Ph ơng pháp định l ợng
Nguyên tắc: Tiến hành chống đông máu sau đó tách hồng cầu rồi tách
enzym G6PD. Xác định hoạt độ G6PD do sự thay đổi phổ hấp thụ tại bớc sóng
340 mm do coenzym NAPDH sinh ra trong quá trình phản ứng. Hoạt độ G6 PD
tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của NADPH.
Sơ đồ minh họa
G6PD
G6P NADP Glucorate 6 P
NADPH H
+

+
+ +
Tính kết quả:

A: độ thay đổi mật độ quang học.
+ Hoạt độ G6PD (UI/ml =

A/phút x 30476.
18
+ Hoạt độ G6PD (UI/10
12
HC) =

A/phút x 30476
Sản lợng hồng cầu trong 1 lít
+ Hoạt độ G6PD UI/gHb =

A/phút x 30476
Nồng độ Hb.
Đọc kết quả
Bình thờng

10 UI/10
12
HC.
Thiếu G6PD nhẹ và trung bình: 40 - 100 UI/10
12
HC.
Thiếu G6PD nặng:

10 UI/10
12
HC.
Ph ơng pháp gen học
Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích đột biến gen, thông thờng phản ứng PCR đ-
ợc thực hiện qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: gây biến tính để tháo xoắn và làm đứt các liên kết Hiđro của
chuỗi xoắn kép AND
Giai đoạn 2: là giai đoạn ủ mồi, ứng với mỗi exon thì có một đoạn mồi
khác nhau.
Giai đoạn 3: là tổng hợp chuỗi đích ADN. Đoạn mồi đợc kéo dài nhờ
enzym nối, từ đó khuyếch đại nên những đoạn khuôn. Dựa trên sản phẩm
khuyếch đại tơng ứng với cặp mồi bình thờng hay đột biến sẽ nhận biết đợc vị
trí đột biến
Đây là một phơng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao cho biết vị trí
đột biến , dạng đột biến, từ đó biết đợc độ thiếu hụt G6PD. Tuy nhiên kỹ thuật
này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại do đó giá thành cao.
19
3.2. Kỹ thuật bán định lợng tạo vòng Formazan.
Cơ sở khoa học
Nguyên tắc nhận định kết quả: sản phẩm Formazan của phản ứng tạo ra
có màu xanh tím. Diện tích và độ đậm của vòng màu sản phẩm sau một thời
gian nhất định tỷ lệ với hoạt tính của enzym trong mẫu thử.
Đọc kết quả: ngoài kích thớc thì màu sắc quan trọng, màu đậm chứng tỏ
hoạt tính enzym trong máu cao, nhạt chứng tỏ hoạt tính enzym trong máu thấp.
Kỹ thuật này không chỉ là định tính mà còn là bán định lơng.
- Đờng kính vòng xanh > 7 mm: (- )
- Đờng kính vòng xanh 5mm - 7mm. Màu xanh nhạt hơn chứng (- ): (+)
- Đờng kính màu xanh 3mm - 5mm

(+ +) rất nhạt màu.
- Đờng kính < 3mm không có màu xanh mà là màu vàng (+++).
20
G6 PD
G6 PD
G6P
(Cơ chất)
G6P
(Cơ chất)
NAD PH
(Dạng khử)
NAD PH
(Dạng khử)
6 - GP
(sản phẩm)
6 - GP
(sản phẩm)
NADP
+
(dạng OXH)
NADP
+
(dạng OXH)
Formazan
(màu xanh)
Formazan
(màu xanh)
MTT
(màu vàng)
MTT

(màu vàng)
PMS
PMS
Chơng 2
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
1. Đối tợng
- Ngời Tày: 130 ngời
- Ngời Nùng: 71 ngời
Tất cả các đối tợng trên là sinh viên trờng trung học Y tế Cao Bằng, đã đợc
điều tra chính xác là có 3 đời là ngời dân tộc Tày (hoặc Nùng), trong đó có 162
nữ và 39 nam. Sở dĩ số lợng nam ít hơn nữ là do đề tài của tôi đợc tiến hành trên
cơ sở cộng tác với đề tài Lu giữ DNA ngời do giáo s Vũ Triệu An làm chủ
nhiệm nên không có điều kiện chọn mẫu thích hợp.
- Thời gian lấy mẫu: Tháng 5 năm 2004.
- Địa điểm lấy mẫu: Trờng trung học Y tế Cao Bằng.
2. Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang
2.1. Các bớc tiến hành
Thu thập mẫu: lấy máu tĩnh mạch ở đối tợng nghiên cứu thấm vào giấy
Whatman số 3 là loại giấy dầy có thể lấy đủ lợng hồng cầu cần thiết. Để giấy
thấm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng lu trữ dới 7 ngày để làm xét nghiệm (tốt
nhất là giữ lạnh ở 4
o
C)
Bảo quản máu khô: ở -30
o
C, đây là điều kiện kỹ thuật đảm bảo để Protêin
không bị biến tính đối với trờng họp không làm dợc xet nghiệm ngay.
Tiến hành làm Formazan
Thu thập và xử lý số liệu
2.2 Kỹ thuật tạo vòng Formazan :

2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ:
Cho lấy mẫu :
- Giấy Whatman số 3, có đánh dấu các vòng tròn đờng kính 1cm
- Xilanh lấy máu tĩnh mạch , bông cồn sát trùng.
21
Cho xét nghiệm:
- Dụng cụ: cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, đũa khuấy, bình định mức, khay
nhựa có kích thớc 12,5 x 8,5 x 1cm đã xác định 40 vị trí (8 chiều ngang và 5
chiều dọc) các vị trí này cách đều nhau.
- Trang thiết bị :
Cân phân tích Sartorinol sai số 0,01 mg
Tủ ấm 37
o
C
Bể ổn nhiệt giữ ở nhiệt độ 55
o
C
Lò vi sóng (Samsung)
Máy đo pH
Kìm bấm mẫu
Hóa chất: sử dụng hóa chất của hãng
G6P - : Glucose -6- Phosphat
MTT : chất có màu vàng tơi
PMS : phenazin Methosulfat
MgCl2
NADP
Thạch Agar
Mẫu (- ) (mẫu đủ): lấy máu của ngời bình thờng, là ngời không sống
trong vùng dịch tễ, ngời đã đợc xét nghiệm định lợng G6PD ít nhất 2 lần (
100 UI / 10

12
hồng cầu)
mẫu ( +) (mẫu thiếu): là mẫu máu lấy ở những ngời đã đợc xác định là
thiếu hoàn toàn G6PD ( 40 UI / 10
12
hồng cầu )
2.2.2 Quy trình Formazan:
- Chuẩn bị Gel:
Pha đệm Tris - HCl 0,1 M - pH = 6,5 có chứa MgCl2 0,01M (Mg là ion cần
thiết cho sự gắn enzym và cơ chất, theo Phạm Thị Lý)
Ví dụ: ứng 150ml dung dịch cần 1,425 g MgCl
2
sau đó chia dung dịch
đệm làm 4 phần, 1 phần để vào cốc pha với hóa chất, 3 phần còn lại cho vào lọ
22
pha với Agar. Cho Agar vào lọ lắc đều, đun cho tan trong lò vi sóng, để nguội
đến 55
o
C trong bể ổn nhiệt
- Lần lợt cân các hóa chất sau vào cốc:
+ Theo nồng độ ứng với kỹ thuật ở bộ môn Miễn dịch sinh lý bệnh trờng Đại
học Y :
G6P: 0,625 mg/ml
NADP : 0,125 mg/ml
MTT: 0.125 mg/ml
PMS : 0,125 mg/ml
+ Theo nồng độ ứng với kỹ thuật của Viện Sốt Rét : gấp 2 lần so với kỹ thuật
trên
G6P: 1.25 mg/ml
NADP : 0,25 mg/ml

MTT: 0.25 mg/ml
PMS : 0,25 mg/ml
Ví dụ : pha trong 150ml dung dịch, kĩ thuật bộ môn Miễn dịch sinh lý
bệnh trờng Đại học Y cần: 93,75 mg G6P; 18,75 mg NADP; 18,75 mg MTT;
18,75 mg PMS.
- Lắc đều hồng cầu dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan rồi đun nóng tới 55
o
C
- Trộn đều 2 dung dịch trong lọ và cốc tạo thành 1 hỗn hợp gel để trong bể
ổn nhiệt 55
o
C lắc đều
- Đổ hỗn hợp gel trên vào khay nhựa với luợng gel 30ml / 1khay
- Đổ nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí
- Đặt khuôn nhựa trên mặt phẳng, chú ý chọn khuôn nhựa phẳng không bị
cong vênh để đọc kết quả chính xác , gel dàn đều
- Sau khi đổ xong đặt lên khay nhựa 1 tấm kính phẳng bọc giấy để tránh
ánh sáng ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, gel sẽ đông.
23
Ví dụ: ứng 150ml hỗn hợp gel đổ đợc 5 khay. 1 khay gel đạt tiêu chuẩn bề
dày gel đạt 3 mm, có màu vàng nhạt trong suốt, không có bọt khí, mặt gel
phẳng.
- Đặt mẫu:
- Đặt khay gel chồng lên thớc đo định vị, đồng thời đánh dấu vị trí sẽ đặt
chứng (+) và chứng (-)
- Dùng kìm bấm các mẫu máu đã thấm giấy Whatman tạo thành các vòng
tròn đờng kính 3mm.
- Đặt mẫu lên 3 mặt gel: ứng với 40 vị trí có 1 chứng (-), 1 chứng (+), 38
mẫu máu. Chú ý đặt mặt trên của mẫu giấy thấm tiếp xúc với mặt gel , dùng
Pince gắp các mẫu giấy đặt nhẹ nhàng ấn đều cho mẫu máu dính chặt vào gel,

tránh vỡ mặt gel
- Bọc khay gel đã tra mẫu bằng giấy nến (tránh khô mẫu máu) ủ trong tủ
ấm ở nhiệt độ 37
o
C trong 8 giờ, 24 giờ
- Đọc kết quả :
- Mẫu đủ lợng G6PD đọc là xét nghiệm (-) sẽ có phản ứng tạo vòng
Formazan mầu xanh thẫm, đờng kính vòng dung huyết rộng > 7mm
- Mẫu thiếu nhẹ đọc là xét nghiệm (+): phản ứng xảy ra không hoàn toàn,
vòng dung huyết có màu xanh đậm, đờng kính 5-7mm.
- Mẫu thiếu vừa đọc là xét nghiệm (++) phản ứng xảy ra không hoàn
toàn, vòng dung huyết màu xanh nhạt, đờng kính nhỏ hơn 5mm.
- Mẫu thiếu nặng đọc là xét nghiệm(+++): phản ứng không xảy ra, vòng
dung huyết mầu vàng nhạt hoặc hồng nhạt là mầu của bản gel hoặc màu của
Hemoglobin.

24
CHƯƠNG 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Khi đọc kết quả phản ứng tạo vòng Formazan căn cứ vào các tiêu
chuẩn sau:
3.1.1. Màu sắc của vòng dung huyết:
vòng dung huyết có màu xanh đậm của Formazan chứng tỏ cơ chất tham gia
phản ứng đã phản ứng hết .nghĩa là hoạt độ của enzym là bình thờng.Vòng dung
huyết có màu xan nhạt hơn là hoạt độ của enzym giảm nhẹ, trờng hợp thiếu
hoàn toàn thì vòng dung huyết sẽ có màu của môi tròng thạch Agar hay màu
của Hemoglobin, màu vàng nhạt hay màu đỏ nâu nhạt.
3.2.2. Kích th ớc của vòng dung huyết xanh:
- Lớn hơn 7 mm đợc đánh giá là (-): bình thòng
- Từ 5 mm đến 7 mm đợc đánh giá là(+): bán thiếu
- Từ 3mm đến 5mm đợc đánh giá là (++): bán thiếu

- Nhỏ hơn 3mm đợc đánh giá là (+++): thiếu hoàn toàn.
3.2. Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan
Chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện của phản ứng Formazan với
95 mẫu thử, là những mẫu đợc chọn ngẫu nhiên trong tổng số đối tợng nghiên
cứu trên. Những điều kiện của phản ứng Formazan là thời gian diễn ra phản ứng,
nhiệt độ tiến hành của phản ứng và nồng độ cơ chất tham gia phản ứng:
- Thời gian: 8 giờ, 12 giờ, 24 giờ.
- Nhiệt độ: 25
0-
C ( nhiệt độ phòng), 37
0-
C (nhiệt độ sinh lý của cơ thể).
- Nồng độ cơ chất: tiến hành với hai nồng độ ở khoa sinh lý bệnh trờng Đại
học Y và ở Viện Ký sinh trùng sốt rét. Nồng độ ở Viện Ký sinh trùng sốt rét gấp
đôi ở Đại học Y ( xin xem phần đối tợng và phơng pháp nhiên cứu).
25